La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo. Radiación solar ultravioleta (UVR) es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cataratas. Un modelo animal de lejos catarata inducida por UVR-B fue desarrollado. En este artículo se describen los métodos para la investigación de la formación de cataratas: La exposición a los rayos UV, cuantitativos RT-PCR e inmunohistoquímica.
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Artículo de método
Caracterización de los mecanismos moleculares de la
En este artículo
Resumen
Resumen
La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo 1. La Organización Mundial de la Salud define catarata como una opacidad del cristalino del ojo que impide la transmisión de la luz. La catarata es una enfermedad multifactorial asociada con la diabetes, el tabaquismo, la radiación ultravioleta (UVR), alcohol, radiación ionizante, los esteroides y la hipertensión. Hay una fuerte evidencia experimental 2-4 y epidemiológica 5,6 UVR que provoca catarata. Hemos desarrollado un modelo animal para UVR B catarata inducida en ambos anestesiados 7 y los animales no anestesiados 8.
La única cura para las cataratas es la cirugía, pero este tratamiento no es accesible a todos. Se ha estimado que un retraso de la aparición de cataratas durante 10 años podría reducir la necesidad de cirugía de cataratas en un 50% 9. Para retrasar la incidencia de cataratas, que es necesario para comprender los mecanismos de la formación de cataratas y encontrar estrategia eficaz de prevencióngias. Entre los mecanismos para el desarrollo de cataratas, la apoptosis desempeña un papel crucial en la iniciación de cataratas en los seres humanos y los animales 10. Nuestro enfoque ha sido recientemente apoptosis en la lente como el mecanismo para el desarrollo de cataratas 8,11,12. Se prevé que una mejor comprensión del efecto de la radiación UV en la vía de la apoptosis se proporcionan posibilidades para el descubrimiento de nuevos productos farmacéuticos para prevenir cataratas.
En este artículo se describe cómo catarata puede ser inducida experimentalmente por la exposición en vivo a los rayos UV-B. Además RT-PCR e inmunohistoquímica se presentan como herramientas para estudiar los mecanismos moleculares de la RUV-B inducida por la catarata.
Protocolo
1. La exposición a la radiación ultravioleta
- 15 min antes de la exposición, anestesiar una hembra Sprague-Dawley con una mezcla de 90 mg / kg Ketalar (ketamina) y 10 mg / kg Rompun (xilazina) por inyección intraperitoneal.
- Colocar el animal en un limitador de rata y apretar las correas hasta la inmovilización de la rata sin causar una compresión de tronco 13.
- Infundir Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, en ambos ojos de la rata para inducir midriasis.
- Colocar el animal de modo que un ojo se coloca contra un haz estrecho de radiación UV a 300 nm con un ancho de 14 nm 10 a media altura y proteger el ojo co....
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Resultados
Las diversas fuentes de variación en las mediciones se calcula con un análisis de varianza y se encontró que la consideración de tres mediciones por animal de la varianza para mediciones fue del orden de 15% del de los animales. Así, considerando el análisis de toda la lente, no es posible aumentar la precisión. Pruebas ortogonal dilucidado un contraste estadísticamente significativo para la caspasa-3 mensajes entre 120 intervalo de latencia de horas frente a cortos intervalos de latencia.
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Discusión
En este trabajo se describen los métodos que permiten estudiar los eventos moleculares que ocurren durante la RUV-B inducida por la catarata.
Teniendo en cuenta, que la mayoría de la información disponible para UVR in vivo inducida por catarata se derivó de los experimentos con ratas albinas Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, se decidió utilizar la albinas Sprague-Dawley en el estudio actual. Edad de las ratas fue de seis semanas de edad. El género fue escogido par.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Karolinska KID-financiación, la Autoridad Sueca de Protección Radiológica, Instituto Karolinska Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Eye St. Erik el Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg / ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg / ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Suecia | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg / ml |
| Solución salina equilibrada | Alcon | 0007950055 | |
| 3,5 ul β-mercaptoetanol | |||
| NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total | Macherey-Nagel GmbH & Co, Duren, Alemania | 740.955,50 | |
| cebadores específicos de ADN de p53 | biomers.net GmbH | Una medida que se | |
| Taq ADN polimerasa, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarosa | Sigma | A5093 | |
| El bromuro de etidio solución de 0,5 mg / ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 espectrofotómetro | Productos NanoDrop | ||
| 1 ª Strand cDNA síntesis kit de RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ un solo color en tiempo real PCR sistema de detección | Bio-Rad Laboratories | ||
| Placa de 96 pocillos | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene ensayo de expresión de la caspasa 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene ensayo de expresión para mayores de 18 | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Exfoliados caspasa-3 (Asp175) | Señalización Celular Tecnología | 9661 | |
| Anti IgG de conejo | Abcam | Ab6798 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal microscopio Axioplan 2 Radiología | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehído | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE 10x tampón | Promega | V4251 |
Referencias
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.
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Reimpresiones y permisos
