Summary
这里介绍的方法检测，按照激活RhoA的具体GDP / GTP交换因子（全环基金）在培养细胞中的突变RhoA的GST融合蛋白具有高亲和力激活全环基金的使用。全环基金沉淀的细胞裂解物，免疫印迹和密度定量检测。
Abstract
Rho家族小GTP酶的蛋白质是细胞骨架的中央监管机构，并控制多种细胞过程，包括细胞迁移，基因表达，细胞周期进程和细胞粘附1。 RHO蛋白质是活跃的分子开关是在GTP结合，并在国内生产总值的束缚态无效。其激活介导的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的蛋白质家族。卢全环基金构成一个大家族，重叠的特殊性2。虽然已经有很大进步作出识别激活特定信号的全环基金，仍然有许多问题，其余有关的具体规定，这些蛋白质的途径。的Rho环基金的数量超过70，每个单元表示一个以上的全球环境基金的蛋白质。此外，许多这些蛋白质激活不仅RHO，但其他家庭成员，进一步促进监管网络的复杂性。重要的是，探索全环基金如何监管要求的方法，按照不同的刺激活化细胞活跃的个人全环基金池。在这里，我们提供的方法来评估和量化提供积极具体的Rho-环基金使用亲和沉淀法一步一步的协议。此法是几年前开发Burridge实验室3,4和我们用它在肾小管细胞株5,6,7。该法的“核苷酸自由”突变RhoA的优势，为活跃的全环基金的高亲和力。突变（G17A），使蛋白质无法结合GDP或GTP和这个国家模仿的中间状态，则势必对全球环境基金的。 GST标签的版本的这种突变蛋白表达和纯化从E.大肠杆菌 ，势必谷胱甘肽琼脂糖珠和沉淀活跃未处理和刺激细胞裂解全环基金。作为最全环基金被激活，通过翻译后修饰或释放抑制绑定，他们的活动状态被保留在细胞裂解物，他们可以通过检测此法8。捕获的蛋白质可以被探测已知的全环基金通过检测特异性抗体，用免疫印迹，或通过质谱分析，以确定某种刺激激活的未知全环基金。
Protocol
1。 大肠杆菌的转型大肠杆菌与PGEX-RhoA蛋白（G17A）结构
- 准备LB琼脂溶解在100毫升DH 2 O 2.5克LB和1.5克琼脂高压灭菌和冷却估计50-55°C，这作为一个经验法则，是当烧瓶可以舒适举行。
- 准备氨苄青霉素（Amp）的股票，通过溶解在DH 2 O 50毫克/毫升注射器过滤器和冻结闲置等分。从1.1 LB琼脂加入100安培股票μL（终浓度为50微克/毫升）。涡流混合，倒入10厘米细菌菜（15-20毫升/皿）。允许它巩固（15-30分钟）和4未使用的板倒°C间储存为2-3周。
- 改造E。大肠杆菌 ，快速解冻DH5α感受态细胞分装在冰浴。新增1μlpGEXRhoA（G17A）稀释至25-50 ng /μl的DNA的。轻弹管混合并在冰上孵育30分钟。在42℃热休克45秒和地方上冰2分钟。新增900万亩，L SOC培养基，用颤抖的增长在37°C一小时
- 50-100μl转化细菌的传播LB琼脂放板使用巴斯德吸管弯曲无菌。在37℃培养箱中孵育板右侧5分钟，然后反转和成长过夜。
- 板准备的GST标签蛋白（步骤2.1）将有所回升，从一个单一的殖民地。以供将来使用，包装和储存板倒在4°C，约3个星期。此外，细菌的股票，可以更长时间的存储准备在2毫升无菌的LB放大器在37°C过夜，用颤抖的日益增长的个人殖民地。混合等分无菌甘油以1:1的比例，并冻结80％-80°C。
2。制备GST-RhoA蛋白（G17A）珠
- 准备加入25克磅到1升卫生署2 0和灭菌LB。当冷却，加入50μl的放大器，从股票到50毫升LB（50μg/ ml的最终浓度）。接种与一个孤立的山坳ony转化细菌和增长在37°C，搅拌过夜。当全密度（OD值600> 1.0）稀释450毫升LB放大器和一个额外的30分钟增长在37°C。
- 准备通过溶解在10毫升DH 2 O 0.238Ğ100毫米原液的异丙基BD-硫代半乳糖苷（IPTG）在分装储存于-20°C诱导细菌产生Rho蛋白加入500μLIPTG的100毫米至500毫升的文化（终浓度为100μm）。温度降低到22-24℃，成长为〜16 H小时。
- 10分钟的自旋文化在4°C，在3600Ğ如果需要的话，500毫升的文化可分为50毫升离心管。冻结颗粒（S）至少1小时（或最好过夜），在-80°C。
- 准备200毫升裂解液中含有20毫米肝素钠（0.95克）/ pH值7.5; 150 mM氯化钠（1.75克）; MgCl 2的 5毫米（0.203克），1％TX-100（2毫升）。准备1M DTT（1.542克10毫升DH 2 O的股票解决方案）和100毫米PMSF（0.174 g/10毫升乙醇）。准备裂解液+，补充10毫升为1mM DTT（10微升）的股票和1毫米PMSF（100μL的股票）和一个完整的迷你蛋白酶抑制剂片。
- 冰工作，加入裂解液10毫升+从步骤2.3颗粒。悬浮彻底温和涡旋和吸取。避免起泡。超声波清洗1分钟，有50％的脉冲4冰。在15,000-20,000Ğ旋转声振裂解液在4°C 15分钟，取出澄清的超声粉碎（上清）无菌管上限15毫升。
- 准备轻轻含有75％到15毫升管的泥浆和转移335μL混合原管谷胱甘肽琼脂糖凝胶。使用大口径的尖端吸取珠。加入10毫升冷PBS，旋转500克为5分钟，在4°C。弃上清，加入1 mL裂解液+珠和自旋为以前的洗。弃上清，加入裂解液+，使50％的泥浆。
- 加入250μL的角球从2.5步上清ibrated珠浆。在4°C旋转45分钟。
- 准备500毫升哈佛商学院，含有20毫米肝素钠（2.38克）/ pH值7.5和150 mM氯化钠（4.38克）在DH 2 O准备1M氯化镁2 DH 2 O的 10毫升（0.952克）和1M DTT（1.542克）10毫升DH 2股票解决方案。准备哈佛商学院+，补充100毫升，只是在使用前用5毫米MgCl 2的现货（50μL）和1 mM DTT（100μL股票）。
- 旋转5分钟从2.7步珠在4°C，500克倒掉上清，洗珠2X裂解液+ 10毫升，10毫升沸+和2倍。最后一次洗涤后重新悬浮在哈佛商学院的珠子+辅以BD BaculoGold蛋白酶抑制剂（20μL50X的BD BaculoGold /毫升），使50％的料浆。
- 稀释10μl2X Laemmli样品含有β-巯基乙醇的缓冲准备最后的珠子的。使牛血清白蛋白（BSA）的标准。使用2毫克/毫升股票（BSA的0.02克10毫升DH 2 O）的。 10μL股票混合10微升的Laemmli（最后20微克）; 5μL5μLDH 2 O和10μL的Laemmli（最后的10微克）的股票;和2.5微升7.5μLDH 2 O和10μL的Laemmli股票（最后5微克）。煮沸所有样品（5分钟）。旋珠样本和运行上清与BSA的标准和10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分子量标记。
- 在10毫升醋酸，40 mL甲醇和50毫升DH 2准备（0.1克）和脱色液（500毫升，400毫升的甲醇和醋酸100毫升DH 2 O的 ）Comassie蓝染色。在室温下储存。凝胶染色20-30分钟，去除染料（可重复使用多次）和脱色液冲洗两次。继续脱色轻轻摇动几个小时，直到乐队都清晰可见。
- 估计耦合珠BSA的标准作为参考（ 图2）使用浓度的GST-RhoA蛋白（G17A）。 aliquot的等量含1.5毫升微型离心管〜10-15微克蛋白珠。商店珠在4°C，在一天之内使用。冻结在-80°在哈佛商学院的C + + /甘油以3:1的比例，在几天之内使用。
3。全球环境基金Pulldown分析核苷酸RhoA蛋白（G17A）珠
- 增长在10厘米的菜汇合的细胞。血清剥夺至少3个小时的治疗需要。
- 在步骤2.4准备裂解液+。准备足够的裂解液700μL/碟，再加上一些额外的金额，以便吸取错误。使用前加入蛋白酶抑制剂。
- 冰工作，从菜培养基，用冰冷的哈佛商学院。删除所有的哈佛商学院和700μL裂解液+添加到每一道菜。旋流板，涵盖所有领域，刮去，并收集到编号为1.5毫升管裂解。自旋为1分，在4°C 15,000Ğ将用于检测上清。
- 如果你的手机号码是相当于在所有菜被测试，你可以省略做蛋白检测，并移动到步骤3.5。否则每个使用Bio-Rad公司的快速蛋白测定上清液蛋白浓度测量和均衡数量和浓度上清液。总蛋白量取决于（通常1-1.5毫克LLC-PK1细胞蛋白）的细胞类型。
- 取出30μL2X减少Laemmli样品缓冲液，煮沸30μl每个上清和混合的步骤3.7作废。剩余的上清加入GST-RhoA的珠（G17A）从步骤2.12等分。 45分钟旋转4°C。
- 旋转10秒珠在4°C，在6800Ğ弃上清，珠裂解缓冲液洗3倍，在同样的方式之间的洗涤纺纱。彻底清除最后洗净，用1毫升注射器装上了地下30针，并添加20μL的2X减少Laemmli样品缓冲液。煮沸5分钟。旋转球珠和运行上清立即（最好）或存储它ţ-80℃，以后进行分析。
- 运行20μL总细胞裂解物对你正在研究全球环境基金的规模适当比例的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和沉淀的蛋白质样品。通过Western印迹使用特异性抗体检测您所选择的全球环境基金。
4。代表结果
该协议第1部分和2描述GST-RhoA蛋白通过SDS-PAGE（见协议大纲图1），再加上谷胱甘肽琼脂糖珠和其测试（G17A）的准备。一个典型的考马斯染色凝胶上图2所示。与洗脱的蛋白质样品应包含在约50 kDa的（ 图2，泳道6）单波段。估计该蛋白的浓度可使用BSA参考样品。在图2的例子中，RhoA蛋白（G17A）浓度估计为15μg/10μL。因此，10μL/管分装准备。典型的产量在我们的手是从10毫升细菌裂解15-20微克蛋白。该协议的第3部分介绍了亲和沉淀法（见概述图1）。一个成功的全球环境基金的检测，检测激活的交换因子GEF-H1的图3所示。 RhoA的蛋白（G17A）抓获一些GEF-H1的对照组（未处理）细胞裂解，表明GEF-H1的基底活动。但是金额沉淀在细胞增加与炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）治疗，肿瘤坏死因子-α激活GEF-H1的5,7与概念一致。重要的是，总的细胞裂解类似GEF-H1基因在控制和治疗的样品量，暗示治疗，并没有改变GEF-H1的水平，并在实验中使用的输入是平等的。
图1。协议的概述。
图2。代表珠准备协议的结果。一个成功的GST-RhoA蛋白（G17A）珠准备考马斯染色凝胶。使用10％的丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分离珠样品和BSA蛋白标准。为了测试的珠子，10μL含有GST-RhoA蛋白（G17A）最后珠浆稀释减少Laemmli样品缓冲液和水煮5分钟1:1。珠纺简要上清液装入凝胶。被装在下面的示例：1巷：分子量（兆瓦）（FroggaBio BLUeye预染蛋白质梯）;泳道2-4：牛血清白蛋白（BSA）5，10和20微克; 5巷空巷6：10 μL新鲜配制的RhoA蛋白（G17A）珠。完成分离后，凝胶用考马斯蓝染色后脱色，揭示蛋白质。 GST-RhoA的蛋白（G17A）的分子量约为50 kDa和运行约48 kDa的标记水平。在这个特别的样品GST-Rho蛋白的浓度据估计，约15μg/10μL浆。
图3。代表GEF激活作用的检测显示TNF-α诱导活化的GEF-H1。 5分钟与10 ng / ml的TNF-α的融合的LLC-PK1细胞治疗。治疗后的细胞裂解和活跃全环基金使用的GST-RhoA蛋白（G17A）约束珠被抓获。使用反GEF-H1的抗体（Cell Signaling公司）与西方印迹检测沉淀蛋白质（顶部印迹）和总细胞裂解样品（底部印迹）GEF-H1的存在。请注意在相对等效输入与非治疗细胞TNF-α治疗的沉淀GEF-H1的增加额，说明一个成功的结果。
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图4。一个“糟糕的结果”。虽然全球环境基金下拉检测导致一些珠拍摄的GEF-H1的，金额从控制沉淀和TNF-α处理的细胞是相同的。因此，肿瘤坏死因子-α，知道在这种情况下，激活了GEF-H1基因没有诱导激活。随后的故障排除在这个特殊的实验表明，TNF-α的使用是不是够新鲜，可能退化。
Discussion
这里介绍的方法是唯一可用的激活全环基金，可以按照细胞中环基金的积极池非放射性检测。该法是类似以下的小GTP酶的激活以及对Rac和Cdc42全环基金用于检测的降水。这些实验使用不同的GST标签蛋白，并从此处所述的略有差异，但基本步骤是相同的。因此，这个协议可以很容易地被改编为其他小GTPase和GEF激活检测。
最近提出的全球环境基金法修改为9,10核分数申请。随着进一步的修改，在细胞内的其他车厢的GEF激活的测试可能也是可能的。
我们使用该方法的研究激活上皮细胞系5,6,7全环基金。随着一些优化，此法应该是足够的，以检测任何细胞株的全环基金。当adapti吴到一个特定的细胞类型，找到最佳的细胞数量，裂解液量，为全球环境基金和检测方法进行测试（一个很好的抗体免疫印迹很重要）。检测的初始设置，最好是使用一个被称为激活全球环境基金的利息刺激。使用一个未知的刺激时，总是用阳性对照，以验证您的检测工作。此法可用于检测Western印迹称为全环基金的激活。然而，这也足以识别未知的全环基金。对于这一点，从控制和刺激的样本捕获的全环基金应在考马斯染色凝胶分析。只有在刺激的样本中出现的乐队可能包含激活的全环基金，可用于识别发送质谱（如5）。
最后，一个警示说明。该法的基础上，使全环基金活跃的翻译后修饰细胞裂解后保留的假设。事实上，这显然是CA本身为全环基金的数量，因为它的机构，此法已用于各组检测激活不同的全环基金，包括全球环境基金H1，p115RhoGEF和XPLN（如5,11,12,13）。保存的活跃状态，但是可能不会发生在所有全环基金的情况下，因此，可以想象的是，此法不适用于所有的全环基金。它也必须指出，许多环基金发挥对多个小GTP酶的活性。因此，当一个特定的全球环境基金研究，建议，以配合此法与其他小GTP酶，以及研究RhoA蛋白，Rac1和Cdc42功能研究全球环境基金沉淀检测。
在协议中的关键步骤：
转化细菌菌落应挑选新鲜，适当的准备板，放大器，良好的生长和产量，以确保足够的选择。从其他来源获得的细胞转化的条件可能会有所不同，应谘询。 在4°C水冷解决方案和离心机，应执行协议（从2.3步）的蛋白制备和检测（步骤3.2）的所有步骤。
为了获得均匀的悬浮细菌裂解（2.5步）应该全面和完整的。当裂解细菌，旋涡和吸取裂解交替，同时保持在4°C，并确保超声冰，以防止蛋白质变性。如果使用不同的sonicator模型，条件可能需要进行调整。超声粉碎的珠子孵化应始终在4°C，在肩，以确保足够的约束力，并应小心保持时序一致。
GST-RHO突变有些不稳定时，在细菌中表达，所以最好使用马上或在几天内准备珠。
沉淀法（第三部分）是时间和温度敏感，的主动全环基金可以很容易地从细胞裂解物丢失，这样的步骤，应尽快进行。
以下部分包含了一些故障排除技巧。
没有或突变，在最后的珠子准备RHO蛋白量非常低，这可能会造成低效的诱导，细菌裂解不足，或蛋白质的损失在筹备过程中或存储。为了帮助解决这些可能性，细菌样本进行分析诱导前后。如果是穷人诱导的蛋白质重复使用一个殖民地，从一个新鲜的条纹板或再能干细胞转化的过程。不同的IPTG浓度和诱导时间也应该进行测试。如果裂解不足（即蛋白质仍然代替上清丸）不同的裂解液中的盐和洗涤剂浓度可以尝试。替代超声倍和应考虑设置，前后超声的样品可以通过显微镜检查，以确定裂解效率。
无沉淀，全球环境基金，即使GST蛋白是目前珠：这可能是由于技术问题，在沉淀法，或缺乏真正的研究全球环境基金的使用施加的刺激激活。始终使用已知的刺激作为阳性对照，以验证您的检测工作。在几天之内准备的珠子。如果沉淀法捕捉不到全球环境基金的研究在各种条件下的金额，确认您的全球环境基金是目前是被用来检测（步骤3.3），离心后上清检测。确保所有缓冲区和蛋白酶抑制剂是新鲜的，和冰尽可能快地执行所有步骤。增加输入蛋白量（例如，通过使用从2板/样品的裂解）。如果沉淀实验结果显示，基底降水tation您的全球环境基金，但无明显差异之间的控制和刺激的样品（ 图4），通过验证，应用的刺激工作使用其他已知的影响（例如通过检测的其他信号通路的激活）开始排除故障。考虑改变治疗条件和/或浓度。从文献报告的数据，如何刺激激活RHO或其他信号来预测可能的时间和浓度依赖。优化治疗时间时，使用短期和长期的时间点，作为全球环境基金的激活可能是最好的检测时间点之前以及检测RHO激活。最后，相同的刺激可能会导致不同程度的激活因在细胞反应的变化，引起通道数，细胞汇合，等
Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由加拿大健康研究协会（CIHR）（澳门币97774），自然科学和工程研究理事会，加拿大（NSERC，批NR：480619）。 KS是新研究者奖1 KRESCENT（加拿大，加拿大肾脏病学会和加拿大卫生研究院的肾脏基金会联合奖）和安大略省的研究和创新，从早期的研究者奖的收件人。 fw是由李嘉诚奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop Canada | SOC001.10 | |
| LB | BioShop Canada | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop Canada | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop Canada | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop Canada | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbiochem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD001.10 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| DTT | OmniPur, EMD Millipore | 3860 | Add just before use |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Biosciences | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche Group | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Table 1. Reagents used | |||
| RC-5B centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
| Table 2. Specific equipments used | |||
References
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