Summary
NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.
Abstract
NADPH oxidase é uma enzima importante que medeia a defesa do hospedeiro antibacteriana e antifúngica. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro antimicrobiana, NADPH oxidase tem funções críticas de sinalização que modulam a resposta inflamatória 1. Assim, o desenvolvimento de um método para medir, em "tempo real", a cinética da NADPH-oxidase geração de ROS derivado deve ser uma ferramenta de investigação valiosa para compreender os mecanismos de defesa do hospedeiro em causa, inflamação e lesão.
A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do NADPH oxidase caracterizada por infecções graves e inflamação excessiva. A activação da NADPH oxidase de fagócitos requer translocação das suas subunidades citosólicas (phox p47, p67 phox, e p40 phox) e Rac a um flavocytochrome ligada à membrana (composto de um phox gp91 e p22 phox heterodímero). Perdafunção de mutações em qualquer um destes componentes resultado NADPH oxidase na CGD. Semelhante ao dos pacientes com CGD, gp91 phox camundongos deficientes e P47 phox camundongos deficientes têm defeito oxidase de fagócitos NADPH e de acolhimento prejudicada defesa 13, 14. Além de fagócitos, que contêm os componentes da NADPH oxidase descritos acima, uma variedade de outros tipos de células expressam diferentes isoformas da NADPH-oxidase.
Aqui, descrevemos um método para quantificar a produção de ROS em camundongos vivos e delinear a contribuição da NADPH oxidase para a geração de ROS em modelos de inflamação e lesão. Este método baseia-se ROS reagir com L-012 (um análogo do luminol) para emitir luminescência que é gravada por um dispositivo de carga acoplada (CCD). Na descrição original da sonda L-012, L-012-dependente de quimioluminescência foi completamente abolido pela superóxido-dismutase, o que indica que o principal ROS detectado nesta reacção foi superanião óxido 15. Estudos subsequentes têm mostrado que o L-012 pode detectar outros radicais livres, incluindo as espécies reactivas de azoto 16, 17. Kielland et al. 17 mostrou que a aplicação tópica de acetato de miristato de forbol, um activador potente da NADPH-oxidase, levou a NADPH oxidase-dependente de geração de ROS, que pode ser detectada em ratos usando o teste luminescente L-012. Neste modelo, eles mostraram que a luminescência L-012-dependente foi abolida em p47 phox camundongos deficientes.
Nós comparamos geração de ROS em ratinhos de tipo selvagem e da NADPH-oxidase deficiente phox p47-/ - 2 ratos nos três seguintes modelos: administração 1) intratraqueal de zimosan, uma célula pro-inflamatório fúngico parede derivado do produto que podem activar a NADPH oxidase, 2) ligadura e perfuração cecal (CLP), um modelo de sepse intra-abdominal com inflamação pulmonar aguda e lesão secundária e 3) tetracloreto de carbono por via oral(CCl 4), um modelo de ROS-dependente lesão hepática. Estes modelos foram seleccionados para avaliar especificamente NADPH oxidase-dependente de geração de ROS no contexto de inflamação não infecciosa, sepse polimicrobiana e toxina induzida por lesão de órgãos, respectivamente. Comparando bioluminescência em camundongos de tipo selvagem de p47 phox-/ - ratos nos permite delinear a contribuição específica de ROS gerado pelo p47 oxidase phox contendo NADPH para o sinal bioluminescente nesses modelos.
Resultados de imagem de bioluminescência que demonstraram níveis elevados de ROS em ratinhos de tipo selvagem em comparação com p47 phox-/ - ratos indicaram que a NADPH oxidase é a principal fonte de produção de ROS em resposta a estímulos inflamatórios. Este método oferece uma abordagem minimamente invasiva para "real-time" monitoramento da geração de ROS durante a inflamação in vivo.
Protocol
1. Modelos Animais
- Ratos: Use p47 phox-/ - ratos e camundongos idade e sexo pareados C57BL6/DBA. Obter aprovação para as experiências de Animal Care Institucional e Comitê de uso.
- Anestesia: Use um sistema de administração contínua isoflurano para induzir a anestesia. O sistema de vaporizador (VetEquip) é preenchido com isoflurano (2-3%). Confirmar que os ratos são totalmente anestesiado pela observação da respiração, movimento e reflexo da córnea em resposta a estímulos externos.
- Procedimentos cirúrgicos: Esfregue a área cirúrgica (bancada) com etanol 70%. Usar luvas estéreis e um vestido cirúrgico limpo e máscara. Preparar os ratos por recorte do cabelo e aplicação de betadine alternando com etanol a 70% para a área onde a incisão será feita. Realizar uma cirurgia em uma superfície estéril e usar instrumentos esterilizados. Monitor de ratos pós-operatório até acordado e se movendo livremente.
- Zymosan administração intratraqueal
- Administrar anestesiacomo descrito na secção 1.2.
- Desinfectar área cirúrgica (pescoço) com betadine e 70% de etanol e expor a traqueia por dissecção cirúrgica.
- Pierce traqueia com uma agulha de calibre 27 e injectar zimosan (St. Louis, MO) a uma dose de 1 ug / g utilizando uma 0,5 mg / uL solução (volume total de 50 ul de um ratinho de 25 g) dissolvida em PBS estéril.
- Pescoço ratinhos perto enrolada com fio de seda 5-0 estéreis sob condições assépticas.
- Imagem após 4 horas e 24 horas.
- Ligadura e perfuração cecal
- Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2.
- Grampo de cabelo na área cirúrgica (abdómen) e desinfectar com betadine e etanol 70%.
- Executar uma laparotomia mediana e identificar o ceco.
- Ligar o 50% distal do ceco exposta com fio de seda 4-0 e ceco punção distal à ligadura com uma passagem de uma agulha de calibre 21.
- Fechar a incisão com suturas de seda 4-0 estéreis.
- Imagem depois de 4 horas e24 hr.
- Oral tetracloreto de carbono (CCl 4) administração
- Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2.
- Administrar CCl 4 (2 ng / g, St. Louis, MO), dissolvido em óleo de milho por meio de gavagem oral. O procedimento de CCl4 administração deve ser realizada em uma área designada de acordo com o IBC / EHS políticas.
- Imagem após 4 horas e 24 horas.
2. Adquirir uma imagem Bioluminescent
- Inicializar o IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, configurado para o modo de luminescência, e esperar que o dispositivo de carga acoplada (CCD) de temperatura para bloquear.
- Selecione o tempo de exposição, binning (médio) e F / Stop (8) definições.
- Ratinhos coloque em posição supina na câmara de imagem em uma fase aquecida para manter a temperatura corporal normal. Administrar anestesia como descrito em 1.2 através de cone do nariz enquanto os ratos estão na câmara de imagem IVIS.
- Administrar L-012 (20 ug / g), dissolvido em PBS estéril (10 ug / uL) por via intravenosa retro-orbital de injecção em cada ponto de tempo seleccionado para a imagem latente.
- Captar imagens a partir de 2 min após injecção de L-012. Normalmente usamos uma exposição 40 seg.
3. Análise de Dados utilizando Região de Interesse
- Analisar os dados utilizando software imagem viva v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Abra uma imagem e selecionar a medição da Região de ferramentas de juros.
- Selecione a Região de forma e tamanho interesse sobre o peito e / ou abdome após sobreposição de uma imagem pseudo-colorido digital (representando a detecção de fótons) sobre uma imagem fotográfica do mouse.
- Quantificar a intensidade do sinal (fóton fluxo) da região de interesse.
4. Estatística
- Usar pacote de software de análise estatística para executar two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni em momentos individuais.
Zymosan é um pró-inflamatória levedura produto da parede celular e um potente activador de NADPH-oxidase 3. Que anteriormente mostraram que zymosan intratraqueal induz uma inflamação pulmonar neutrofílica mais robusto e pró-inflamatória da produção de citocinas em p47 phox-/ - em comparação com a estirpe selvagem ratos 1. Aqui, nosso objetivo foi o de comparar a geração de ROS nos pulmões de tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos após desafio zymosan. Às 4 horas após a administração de zymosan intratraqueal, observou-se um aumento significativo da emissão de fotões sobre o peito em ratinhos de tipo selvagem em relação à linha de base, bem como um aumento na emissão de fotões, em comparação com o tipo selvagem p47 phox-/ - murganhos em 4 h e 24 h. Em contraste, os sinais de bioluminescência em p47 phox-/ - ratinhos mantiveram-se em níveis de linha de base em 4 h após o tratamento por zimosan (Fig.1 AB). Assim, parece NADPH oxidase be a principal fonte de geração de ROS nos pulmões a seguir à administração zymosan.
Em seguida, foi avaliada a produção de ROS no modelo de sepse por CLP induzido. A sepse é uma síndrome com risco de vida associado com lesões de órgãos-, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) 4, 5. ROS mediada por lesão foi considerado um factor importante dirigir-sepsia induzida por disfunção de múltiplos órgãos. Descobrimos que ROS foram significativamente aumentados sobre o peito (4 horas) e sobre o abdômen (24 horas) após CLP em camundongos de tipo selvagem em comparação à linha de base. No entanto, os níveis de ROS em p47 phox-/ - ratos foram semelhantes aos níveis de base em ambos os pontos de tempo (Fig.2 AC). Estes resultados mostram que a geração de ROS no modelo do rato induzida por CLP sepse é dependente da NADPH-oxidase.
Finalmente, utilizou-se imagiologia bioluminescente para detectar a produção de ROS em um modo de lesão induzida por CCl 4 fígadol. CCl 4 provoca a necrose hepatocelular, e tem sido utilizado para modelar ambos lesão hepática aguda e fibrose hepática 6. Em contraste com os modelos anteriormente descritos de inflamação e lesão, verificou-se que a produção de ROS no abdómen foi modestamente (cerca de 35%) aumentado em relação ao valor basal phox p47-/ - ratos a 4 h após a administração de CCl 4. No entanto, a magnitude de CCl 4 induzida por geração de ROS foi significativamente maior nos ratos do tipo selvagem do que nas p47 phox-/ - camundongos (Fig. 3-B). Estes dados sugerem que tanto a p47 phox contendo NADPH oxidase-dependente e independente de geração de ROS ocorrer em CCl 4 aguda induzida por dano hepático.
Figura 1. Produção de ROS em pulmões após tratamento zymosan. A) Representante bioluminescence de imagem de produção de ROS. Note-se que, em adição ao peito, a luminescência é detectável sobre o abdómen, tanto de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos e luminescência abdominal é inalterado por tratamento zymosan. B) a contagem de fotões a partir da caixa de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos depois de uma única injecção intratraqueal (IT) de zimosan. Imagem de bioluminescência foi realizada na linha de base, 4 h, e 24 h. A emissão de luz a partir da região de interesse sobre o tórax foi identificada utilizando a escala de pseudo cor-indicada. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 6-9 por grupo, * = p <0,05. clique aqui para ampliar a figura .
Figura 2. Detecção de ROS após CLP. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS, BFótons) conta a partir do peito, e conta C) de fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a CLP. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p <0,05. clique aqui para ampliar a figura .
Figura 3. Produção de ROS no abdômen após CCl 4 induzida por lesão hepática. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS e conta B) fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a administração oral CCl 4 tratamento. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p <0,05. figura clique aqui para ampliar
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Discussion
"Em tempo real" de medição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em animais vivos pode ser conseguido através da utilização de sondas fluorescentes e quimioluminescentes. Enquanto sondas fluorescentes com fracos sofrem de sinal-para-ruído 12, a técnica de imagem descrito é mais sensível para a detecção de emissão de luz na sequência de uma reacção química de ROS com o substrato luminol baseada em L-012. Como todas as técnicas de imagiologia bioluminescentes, esta metodologia é limitada pelo comprimento de onda dependente da absorção de luz e dispersão de órgãos e tecidos. Estas experiências foram focado em estabelecer condições experimentais adequadas para a medição de ROS no tipo selvagem e p47 phox-/ - camundongos. A utilização destes ratos geneticamente modificados permite diferenciar ROS gerados por p47 phox da NADPH oxidase contendo de ROS gerados por outras vias.
Embora NADPH oxidase contendo p47 funcional é phoxuma importante fonte de ROS, isoformas oxidase NADPH outras existem e adicionais ROS-geradoras, incluindo sistemas de xantina oxidase e da respiração mitocondrial, pode produzir ROS. NADPH oxidase e outras ROS-geração de vias pode ter efeitos importantes e interativa sobre a defesa do hospedeiro antimicrobiana e jusante vias de sinalização que modulam a inflamação e lesão 7-10. Usando imagem de bioluminescência, fomos capazes de medir a cinética da produção de ROS e in vivo para delinear a contribuição da NADPH-oxidase para níveis de ROS em diferentes modelos inflamatórios.
Uma limitação deste método relaciona-se com a resolução espacial de bioluminescência. Embora possamos medir a luminescência dentro específicos compartimentos anatómicos (por exemplo., Abdómen, tórax), é difícil localizar o local anatómico de luminescência no nível do órgão. Em cada um dos nossos modelos experimentais escolhemos três pontos de tempo para medições bioluminescentes: linha de base, 4 he 24 h. Nós não sabemos se bioluminescente de imagem pode identificar pequenas diferenças na geração de ROS em intervalos mais curtos de análise ou se a relação entre geração de ROS in vivo e bioluminescência é linear. Estas questões exigem um estudo mais aprofundado. Nos modelos utilizados para estes estudos, suspeitamos que as células fagocíticas, neutrófilos e macrófagos, recrutados são os principais responsáveis para a produção de ROS, através do sistema NADPH oxidase de fagócitos. Estudos futuros em que tipos específicos de células estão esgotados ou quimeras ossos são gerados poderiam fornecer conhecimento adicional sobre os níveis relativos de geração de ROS de populações diferentes de células. Outra limitação potencial de estudos utilizando L-012 é a de que os outros radicais (além de ROS) podem reagir com esta sonda luminescente, reduzindo a especificidade para detecção de ROS em algumas circunstâncias.
Seguindo zymosan injecção, a falta de produção de ROS em p47 phox-/ - ratos indica que a NADPH oxidase éa principal fonte de ROS, neste modelo de inflamação pulmonar. CLP é um dos modelos mais comuns de 11 e sepsis imagem de bioluminescência revelou aumento de sinais de ROS em ambos os pulmões e do abdómen que era dependente da NADPH-oxidase. Em contraste com o zimosan e modelos CLP, ROS foram aumentadas no abdómen de ambos de tipo selvagem e p47 phox-/ - em comparação com ratinhos de linha de base, mas a um nível mais elevado em ratinhos de tipo selvagem, indicando que o CCl 4 induz a produção de ROS por p47 phox - contendo NADPH oxidase e outros mecanismos.
Em resumo, nossos dados mostram que um luminol método baseado em imagem de bioluminescência para a detecção de ROS pode ser uma ferramenta valiosa para a pesquisa sobre a regulamentação e as consequências da produção de ROS in vivo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH RO1 AI079253 e do Departamento de Assuntos de Veteranos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
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