Summary
NADPH أوكسيديز هو المصدر الرئيسي للأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في البالعات. نظرا لطبيعة زائلة من ROS، فإنه من الصعب قياس ومراقبة مستويات ROS في الحيوانات الحية. يوصف أسلوب القياس الكمي للمينيملي المسلسل من ROS في الفئران الحية.
Protocol
1. نماذج الحيوان
- الفئران: استخدام P47-phox / - الفئران والعمر والجنس المتطابقة-الفئران C57BL6/DBA. الحصول على موافقة لإجراء التجارب من رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
- التخدير: استخدام نظام إدارة isoflurane المستمر للحث على التخدير. يتم تعبئة النظام المرذاذ (VetEquip) مع isoflurane (2-3٪). تؤكد أن الفئران هي تخدير كامل من خلال مراقبة حركة التنفس، ومنعكس القرنية استجابة للمؤثرات الخارجية.
- العمليات الجراحية: فرك منطقة العمليات الجراحية (الفوق) مع الايثانول 70٪. ارتداء قفازات معقمة ونظيفة ثوب الجراحية والقناع. إعداد الفئران عن طريق تقليم الشعر وتطبيق betadine بالتناوب مع الايثانول 70٪ إلى المنطقة حيث سيتم شق. إجراء عمليات جراحية على سطح معقمة واستخدام أدوات معقمة. رصد الفئران بعد العملية حتى مستيقظا ويتحرك بحرية.
- داخل الرغامى زيموزان الإدارة
- إدارة التخديركما هو موضح في 1.2.
- تطهير منطقة العمليات الجراحية (الرقبة) مع betadine والايثانول 70٪ وفضح القصبة الهوائية عن طريق تشريح الجراحي.
- بيرس القصبة الهوائية مع إبرة قياس 27-وضخ زيموزان (سانت لويس، MO) بجرعة من 1 ميكروغرام / غرام باستخدام ميكروغرام 0.5 / ميكرولتر حل (المجموع 50 ميكرولتر حجم للماوس ز 25) الذائب في PBS العقيمة.
- إغلاق الجرح الفئران الرقبة مع خيوط الحرير 5-0 في ظل ظروف معقمة العقيم.
- الصورة بعد 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة.
- الأعور ربط وثقب
- إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2.
- مقطع الشعر في منطقة العمليات الجراحية (البطن) وتعقيمها مع betadine والايثانول 70٪.
- تنفيذ خط الوسط البطن وتحديد الأعور.
- Ligate على القاصي 50٪ من المعرضين الأعور مع خياطة الحرير 4-0 و الأعور ثقب البعيدة للربط مع مرور واحد من إبرة قياس 21-.
- إغلاق شق مع خيوط الحرير 4-0 العقيمة.
- الصورة بعد 4 ساعات و24 ساعة.
- رابع كلوريد الكربون عن طريق الفم (لجنة علم المناخ 4) الإدارة
- إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2.
- إدارة لجنة علم المناخ 4 (2 ميكروغرام / غرام، سانت لويس، MO) المذاب في زيت الذرة بالتزقيم عن طريق الفم. يجب أن يتم تنفيذ الإجراء من CCL4 الإدارة في مجال معين وفقا للIBC / EHS السياسات.
- الصورة بعد 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة.
2. الحصول على صورة Bioluminescent
- تهيئة ال 200 IVIS نظام التصوير (Xenogen شركة، ألاميدا، CA)، تعيين إلى وضع التلألؤ، وانتظر الجهاز المسؤول عن يقترن (CCD) لتأمين درجة حرارة.
- حدد وقت التعرض، binning (وسط) وF / إيقاف إعدادات (8).
- الفئران في موقف ضعيف مكان في غرفة التصوير على مسرح ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم طبيعية. إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2 عن طريق الأنف بينما مخروط الفئران هي في غرفة التصوير IVIS.
- إدارة L-012 (20 ميكروغرام / غرام) في حل PBS العقيمة (10 ميكروغرام / ميكرولتر) عن طريق الوريد عن طريق الحقن خلف الحجاج في كل نقطة الوقت المحدد للتصوير.
- التقاط الصور في بداية 2 دقيقة بعد الحقن L-012. نستخدم عادة التعرض و 40 ثانية.
3. تحليل البيانات باستخدام منطقة الاهتمام
- تحليل البيانات باستخدام البرامج الحية صورة v.4.2 (Xenogen شركة، ألاميدا، CA).
- فتح صورة وحدد قياس المنطقة من الأدوات الفائدة.
- تحديد المنطقة من شكل وحجم الفائدة على / أو الصدر والبطن بعد تتراكب صورة ملونة شبه الرقمية (التي تمثل كشف الفوتون) على صورة فوتوغرافية من الفأرة.
- تحديد كثافة إشارة (الفوتون تدفق) من منطقة الفائدة.
4. إحصائيات
- استخدام حزمة برامج التحليل الإحصائي لأداء اتجاهين مع ANOVA Bonferroni بعد الاختبار في نقاط زمنية الفردية.
زيموزان هي خلايا الخميرة الموالية للالتهابات المنتج الجدار ومنشط قوي للأوكسيديز NADPH 3. أظهرنا سابقا أن زيموزان داخل الرغامى يدفع أكثر قوة والتهاب الرئة عدلة الموالية للالتهابات إنتاج السيتوكينات في P47-phox / - مقارنة wildtype الفئران 1. هنا، كان هدفنا لمقارنة ROS الجيل في الرئتين من wildtype وP47-phox / - الفئران بعد التحدي زيموزان. في 4 ساعات بعد تناوله زيموزان داخل الرغامى، لاحظنا زيادة كبيرة في الانبعاثات الفوتون على الصدر في الفئران مقارنة مع wildtype الأساس، وكذلك زيادة في الانبعاثات الفوتون في wildtype مقارنة P47-phox / - الفئران في 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة. في المقابل، إشارات تلألؤ بيولوجي في P47-phox / - الفئران ظلت عند مستويات خط الأساس في 4 ساعات بعد العلاج زيموزان (Fig.1 AB). وهكذا، يبدو أن أوكسيديز NADPH به المصدر الرئيسي للجيل ROS في الرئتين بعد زيموزان الإدارة.
المقبل، قمنا بتقييم ROS الإنتاج في نموذج الإنتان CLP-المستحث. الإنتان هو متلازمة تهدد الحياة المرتبطة نهاية الجهاز الضرر، بما في ذلك الضرر الرئة الحاد (ALI) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) 4، 5. وقد اعتبر ROS بوساطة الإصابة ليكون عاملا هاما القيادة الإنتان الناجم عن اختلال وظيفي متعدد الجهاز. وجدنا أن زيادة كبيرة على مدى الصدر ROS (4 ساعة) وعلى البطن (24 ساعة) بعد CLP في الفئران مقارنة مع wildtype خط الأساس. غير أن مستويات ROS في P47-phox / - الفئران كانت مماثلة لمستويات خط الأساس في نقاط زمنية على حد سواء (Fig.2 AC). هذه النتائج تبين أن الجيل ROS في نموذج الفأر الإنتان الناجم عن CLP-NADPH أوكسيديز هو المعتمدة.
وأخيرا، كنا bioluminescent التصوير للكشف عن ROS الإنتاج في 4-الناجم عن الإصابة جنة علم المناخ الكبد الوضعلتر. 4 أسباب نخر جنة علم المناخ الخلايا الكبدية، واستخدمت في تصميم نموذج كل من اصابة الكبد الحاد وتليف الكبد 6. وعلى النقيض من النماذج التي سبق وصفها من الالتهاب والإصابة، وجدنا أن ROS الإنتاج في البطن كان متواضعا (حوالي 35٪) أكثر من خط الأساس في زيادة P47-phox / - الفئران في 4 ساعات بعد 4 للجنة علم المناخ الإدارة. ومع ذلك، كان حجم لجنة علم المناخ الناجم 4-ROS جيل أكبر بكثير على الفئران في P47 wildtype من phox / - الفئران (Fig.3 AB). هذه البيانات تشير إلى أن كلا الجيل ROS P47 phox التي تحتوي على NADPH أوكسيديز التي تعتمد على ومستقلة تحدث في لجنة علم المناخ الحاد الناجم عن إصابة 4-الكبد.
الرقم الإنتاج ROS 1. في الرئتين بعد العلاج زيموزان. A) الممثل bioluminescenم التصوير الإنتاج ROS. ملاحظة أنه بالإضافة إلى صدره، والتلألؤ قابلا للاكتشاف على البطن في كل من wildtype وP47-phox / - الفئران والتلألؤ البطن هو دون تغيير عن طريق العلاج زيموزان. B) من التهم الفوتون صدر wildtype وP47-phox / - الفئران بعد حقنة واحدة داخل الرغامى (IT) من زيموزان. تم إجراء التصوير تلألؤ بيولوجي في الأساس، ح 4، و24 ساعة. وقد تم تحديد انبعاث الضوء من منطقة الفوائد على الصدر باستخدام المشار شبه لون الحجم. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE، ن = 6-9 في المجموعة، * = P <0.05. اضغط هنا لتكبير الرقم .
الكشف عن الرقم ROS 2. بعد CLP. A تلألؤ بيولوجي الممثل) التصوير الإنتاج ROS، B) من التهم الفوتون الصدر، وC) التهم الفوتون من بطن wildtype وP47-phox / - الفئران في الأساس، 4 ساعة، وبعد 24 ساعة CLP. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE، ن = 4-5 في المجموعة، * = P <0.05. اضغط هنا لتكبير الرقم .
إنتاج الرقم ROS 3. في البطن بعد لجنة علم المناخ الناجم عن إصابة 4-الكبد. A) التصوير تلألؤ بيولوجي الممثل الإنتاج ROS وB) التهم الفوتون من بطن wildtype وP47-phox / - الفئران في الأساس، والموارد البشرية 4، وعلى مدار 24 ساعة عن طريق الفم بعد العلاج 4 للجنة علم المناخ. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE؛ ن = 4-5 في المجموعة، * = P <0.05 انقر هنا للحصول على أكبر شخصية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يمكن أن يتحقق "في الوقت الحقيقي" قياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في الحيوانات الحية باستخدام تحقيقات الفلورسنت وchemiluminescent. في حين تحقيقات الفلورسنت يعانون من ضعف وجود إشارة إلى الضوضاء نسب 12، تقنية التصوير صفها هو أكثر حساسية للكشف عن انبعاث الضوء بعد تفاعل كيميائي من ROS مع الركيزة كسيماترين المستندة إلى L-012. مثل كل تقنيات التصوير bioluminescent، يقتصر هذه المنهجية من قبل امتصاص الضوء التي تعتمد على الطول الموجي والتشرذم من قبل الأعضاء والأنسجة. وركزت هذه التجارب على تهيئة الظروف المناسبة التجريبية لقياس ROS في wildtype وP47-phox / - الفئران. استخدام هذه الفئران المعدلة وراثيا تمكننا من التفريق ROS التي تم إنشاؤها بواسطة P47 أوكسيديز NADPH phox المحتوية من ROS الناتجة عن المسارات الأخرى.
على الرغم من وظيفية تحتوي على أوكسيديز NADPH هو P47 phoxمصدرا رئيسيا للROS، وغيرها من الأشكال الإسوية أوكسيديز NADPH موجودة، وROS إضافية لتوليد النظم، بما في ذلك أوكسيديز الزانثين والتنفس الميتوكوندريا، يمكن أن تنتج ROS. NADPH أوكسيديز وغيرها من ROS المدرة لل. مسارات يمكن أن يكون لها تأثيرات هامة على الدفاع وتفاعلية المضيف المضادة للميكروبات والمصب مسارات الإشارات التي تعدل الالتهاب والإصابة 7-10 باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي، تمكنا من قياس حركية الإنتاج ROS في الجسم الحي، وتحديد مساهمة أوكسيديز NADPH إلى مستويات ROS في نماذج مختلفة التهابات.
وجود قيود على هذا الأسلوب يتعلق القرار المكاني للتلألؤ بيولوجي. على الرغم من أننا يمكن قياس التألق داخل حجرات التشريحية محددة (على سبيل المثال، الصدر، البطن)، فإنه من الصعب حصر الموقع التشريحي للتألق على المستوى الجهاز. في كل من النماذج التجريبية لدينا اخترنا النقاط الزمنية 3 للقياسات bioluminescent: خط الأساس، والموارد البشرية 4، وعلى مدار 24 ساعة. نحن لا نعرف إذا bioluminescent التصوير يمكن تحديد الاختلافات الصغيرة في توليد ROS على فترات أقصر من تحليل أو ما إذا كانت العلاقة بين الجسم الحي في توليد ROS وتلألؤ بيولوجي بشكل طولي. هذه القضايا تتطلب مزيدا من الدراسة. في النماذج المستخدمة لهذه الدراسات، نعتقد أن الخلايا البلعمية، والعدلات المعينين الضامة، هي في المقام الأول المسؤولة عن إنتاج ROS عبر نظام أوكسيديز NADPH بلعمية. يمكن أن الدراسات المستقبلية التي تنضب أنواع معينة من الخلايا أو يتم إنشاؤها الوهم العظام توفير المعارف إضافية حول المستويات النسبية للجيل ROS من السكان مختلفة من الخلايا. ومن أوجه القصور المحتملة للدراسات باستخدام L-012 هو أن المتطرفين أخرى (إلى جانب ROS) قد تتفاعل مع هذا التحقيق الانارة، والحد من خصوصية للكشف ROS في بعض الظروف.
بعد حقن زيموزان، وعدم الإنتاج في ROS-P47 phox / - الفئران تشير إلى أن أوكسيديز NADPH هوالمصدر الرئيسي للROS في هذا النموذج من التهاب الرئة. CLP هي واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر شيوعا للتسمم 11 و التصوير تلألؤ بيولوجي كشفت زيادة الإشارات ROS في كل من الرئة والبطن أوكسيديز NADPH التي كانت تعتمد على. وعلى النقيض من زيموزان ونماذج CLP، تمت زيادة ROS في البطن من كل من wildtype وP47-phox / - الفئران مقارنة مع خط الأساس، ولكن لدرجة أكبر في الفئران wildtype، مشيرا إلى أن لجنة علم المناخ 4 الحث ROS الانتاج P47 phox - تحتوي أوكسيديز NADPH وغيرها من الآليات.
وباختصار، البيانات المتوفرة لدينا تبين أن التصوير تلألؤ بيولوجي كسيماترين المستندة إلى أسلوب للكشف عن ROS يمكن أن يكون أداة قيمة للبحوث بشأن تنظيم وعواقب الإنتاج ROS في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 AI079253 وزارة شؤون المحاربين القدامى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
