Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrking og bruk av roterende Wall Vessel bioreaktor Avledet 3D Epiteliale Cellemodeller

Published: April 3, 2012 doi: 10.3791/3868
Automatic Translation
1, 1
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

Summary

En roterende cellekultur system som gjør at epitelceller til å vokse under fysiologiske forhold som resulterer i 3-D mobilnettet aggregatdannelse er beskrevet. Aggregatene generert skjerm

Abstract

Celler og vev i kroppen opplevelse miljøforhold som påvirker deres arkitektur, intercellulær kommunikasjon, og overordnede funksjoner. For in vitro cellekultur modeller å nøyaktig etterligne vev av interesse, er veksten miljø av kulturen en kritisk aspekt å vurdere. Vanlig brukte konvensjonelle cellekultur-systemer forplante epitelceller på flate todimensjonale (2D) diffusjonstett overflate. Selv om mye har blitt lært fra konvensjonelle cellekultur-systemer, mange funnene er ikke reproduserbare i kliniske studier eller vev explants, potensielt som et resultat av mangel på en fysiologisk relevant mikromiljøet.

Her beskriver vi en kultur som overvinner mange av kultur tilstand grensene av 2-D cellekulturer, ved hjelp av innovative roterende vegg fartøy (RWV) bioreaktor teknologi. Vi og andre har vist at organotypic RWV-deriverte modeller kan rekapitulere Struktureringe, funksjon, og autentiske menneskelige reaksjoner på eksterne stimuli på samme måte som mennesker eksplantering vev 1-6. Den RWV bioreaktor er en suspensjon kultur system som gjør det mulig for vekst av epitelceller under lave fysiologiske væske skjær forhold. De bioreaktorer kommer i to forskjellige formater, en høy-aspekt roterende fartøy (Harv) eller en langsom-vri lateral fartøy (STLV), der de skiller seg ved sin lufting kilde. Epitelceller legges til bioreaktor av valget i kombinasjon med porøs, kollagen-belagte microcarrier perler (Figur 1a). Cellene utnytte perler som en vekst stillas under konstant fritt fall i bioreaktor (Figur 1B). Mikromiljøet levert av bioreaktor som gjør at cellene danne tredimensjonale (3-D) tilslag viser in vivo-lignende egenskaper ofte ikke observert under standard 2-D kultur forhold (figur 1D). Disse egenskapene inkluderer trange veikryss Münchenoss produksjon, apikal / basal orientering, in vivo protein lokalisering, og ytterligere epiteliale celle-type spesifikke egenskaper.

Progresjonen fra en monolayer av epitelceller til en fullt differensiert 3-D samlet varierer basert på celle type 1, 7-13. Periodisk prøvetaking fra bioreaktor tillater overvåking av epitel aggregatdannelse, cellulær differensiering markører og levedyktighet (figur 1D). Når cellulær differensiering og samlet formasjon er etablert, blir cellene høstet fra bioreaktor, og liknende analyser utført på 2-D cellene kan brukes til 3-D tilslag med noen betraktninger (figur 1E-G). I dette arbeidet, beskriver vi en detaljert fremgangsmåte på hvordan du kultur 3-D epiteliale celler tilslag i RWV bioreaktor systemet og en rekke potensielle analyser og analyser som kan utføres med 3-D aggregater. Disse analysene omfatter, men er ikke begrenset til, strukturelle / morphological analyse (confocal, scanning og transmisjon elektron mikroskopi), cytokin / chemokine sekresjon og cellesignalisering (cytometric perle rekke og Western blot analyse), genekspresjonsanalyse (real-time PCR), toksikologiske / narkotika analyse og host-patogen interaksjoner. Utnyttelsen av disse prøvene dannet grunnlaget for mer grundige og omfattende studier som metabolomics og transcriptomics, proteomikk og andre array-baserte applikasjoner. Vårt mål er å presentere en ikke-konvensjonelle hjelp av dyrking menneskelige epiteliale celler til å produsere organotypic 3-D modeller som rekapitulere den menneskelige in vivo vev, i en lettvinte og robust system som skal brukes av forskere med ulike vitenskapelige interesser.

Protocol

Alle trinn skal utføres i henhold til BSL-2 forhold i en laminær hette.

1. Klargjøre STLV bioreaktor

  1. Monter STLV bioreaktor henhold til produsentens protokoll og utfører avgiftning protokollen for å sikre sterilitet bioreaktor. Dekk åpne porter med Luer caps og fyll STLV med 95% etanol i 24 timer.
  2. Fjern etanol og fyll STLV med sterilisert destillert vann i 24 timer.
  3. Gjenta trinn 1,2 med sterilisert destillert vann.
  4. Med verktøyet levert av leverandøren, løsne alle skruer, caps og sentrum pluggen fra STLV og autoklav ved 110 ° C i 20 min i en sterilisering posen.
  5. Når STLV kjøles, stram skruene og gjenta trinn 1.1-1.4 å sikre sterilitet og komplett avgiftning.
  6. Stram skruene i avkjølt STLV og skru på pre-steriliseres enveis stoppekraner til hver port.
  7. Åpen stoppekran ved å plassere knottene vertikalt.
  8. Fjern stempler fra en 10 ml og 5 ml luer-lock sprøyte og re-sleeve stempler tilbake i wrappers å opprettholde sterilitet. Skru sprøyter inn på stoppekraner (luer-lock spissen sprøyter er nødvendig for dette trinnet).
  9. Legg Dulbecco sin Fosfat-saltløsning (DPBS) til 10 ml sprøyte til STLV er full og begynner å fylle 5 ml sprøyte.
  10. Bytt sterile stempler i hver sprøyte og fjerne rester av bobler som forekommer i bioreaktor ved å veksle mellom å kjøre stempler av sprøyter.
  11. La sprøyter festet til bioreaktor etter fjerning alle bobler. Lukk stoppekraner og fest STLV til den roterende vertikal plattform og roter i minimum 24 timer for å overvåke for lekkasjer.

2. Forbereder Microcarrier perler

  1. Tilsett 15 ml DPBS i ~ 250 mg cytodex microcarrier perler i en 50 ml konisk rør og autoklav under samme vilkår som STLV (1,4).
  2. Etter avkjøling fjerne DPBS, legge mediet som brukes til å vokse epithelial celle av interesse, og swirl rør til resuspender perler.
  3. Gjenta vaske trinn med media to ganger. Etter endelig vask Tilsett 15 ml vekstmedier til perler.

3. Seeding Epitelceller og perler i STLV bioreaktor

  1. Grow epitelceller av interesse som monolayers i vevskulturstudier kolber til du får eller lik 1x10 7 celler. Fjern celler fra kolben (dvs. trypinsization, EDTA), telle celler å etablere mobilnettet konsentrasjon, og bestemme cellulær levedyktighet ved trypan blå eksklusjon farging ett.
  2. Til konisk tube som inneholder preparerte perler (se 2.3), tilsett ønsket konsentrasjon av celler (2x10 5-1x10 7 epitelceller) 2, 8, avhengig av epitelial celle type intensjonsavtale (figur 1A). Sikre at alle cellene er overføres ved å skylle den koniske røret.
  3. Fjern DPBS og sprøyter fra STLV.
  4. Fjern pluggen fra sentrum port og legge til epiteliale cell / perle oppheng i STLV bruke 10 mL serologisk pipette. Skyll konisk tube for å sikre at alle celler / perler overføres til STLV og erstatte sentrum port plugg.
  5. Fjern stempler fra et 5 og 10 ml sprøyter og re-sleeve stempler tilbake i wrappers å opprettholde sterilitet. Skru sprøyter inn i havner med åpne stoppekraner. Fyll STLV med media, erstatte stempler, og nære stoppekraner.
  6. Plasser nylig seedet STLV i en 37 ° C inkubator i 30 min uten rotasjon.
  7. Åpne stoppekraner, fjerne bobler med stempler, og lukk deretter stoppekraner.
  8. Plasser STLV i en 37 ° C, 5% CO 2 fuktet inkubator roterende ved 20 rpm (Figur 1B). Kulturer må roteres kontinuerlig 24 hektar dag bortsett fra ved prøvetaking, garderober media eller høsting aggregater (se neste avsnitt).

4. Dyrkning, Sampling, og fotodokumentasjon av kulturer

  1. Etter en innledende 96-120 h av dyrking celler i bioreactor, endre media ved å vippe STLV og tillate celler / perler å bosette. Fjern sprøyter, åpne begge stoppekraner, og hell av ~ 75% av media fra side port (figur 1C). Basert på cellenes stoffskifte av media, endrer media hver dag eller annenhver dag etter første seeding og 96-120 h kultur perioden.
  2. Skru på 5 og 10 ml sprøyter blottet for stempler og følg refeeding protokoll som beskrevet ovenfor (01.07 til 01.11), deretter skru lukket STLV tilbake på plass på roterende plattform.
  3. Overvåk vekst og levedyktighet av tilslag hver 5-7 dager etter såing i STLV ved forsiktig å fjerne en liten mengde aggregater (~ 200 mL) fra sentrum port inn to 1,5 ml rør. For å unngå samlet klipping, for alle samlede overføringer bruke en 1000 mL pipette tips som har blitt kuttet ~ 2 cm fra punktet og sterilisert.
  4. Bytt senter plugg, utveksling med nye sprøyter, legge ferske media til STLV som beskrevet ovenfor (01.07 til 01.11), og plasser STLV tilbake iinkubator med rotasjon (se 3.8).
  5. For overvåking mobilnettet levedyktighet, bruker du en av de to 1,5 ml rør tilslag alikvoteres i trinn 4.3, og fjerne celler fra perler på samme måte epitelceller er fjernet fra vevskulturstudier kolber (dvs. trypsinization). Overvåk levedyktighet ved trypan blå eksklusjon flekker en.
  6. For bildebehandling mobilnettet tilslag, legge 0,5 til 1 ml av media til den andre 1,5 ml samlet delmengde og overføring til en liten petriskål med en cut-off 1000 mL pipette tips. Bilde aggregater med en invertert lys mikroskop (figur 1D).

5. Overføre og Høsting Tilslag

  1. For noen epiteliale celle modeller er det nødvendig å overføre tilslag til en disponibel Harv å øke kultur lufting to. Omtrent en uke før høsting tilslag for analyse, fjerne sprøyter og stoppekraner fra STLV og hell av ~ 50% av media fra side port.
  2. Remove den STLV sentrum plugg og tøm forsiktig alt innholdet i en 50 ml konisk tube fra sentrale porten (figur 1E). Skyll STLV to ganger med 5 ml media og kombinere skyll med resten av aggregater.
  3. Fortsett med å overføre tilslag som beskrevet i 5.2, men overføring tilslag fra 50 ml konisk rør til Harv.
  4. Nøye harvest aggregater fra Harv etter ~ 1 uke eller fra STLV (basert på celle type) som ble utført ovenfor (5.2). Se nedenfor for potensielle analyseverdier formater, analyser og analyser etter samlet innhøsting.

6. Potensiell Analysis, programmer og analyser utført med Tilslag

  1. Seeder tilslag for ulike eksperimentelle formater. Overføring ønsket mengde aggregater fra 50 ml konisk rør til et 1,5 ml tube, 24 bra plate, eller plate med 96 brønner ved hjelp av en sterilisert cut-off 1000 mL pipette (figur 1F).
  2. Vasking og forberedeIng tilslag for analyse. Fjern media etter aggregater har avgjort. Tilsett DPBS direkte til sentrum av røret eller vel så alle aggregatene er rørt opp. Når tilslag har avgjort til bunn, fjerne DPBS og gjenta så mange ganger som nødvendig.
  3. Frakt tilslag for off-site eksperimentering og analyse. Legg ønsket mengde tilslag til en 50 ml tube og vask tilslag som i 6.2. Fyll 50 ml tube med media, cap, og Parafilm rundt hetten for å unngå lekkasje. Trygt sende tilslag til ønsket sted over natten i romtemperatur.
  4. Fixing tilslag for elektronmikroskopi (figur 2). Scanning, overføring eller immun-elektronmikroskopi kan bli utført ved overføring 150-300 mL tilslag til et 1,5 ml tube og vask tilslag 3 ganger med DPBS (6,2). Tilsett 200 mL av program-spesifikke (SEM, TEM, immun-EM, etc.) elektron mikroskopi fiksativ for ønsket inkubasjonstid. Fjern fikse, vaske aggregates 2 ganger med DPBS, og fortsetter som beskrevet i Hjelm et al. 2010 for scanning og transmisjon elektronmikroskopi to.
  5. Immunfluorescens mikroskopi imaging (figur 3). Transfer ~ 100 mL tilslag til et 1,5 ml tube og vask tilslag (6,2). Fiks og label tilslag med antistoff under lignende forhold som med monolayers, unntatt i en 1,5 ml rør. Å montere, plassere en dråpe montering media på objektglass, overføre merket tilslag på toppen av montering media med en cut-off 1000 mL pipette, sted dekkglass løpet tilslag, sel dekkglass med neglelakk, og tørr lysbilde natten to.
  6. Måling mobilnettet levedyktighet / spredning ved hjelp av MTT-analysen (figur 4). Overfør tilslag til en 24 godt plate og erstatte medier med 625 mL fenol røde frie medier. Legg 62,5 mL av 5 mg / ml Thiazolyl Blå Tetrazolium Bromide (MTT) til hver brønn og inkuberes i 4 t ved 37 ° C. Legg 625 mL av 100 mg / ml SDS-0.01M HCl til hver brønn og inkuber natten. Les absorbans ved 570 nm og få% celleviabilitet ved hjelp av ligning:

Formel 1

  1. Toksikologistudier. Overføring tilslag til 24 godt plate og utføre trypan blå uttrekk på ≥ 2 brønner for første celleviabilitet / konsentrasjon. Legg testen sammensatte på alt konsentrasjoner å duplisere brønner. For celleviabilitet (Figur 5A), vaske aggregater og utføre trypan blå utelukkelse etter behandling. For TC 50 (figur 5B), ta mobilnettet levedyktigheten av dupliserte brønner for hver konsentrasjon over tid og bruk Reed Muench metode for å bestemme giftig konsentrasjon 50% 2, 15.
  2. Cytometric perle array (CBA) eller ELISA. Cellular supernatants kan tas etter såing celler i alle eksperimentelle format diagrammed. Stimulere seeded tilslag som med celler dyrkes sommonolayers, samle supernatants (≥ 120 mL), og oppbevares ved -80 ° C til analyse ved ELISA eller CBA (figur 6).
  3. RNA-analyse. Overfør ≥ 500 mL av tilslag til 1,5 ml tube og vask tilslag med DPBS. Fortsett utvinning ved hjelp av Qiagen RNAeasy kit og protokoll for dyreceller med homogenisering av lysate bruke 20-kanyle. Sørg for å la perlene bosette i bunnen av røret, før overføring supernatanten, og IKKE overføre tomme perler til spin kolonnen (perler vil tette kolonne membran som resulterer i lav RNA yield) (figur 7).
  4. Protein analyse. Harvests aggregater under samme metodene som med monolayers ved hjelp av en 1,5 mL tube eller større eksperimentelle format. Men etter lysis av aggregatene, la perlene til å bosette og overføre lysate til et eget rør før du kjører en protein gel eller annen form for protein analyse (Figur 8).
  5. Infeksjonstudier. Seed aggregater i ønskede eksperimentell format. Bruk minst to brønner / samples for trypsinizing celler fra perler til å nummerere celle nummer og kvantifisere celleviabilitet. Infisere aggregater med patogen av interesse på utvalgte mangfold av infeksjon som utføres med celler dyrket som monolayers (figur 9). Vask trinnene må utføres som i 6.2.
  6. Flowcytometri: Seed tilslag i 50 ml tube, vaske tilslag (6.2), og legg til 2mm EDTA for 5-10 min ved 37 ° C. Legg 5-10 ml media til celler og passere cellene gjennom en celle sil. Delmengde 1x10 6 celler i en polypropylen rør og vaske cellene i kaldt blokkerer løsning (1% FBS i PBS). Resuspender celler med antistoff og inkuber ifølge produsenten. Vask cellene ved sentrifugering Resuspender i PBS, og overføre celler å filtrere tube for analyse (Figur 10).

7. Representative Resultater

Et eksempel påen differensiert menneskelig epitelial samlet dyrket i STLV bioreaktor systemet kan sees i figur 2. SEM og TEM bilder er hentet fra menneskelige vaginale celler dyrket i STLV for 39 dager, hvor microridges og invaginations, intracellulær sekretoriske vesikler og microvilli på apikale overflaten kan observeres. Videre demonstrasjon av in vivo-lignende egenskaper ved epiteliale celler dyrket i bioreaktor kan observeres ved confocal immunfluorescens mikroskopi bilder (figur 3) av 3-D vaginale celler uttrykker mucin (MUC1) og markører spesifikke for epitelceller (ESA) og terminal differensiering (Involucrin, INV).

Som vist, 3-D tilslag vise ultrastructural funksjoner som ligner på vev, men deres mer fysiologisk relevante fenotyper også fungere som en utmerket plattform for å vurdere toksisitet av forbindelser. Den MTT analysen, en vanlig analyse for å måle celleviabilitet, metabolisme eller proliferasjon, kan brukes til å måle toksisitet til ulike kjemikalier og forbindelser (figur 4). Triton X-100, et vaskemiddel som ødelegger cellemembraner, ble brukt som en positiv kontroll for å validere MTT analysen. En ytterligere metode for å måle toksisitet etter behandling med test forbindelser er trypan blå utelukkelse (figur 5). Etter behandling med nonoxynol-9 (N-9), demonstrerte vaginal aggregatene en toksisitet respons lik som cervikale eksplantering modeller, men en annen profil enn to monolayers, 16.

Ytterligere studier som viser evne til epitelceller, dyrket i bioreaktor, til å fungere og signalisere samme måte vev in vivo, kan observeres i figur 6. Ved stimulering med molekyler avledet fra mikrober som er anerkjent av Toll-lignende reseptorer (TLR), aggregatene svare og utsondrer proinflammatoriske cytokiner, blant annet IL-6 1.Uttrykk av progesteron reseptor (PR), en reseptor som reagerer på hormon stimulering, kan også observeres i de vaginale celler både på RNA og protein nivå (Figur 7 og Figur 8, henholdsvis). De 3-D tilslag ikke bare har evnen til å svare på patogen og hormon molekyler, men er også i stand til å funksjonelt støtte en herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infeksjon. En konfokalmikroskopi bilde av HSV-2 smittede 3-D vaginale tilslag (Figur 9) viser infeksjon. Parallelle 2-D vaginale epitelceller cellekulturer blir ikke vist som en følge av alvorlig cellulær ødeleggelse forårsaket av HSV-2 infeksjon. RWV-avledet 3-D aggregater har også blitt brukt til å kvantifisere bakteriell og viral replikasjon gjennom intracellulære vekstkurver og plakk analyser, henholdsvis 8, 9. Til slutt kan de fysiske og funksjonelle egenskapene til de enkelte cellene i aggregatene også bli kvantifisert ved flowcytometri. For example, brukte vi en flowcytometri analyse for å måle MUC1 overflate uttrykk på enkelte vaginale celler (Figur 10). Vaginal 3-D tilslag uttrykt en lavere prosentandel av MUC1 (27,7%) sammenlignet med monolayers (67,2%). Den lavere andel av MUC1 på 3-D tilslag overflate i forhold til monolayers kan være et resultat av flertallet av MUC1 dumpes fra cellene som er observert i vaginal 17 tarmkanalen, 18.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk for dyrking humane epitelceller i RWV og potensielle programmer som bruker RWV-deriverte aggregater. A) Epitelceller er i utgangspunktet dyrkes som monolayers i en vev kultur kolbe. Når konfluent, blir cellene fjernes fra flaska og kombinert med microcarrier perler i STLV bioreaktor. Scale bar:. 80 mikrometer B) Den STLV roterer på en plattform for å skape en konstant fritt fall miljøet av lav fluid skjær, slik at cellene til å feste seg og vokse på perler og dermed danner synlige mobilnettet aggregater. C) Etter 96 h, media i STLV må endres for å imøtekomme for cellenes stoffskifte. Mediene er strømmet ut av en side port, blir friske media erstattes gjennom en vedlagt 10 ml sprøyte (stempelet fjernet), og sprøyte stempler byttes og brukes til å extrude bobler. D) Etter ~ 5 dager (d) aggregatene begynner å danne . Aggregatene er prøvetatt hver 7. dag og avbildes ved lysmikroskopi å overvåke sine utviklingsmål progresjon (20x forstørrelse av 3-D humane epitelceller vaginale celler). E) Når du er ferdig aggregatdannelse og cellulær differensiering har skjedd, er tilslag høstet fra bioreaktor og overført til en 50 ml konisk tube. F) Pukk kan bli seedet inn i en 1,5 ml rør eller en multi-brønn plate format til å utføre eksperimentelle analyser og analyser. G) Omriss av pote ntial analyser og analyser som kan skje på aggregater. Denne representativ liste over analyser er ikke ment å være en uttømmende katalog over alle mulige nedstrøms applikasjoner.

Figur 2
Figur 2. Undersøke morfologiske og strukturelle kjennetegn ved 3-D epiteliale celler tilslag med elektronmikroskopi. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde av en 3-D human epitelial vaginal celle aggregat. Skala barer: 200 mikrometer (100x), 100 mikrometer (200x), 50 mikrometer (500x). Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilde av en 3-D human epitelial vaginal celle tilslag med piler som peker til (B) intracellulære sekretoriske vesikler og microvilli eller (c) "cytoplasmatiske prosesser". Skala barer: 2 mikrometer (modifisert fra Hjelm et al 2010.) 2.

g3.jpg "/>
Figur 3. Confocal immunfluorescens mikroskopi brukes til å identifisere junctional differensiering og protein markører i 3-D epitelial celle aggregater. Menneskelige 3-D vaginale celler høstet fra bioreaktor etter 32 dager, faste, og beiset med (A) mucin antistoff MUC1, (B) antistoff spesifikt for epitelceller, ESA, eller (C) anti-Involucrin (INV) antistoff som gjenkjenner terminalt differensiert epitelceller. Pukk ble indirekte merket med Alexa 488 sekundært antistoff (grønn). Scale bar: 60 mikrometer (modifisert fra Hjelm et al 2010.) 2.

Figur 4
Figur 4. MTT analysen brukes til å måle mobilnettet levedyktighet. Menneskelige 3-D vaginale tilslag ble seedet i en 24 brønn plate og behandles med media alene (ubehandlet) eller 0,01%, 0,1% eller 1,0% Triton X-100 vaskemiddel i 1 time ved 37 ° C. Followin g behandling, media ble fjernet, og MTT analysen ble utført for å måle mobilnettet levedyktighet. ** Representerer p <0,001; ensidige Student t-test sammenligne Triton X-100 behandlede celler til ubehandlet kontroll.

Figur 5
Figur 5. Bruker 3-D epiteliale celle tilslag til skjermen sammensatte toksisitet. (A) Nonoxynol-9 (N-9) doseavhengig levedyktighet kurve 24 timer etter behandling av 3-D menneskelige vaginal epitelial celle modell (rød linje / barer) sammenlignet med samme celletype vokst som konfluent monolayers (svart linje / barer). (B) N-9 TC 50 nivåer av vaginale epitelceller cellekulturer i (A) på 1,5 t, 4 t, 8 t, og 24 timer etter behandling. * Representerer p <0.05; ensidige Student t-test sammenligne monolayers til 3-D celler på hver eksponeringstid. (Modifisert fra Hjelm et al. 2010) 2.

/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
Figur 6. Analyse av cytokin produksjon i 3-D epitelceller i respons til Toll-like receptor (TLR) agonist stimulering. Tre-D humane vaginale celler ble stimulert med FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , og CL097 (TLR7 / 8) i 24 timer og skilles cytokiner ble målt ved cytometric perle array. IL-6 er vist som en representant proinflammatoriske cytokin som produseres og måles. * Representerer p <0.05; ensidige Student t-test sammenligne stimulert prøver å PBS gruppe. (Modifisert fra Hjelm et al. 2010) 2.

Figur 7
Figur 7. Overvåking genuttrykk i 3-D epitelceller. Semikvantitativ RT-PCR analyse av progesteron reseptor (PR) uttrykk i monolayer (ML) eller 3-D humane vaginale epitelceller. GAPDH vises som en lasting kontroll. Forsterkning produktervist er et resultat av karakterutskrift uttrykk oppstår etter 30 PCR-sykluser. Arrow leder peker på PR-band bare forekommer i 3-D prøve.

Figur 8
Figur 8. Protein uttrykk analyse av 3-D epitelceller. Western blot analyse av monolayer og 3-D humane vaginale epitelceller celle helcelle lysates (30μg) probed med en anti-progesteron reseptor (PR) antistoff. β-tubulin ble brukt som en sonde for lasting kontroll.

Figur 9
Figur 9. Tre-D human epitelial celle modellen støtter en produktiv virusinfeksjon. Confocal immunfluorescens mikroskopi bilde av 3-D menneskelige vaginal epitelial celle samlet infisert med HSV-2. Celler ble infisert med en MOI på 1,0 i to timer, vasket, fast 24 timer etter infeksjon (4% PFA), og farget med en HSV-2 spesifikk VP5 capsid antistoff (grønn) og den kjernefysiske flekken DAPI (blå). Scale bar: 50 mikrometer.

Figur 10
Figur 10. Individuell celle analyse i 3-D human epitelial celle modell av flowcytometri. (A) Monolayer eller (B) 3-D menneskelige vaginale epitelceller tilslag var skilt med EDTA, merket med en FITC konjugert MUC1 antistoff (blå), en isotype kontroll (grønn), eller PBS (rød), og FITC uttrykk ble kvantifisert ved flowcytometri. Tallene representerer prosentandelen av celler som farget positivt for mucin antistoff som gjensto etter at gating ut bakgrunnsfluorescens fra isotype kontroll fargede celler. Ikke-uniform toppene er et resultat av de mange glycosolation mønstre og varierende grad av MUC1 på overflaten av disse cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utnyttelse av RWV bioreaktor teknologien som presenteres her kan gi forskere med evne til å fremme sin nåværende cellekultur system til et mer fysiologisk relevant organotypic cellekultur modell. Den RWV bioreaktor cellekultur system gir en lav skjær mikromiljøet som gjør at celler til å danne 3D-mobilnettet tilslag med in vivo-lignende egenskaper, herunder trange veikryss mucin produksjon, ekstracellulære prosesser (dvs. microvilli) og mobilnettet polaritet. Flertallet av data og eksempler som presenteres her bruker vaginale epitelceller dyrket i RWV systemet, men RWV systemet har også blitt brukt til kultur andre epiteliale celletyper, inkludert tynntarmen og tykktarmen, lunge, blære, lever, og mandel epitelceller å danne 3-D organotypic modellene 1, 7-13, 18. I tillegg har dette systemet blitt brukt til kultur celletyper enn epitelceller, og for tiden utvikling av komplekse, multicellular organotypic kultur modeller er 2 gang, 18 år.

Protokollene er skissert her er ment å tjene som en veiledning, og må kanskje endres basert på cellen type interesse. De vanligste endringer av protokollen for dyrking epitelceller i RWV systemet omfatter lenge cellene dyrkes i STLV, beslutning og timingen av samlet overføring fra STLV til Harv, og cellen / perle ratio for den første seeding i STLV. En mer spesialisert modifikasjon som kan bli vurdert for vellykket aggregatdannelse er egenskapene til microcarrier perle eller stillas, som for eksempel areal, diameter, form, overflatebelegg, tetthet, kostnad, kjernemateriale, og porøsitet. I tillegg kan justeringer basen kultur medium, formulering, eller kosttilskudd, være nødvendig for å optimalisere kultur forholdene og maksimere samlet formasjon. Justeringer kan også gjøres til bioreaktor systemet og dets komponenter, icluding størrelsen bioreaktor fartøy og rotasjonshastigheten. For en forbedret vurdering av mikromiljøet i bioreaktor, er en perfused kultur system også tilgjengelig som tillater kontinuerlig overvåking av pH, oksygen og glukose nivå innenfor kultur fartøyet sikre en fruktbar miljø for samlet formasjon. Den potensielt lang tid å optimalisere kultur forhold, samlet formasjon, cellulær differensiering og å karakterisere hver nye modell system, samt den første bekostning av bioreaktor systemet, er nevneverdige ulemper dette systemet. Imidlertid vil enhver ny kultur implementert i et laboratorium har lignende ulemper.

Vi og andre har vist at RWV-deriverte modeller som benytter humane celler kan være et verdifullt verktøy for å forutsi effekten, toksisitet og farmakokinetikk for vaksiner, microbicides og biologiske og legemidler på en måte som er relevant for mennesker 1, 2, 18. Med suksessen ther bioreaktor kultur system for å produsere autentiske menneskelige reaksjoner, kombinert med sin fleksibilitet, er anvendelser av RWV bioreaktor systemet nå utvidet til slike felt som tumor modellering, regenerativ medisin, og tissue engineering 2, 18-23. For å fremme våre RWV-genererte mucosal modellene vi arbeider for å skape en mer kompleks flercellet system som gjenskaper både struktur og funksjon av den menneskelige mucosal vev. Men forfatterne erkjenner at det kan være nødvendig å benytte eller integrere flere modellsystemer for å reprodusere de komplekse interaksjoner som medisiner og vaksiner har med menneskelige fysiologiske systemer. Samlet er målet vårt for å bruke RWV bioreaktor og dets eksperimentelle applikasjoner for bedre å forstå slimhinnene vev biologi og de cellulære responser til miljømessige fornærmelser i humane organotypic modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Brooke Hjelm for henne teknisk ekspertise og Andrew Larsen for hans protein analyse. Dette arbeidet ble finansiert delvis av Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant og NIH NIAID seksuelt overførbare infeksjoner og Aktuelt microbicides Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi ønsker å takke for Biology of Reproduction for gjenbruk av tall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21131 Used at 1:500 dilution
FACSDiva BD Biosciences Flow cytometer
β-tublin antibody Calbiochem 654162 Used at 1:5000 dilution
Bio-Plex 2000 Bio-Rad 171-000205 v5 software
Bioreactor and components Synthecon RCCS-4
Cell strainer BD Biosciences 352340 40μm pore size
Conical tube (50mL) Corning 5-538-60
Coverslips VWR international 48366067
Cytokine bead array kits Bio-Rad Custom human kit
Cytodex beads Sigma-Aldrich C3275
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
EDTA Sigma-Aldrich ED-500G Ethylenediaminetetraacetic acid
Epithelial specific antibody (ESA) Chemicon International CBL251 Used at 1:50 dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10438 Heat inactivated
HARV (Disposable) Synthecon D-405
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 37%
Involucrin antibody Sigma-Aldrich I 9018
Microscope slides VWR international 16004-368
MTT reagent MP Biomedicals 194592 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide
MUC1 antibody (microscopy) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-7313 Used at 1:50 dilution
MUC1 antibody (flow cytometry) BD Biosciences 559774 Also called CD227, use 20μL per test
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4% in DPBS
Petri dish (small) BD Biosciences 353002
Polystyrene tube with filter BD Biosciences 352235
Polystyrene flow tube BD Biosciences 352058
PR antibody Dako M3569 Used at 1:100 dilution
ProLong Gold Invitrogen P36931 Mounting media with DAPI
RNeasy Mini Kit Qiagen 74903
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71725
Sterilization pouch VWR international 11213-035
Stopcocks (one-way) MedexSupply MX5061L
Syringe (10mL) BD Biosciences 309604 Luer-lock tip
Syringe (5mL) BD Biosciences 309603 Luer-lock tip
Trypan Blue Invitrogen T10282
Vp5 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-13525 HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
  3. Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
  4. Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
  5. Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
  6. Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
  7. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  8. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
  9. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
  10. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
  11. Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
  12. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
  13. Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
  14. Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
  15. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  16. Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
  17. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
  18. Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
  19. Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
  20. Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
  21. Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
  22. Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
  23. Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
  24. Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).

Tags

Cellular Biology Roterende vegg fartøy bioreaktor kvinnelige skjede menneskelige epitelceller tredimensjonale organotypic mucosal modeller vaginal epitelceller antibiotikum herpes simplex virus toksikologi host-patogen interaksjoner hormonreseptorer
Dyrking og bruk av roterende Wall Vessel bioreaktor Avledet 3D Epiteliale Cellemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M.… More

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. J. Vis. Exp. (62), e3868, doi:10.3791/3868 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter