Summary
NADPH 산화 효소가 phagocytes에서 반응성 산소 종의 주요 소스 (ROS)입니다. 때문에 ROS의 임시 자연의, 그것은 생활 동물의 ROS 수준을 측정하고 모니터링하기가 어렵습니다. 생활 쥐 ROS의 일련 정량화하기위한 최소한 침입 방법 설명되어 있습니다.
Abstract
NADPH 산화 효소는 항균 및 항 곰팡이 호스트 방어를 mediates 중요한 효소이다. 항균 호스트 방어에서의 역할뿐만 아니라, NADPH 산화 효소는 염증 반응 1 변조 중요한 신호 기능이 있습니다. 따라서, NADPH 산화 효소 파생 ROS 생성의 "실시간"동역학에 측정 할 수있는 방법의 개발은 방위, 염증, 그리고 부상을 개최 할 관련 메커니즘을 이해하는 중요한 연구 도구가 될 것으로 예상된다.
만성 granulomatous 질환 (CGD)는 심각한 감염과 과도한 염증을 특징으로 NADPH 산화 효소의 상속 장애입니다. 식세포 NADPH 산화 효소의 활성화는 cytosolic subunits (p47 phox, p67 phox, 그리고 p40 phox)과 막에 바인딩 flavocytochrome (gp91 phox와 P22 phox heterodimer로 구성)에 RAC의 translocation이 필요합니다. 손실CGD에서 이러한 NADPH 산화 효소 구성 요소 결과의의 기능 변이. CGD 환자와 마찬가지로, gp91 phox - 결함 마우스와 p47 phox - 결함 마우스에 결함이 식세포 NADPH 산화 효소 활동 및 장애인 호스트 방어 13, 14가 있습니다. 위에 설명 된 NADPH 산화 효소의 구성 요소가 포함 phagocytes,뿐만 아니라 다른 세포 유형의 다양한 NADPH 산화 효소의 다른 isoforms을 표현한다.
여기, 우리는 생활 마우스에서 ROS 생산을 수량화하고 염증과 부상의 모델에서 ROS 생성에 NADPH 산화 효소의 노력이 윤곽을 그리다 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전하 결합 소자 (CCD)에 의해 기록되어 발광을 방출하기 위해 L-012 (루미놀의 아날로그)와 반응 ROS에 기반을두고 있습니다. L-012 프로브의 원래 설명에, L-012에 따라 달라 chemiluminescence은 완전히이 반응에서 검색된 메인 ROS는 슈퍼이라고 표시, 초과 산화물의 dismutase에 의해 폐지되었다산화물 음이온 15. 후속 연구는 L-012은 반응성 질소 종 16, 17 등 다른 자유 래디칼을 감지 할 수 것으로 나타났습니다. Kielland 외. 17 phorbol myristate 아세테이트, NADPH 산화 효소의 강력한 활성,의 주제 응용 프로그램이 발광 프로브 L-012를 사용하여 마우스에서 발견 할 수 산화 효소에 의존 ROS 생성을 NADPH는 생각이 들어서 보여 주었다. 이 모델에서, 그들은 L-012-의존 발광는 p47 phox - 결핍 생쥐에서 폐지 된 것으로 나타났다.
우리는 wildtype 마우스와 NADPH 산화 효소 - 결함 p47 phox-/에서 ROS 생성 비교 - 다음과 같은 세 가지 모델의 생쥐 2 : zymosan, NADPH 산화 효소를 활성화 할 수 있습니다 벽 파생 제품 프로 염증 곰팡이 세포의 1) intratracheal 관리, 2) cecal 결합과 주사 (CLP), 보조 급성 폐 염증과 부상으로 간 복부 패혈증의 모델, 그리고 3) 구두 탄소 tetrachloride에게(CCL 4) ROS에 의존 간 부상의 모델입니다. 이 모델은 특히 각각, 비 전염성 염증, polymicrobial 패혈증 및 독소 유발 장기 부상의 맥락에서 NADPH 산화 효소에 의존 ROS 생성을 평가하는 선정되었다. p47에 wildtype 마우스에 bioluminescence을 비교 phox-/ - 마우스 우리는이 모델의 발광 생물 신호에 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의해 생성 된 ROS의 특정 공헌을 윤곽을 그리다 수 있습니다.
p47에 비해 wildtype 쥐 증가 ROS 수준을 보여 Bioluminescence 이미징 결과는 phox-/ - 마우스는 NADPH 산화 효소는 염증 자극에 대한 응답으로 ROS 생성의 주요 원천입니다 지적했다. 이 방법은 생체 내 염증 동안 ROS 생성의 "실시간"모니터링을위한 최소한 침해 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
1. 동물 모델
- 마우스 : p47 phox-/를 사용하여 - 마우스와 연령 및 성별 - 일치 C57BL6/DBA 마우스입니다. 기관 동물 케어 및 사용위원회의 실험에 대한 승인을 얻습니다.
- 마취 : 마취를 유도하기 위해 지속적인 isoflurane 관리 시스템을 사용합니다. vaporizer 시스템 (VetEquip)는 (2-3 %) isoflurane으로 가득합니다. 쥐가 외부 자극에 대한 응답으로 호흡, 운동, 그리고 각막 반사를 관찰하여 완전히 anesthetized되어 있는지 확인.
- 수술 절차 : 70 %의 에탄올과 수술 영역 (benchtop)을 씻어. 멸균 장갑과 깨끗한 수술 가운과 마스크를 착용하십시오. 머리를 클리핑하고 절개가 이루어집니다 영역에 70 %의 에탄올과 교류 betadine을 적용하여 마우스를 준비합니다. 멸균 표면에 수술을 수행하고 멸균 악기를 사용합니다. 모니터 마우스는 사후 operatively까지 깨어 자유롭게 이동.
- Intratracheal zymosan 관리
- 마취를 관리로 1.2에 설명되어 있습니다.
- betadine과 70 %의 에탄올과 수술 영역 (목) 소독 및 수술 절개로 기관을 쉽게받을 수 있습니다.
- 피어스 27 게이지 바늘로기도하고 멸균 PBS에 용해 0.5 μg / μl 솔루션을 (25g 마우스에 대한 총 판매량 50 μl)를 사용하여 1 μg / g의 용량에 zymosan (세인트 루이스, MO)를 주입.
- 닫기 쥐 목 무균 조건 하에서 5-0 멸균 실크 봉합과 상처.
- 4 시간, 24 시간 후 이미지.
- Cecal 결합과 주사
- 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수 있습니다.
- 수술 영역 (복부)에 머리를 클립하고 betadine과 70 % 에탄올로 소독.
- 중간 선 개복술을 수행하고이게 맹장을 식별합니다.
- 4-0 실크 봉합사와 21 게이지 바늘 중 하나를 패스 결합으로 말초 찔린이게 맹장과 노출이게 맹장의 말초 50 %를 Ligate.
- 4-0 멸균 실크 봉합과 절개를 닫습니다.
- 4 시간 후 이미지와24 시간.
- 구강 탄소 tetrachloride (CCL 4) 관리
- 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수 있습니다.
- 구두 gavage으로 옥수수 기름에 용해 CCL 네 (2 μg / g, 세인트 루이스, MO)를 관리 할 수 있습니다. CCl4 행정 절차는 IBC / EHS 정책에 따라 지정된 지역에서 수행해야합니다.
- 4 시간, 24 시간 후 이미지.
2. 발광 생물 이미지를 취득
- 발광 모드로 설정 IVIS 200 (Xenogen 공사, 알라 메다, CA) 이미징 시스템을 초기화하고, 전하 결합 소자 (CCD) 잠글 온도 기다립니다.
- 노출 시간, binning (중간) 및 F / 정지 (8) 설정을 선택합니다.
- 정상적인 체온을 유지하기 위해 온수 무대에서 이미징 챔버에서 위로 향한 위치에 배치 마우스. 쥐가 IVIS 이미징 챔버에있는 동안 코 콘을 통해 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수 있습니다.
- L-012를 관리 (20 μg / g) 이미지에 대해 선택한 각 시점에서 역 궤도 분사를 통해 intravenously 멸균 PBS (10 μg / μl)에 용해.
- L-012 주입 후 2 분에 시작 이미지를 캡처합니다. 우리는 일반적으로 40 초 노출을 사용합니다.
3. 관심 지역을 사용하여 데이터 분석
- 생활 이미지 소프트웨어에게 v.4.2을 (Xenogen 공사, 알라 메다, CA)를 사용하여 데이터를 분석합니다.
- 이미지를 열고 관심 툴의 지역 측정을 선택합니다.
- 가슴 또는 / 및 마우스의 사진 이미지 위에 의사 색 디지털 이미지 (광자 검출을 대표하는) 오버레이 한 후 복부 이상 관심 모양과 크기의 지역을 선택합니다.
- 관심 지역에서 신호 강도 (광자 플럭스)를 정량화.
4. 통계
- 개인 시간 지점에서 Bonferroni 사후 테스트를 양방향 ANOVA를 수행하는 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용합니다.
Zymosan는 프로 염증성 효모 세포벽 제품 및 NADPH 산화 효소 3의 강력한 활성입니다. 우리는 이전에 해당 intratracheal zymosan는보다 강력한 neutrophilic 폐 염증과 p47 phox-/에서 프로 염증성 시토 킨 생산을 유도했다 - 마우스에게 1 wildtype에 비해. zymosan 도전 다음 마우스 - 여기, 우리의 목표는 wildtype와 p47 phox-/의 폐에 ROS 생성을 비교하는 것이 었습니다. 4 H 및 24 시간에서 마우스 - 4 시간에서 intratracheal zymosan 관리 한 후, 우리는 기준뿐만 아니라 p47 phox-/에 비해 wildtype의 광자 방출의 증가에 비해 wildtype 쥐 가슴 광자 방출에 상당한 증가를 관찰했다. 반면, p47 phox-/에서 bioluminescence 신호 - 마우스 zymosan 처리 (Fig.1 AB) 이후 4 시간에서 기본 수준에서 유지. 따라서, NADPH 산화 효소는 B에 나타납니다전자 zymosan 관리에 따라 폐의 ROS 생성의 주요 소스.
다음, 우리는 CLP 유발 패혈증 모델에서 ROS 생산도 평가합니다. 패혈증은 급성 폐 손상 (ALI)과 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 4, 5 등의 최종 장기 손상과 관련된 생명을 위협하는 증후군이다. ROS로 인한 부상은 패혈증 유발 다중 장기 부전을 유도하는 중요한 요소로 간주되었습니다. 우리는 ROS가 크게 가슴 (4 시간) 이상 및 기준에 비해 wildtype 쥐 CLP에 따라 복부 (24 시간) 이상 증가 된 것으로 나타났습니다. 그러나, p47 phox-/에서 ROS 수준 - 마우스는 시간 포인트 (Fig.2 AC) 모두에서 기본 수준과 비슷했다. 이러한 결과는 CLP 유발 패혈증 마우스 모델에서 ROS 생성이 산화 효소에 의존 NADPH입니다 보여줍니다.
마지막으로, 우리는 CCL 4 유발 간 손상 모드에서 ROS 생산을 감지하는 발광 생물 이미징을 사용하여리터. CCL 4 간세포 괴사가 발생하고, 급성 간 손상과 간 섬유증 6을 모두 모델링하는 데 사용되었습니다. CCL 4 행정에 따라 4 H의 마우스 - 염증과 부상 이전에 설명 모델에 대조적으로, 우리는 복부에서 ROS 생산 (35 %) p47 phox-/에서 기준이 지남에 따라 증가하는 겸손 것으로 나타났습니다. 마우스 (Fig.3 AB) - 그러나, 4 - 유도 ROS 생성 CCL의 크기는 p47 phox-/에서보다 wildtype 쥐 훨씬 더했습니다. 이러한 데이터는 모두 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의존하고 독립적 인 ROS 생성은 급성 CCL 4 유발 간 손상에서 발생하는 것이 좋습니다.
zymosan 치료 후 폐의 그림 1. ROS 생산. A) 대표 bioluminescenROS 생산의 CE 이미지. 마우스 및 복부 발광이 zymosan 치료에 의해 변경되지 - 가슴뿐만 아니라, 발광는 wildtype와 p47 phox-/ 모두의 복부 이상 감지 값입니다. wildtype 및 p47 phox-/의 가슴에서 B) 광자 카운트 - zymosan의 (IT) intratracheal 단일 분사 한 후 마우스. Bioluminescence 이미징은 기본, 4 H,, 24 H에서 수행되었다. 가슴 관심 지역의 발광은 지정된 의사 색 척도를 이용하여 확인되었다. 결과는 의미로 제공됩니다 ± SE, N = 6-9 그룹 당, * = P <0.05. 큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요 .
그림 2. ROS 감지는 다음 CLP. ROS 생산, B의 A) 대표 bioluminescence 이미징) 광자 가슴에서 카운트 wildtype와 p47 phox-/의 복부에서 C) 광자 카운트 - 기준에서 마우스, 4 시간, 그리고 CLP 후 24 시간. 결과는 의미로 제공됩니다 ± SE, N = 그룹 당 4-5, * = P <0.05. 큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요 .
CCL 후 복부 4 유발 간 손상의 그림 3. ROS 생산. 구두 CCL 네 치료 후 기준선에서 마우스, 4 시간, 24 시간 - ROS 생산 및 wildtype와 p47 phox-/의 복부에서 B) 광자 카운트의 A) 대표 bioluminescence 이미징. . N = 4-5 당 그룹, * = P <0.05, 결과는 의미 ± SE로 표시됩니다 보시려면 여기를 클릭하세요 큰 그림
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Discussion
생활 동물 반응성 산소 종의 "실시간"측정 (ROS)는 형광등과 chemiluminescent 프로브를 사용하여 달성 될 수있다. 형광 프로브가 약 신호 대 잡음 비율 12 문제에서 고통 있지만, 설명 된 이미징 기술은 루미놀 기반의 기판 L-012와 ROS의 화학 반응에 따라 발광을 검출에 대한 더 많은 문자를 구분합니다. 모든 발광 생물 이미징 기술과 마찬가지로,이 방법론은 기관과 조직에 의해 파장에 의존 광 흡수와 산란에 의해 제한됩니다. 마우스 -이 실험은 wildtype와 p47 phox-/에서 ROS의 측정을 위해 적절한 실험 조건을 확립에 초점을 맞추고 있었다. 이러한 유전자 변형 마우스의 사용은 ROS는 다른 경로에 의해 생성 된 ROS에서 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의해 생성 된 차별화 할 수있게.
p47 phox를 포함하는 기능 NADPH 산화 효소는 있지만ROS의 주요 소스, 기타 NADPH 산화 효소의 isoforms은 존재하고 잔틴 산화 효소와 mitochondrial 호흡 등의 추가 ROS 창출 시스템은, ROS를 생성 할 수 있습니다. NADPH 산화 효소와 다른 ROS 창출 경로하는 항균 호스트 방어 및 염증과 부상 7-10을 조절 하류 신호 경로에 대한 중요하고 상호 영향을 미칠 수 있습니다. bioluminescence 이미징을 사용하여, 우리는 생체에 ROS 생산의 동력학을 측정 할 수 있고 다른 염증 모델에서 ROS 레벨에 NADPH 산화 효소의 노력이 윤곽을 그리다 수있었습니다.
이 방법의 한계는 bioluminescence의 공간 해상도에 관한 것이다. 우리가 특정 해부학 구획 (예., 가슴, 복부)에서 발광을 측정 할 수 있지만 장기 수준에서 발광의 해부학 사이트를 현지화하기가 어렵습니다. 기준, 4 시간, 24 시간 : 우리 실험 모델의 각에서 우리는 발광 생물 측정 3 시간 포인트를 선택. 발광 생물 이미징은 분석의 짧은 간격 이상 또는 생체 ROS 생성 및 bioluminescence의 사이의 관계가 선형 여부 ROS 생성의 작은 차이를 식별 할 수 있다면 우리는 몰라요. 이 문제는 더 연구가 필요합니다. 이러한 연구에 사용 된 모델에서, 우리는 phagocytic 세포, 호중구와 대 식세포 모집은 주로 식세포 NADPH 산화 효소 시스템을 통해 ROS 생산에 대한 책임 것 같습니다. 특정 셀 유형이 소진되거나 뼈 chimeras가 생성되는 미래의 연구는 서로 다른 세포 집단에서 ROS 생성의 상대적 수준에 대한 추가 지식을 제공 할 수 있습니다. L-012을 사용하여 연구의 또 다른 잠재적 인 제한은 다른 급진파가 (ROS 외에) 어떤 상황에서 ROS 검색에 대한 특이성을 감소,이 발광 프로브와 반응 할 수 있다는 것입니다.
zymosan 분사, p47 phox-/에서 ROS 생산의 부족에 이어 - 마우스는 NADPH 산화 효소가 나타냅니다폐 염증이 모델에서 ROS의 주요 소스. CLP는 산화 효소에 의존 NADPH 있던 폐와 복부 모두에 ROS 신호를 증가 발표 패혈증 11 bioluminescence 이미징의 가장 일반적인 동물 모델 중 하나입니다. zymosan 및 CLP 모델에 대조적으로, ROS는 wildtype와 p47 phox-/ 모두의 복부 증가되었습니다 - 마우스 기본에 비해하지만, wildtype 쥐에 더 많은 학위 CCL 4 p47 phox에 의해 ROS 생산을 유도하는 표시로 - NADPH 산화 효소와 다른 메커니즘을 포함.
요약 우리 데이터는 ROS의 검출을위한 루미놀 기반 bioluminescence 이미징 방법은 생체 내 ROS 생산의 규제와 결과에 대한 연구 귀중한 도구가 될 수 있다는 보여줍니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH RO1 AI079253 및 보훈학과로 운영되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
