Summary
Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.
Abstract
Modelli animali di malattie umane sono necessarie per studiare rigorosamente fasi della progressione della malattia e meccanismi associati, e infine, come modelli pre-clinici per testare interventi. In questi metodi, si descrive una tecnica in cui il lipopolisaccaride (LPS) è iniettato nel topo ghiandola mammaria in allattamento tramite il beccuccio, efficace modellazione mastite, o infiammazione, della ghiandola. Ciò si traduce in una maggiore infezione simulati fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, come visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter luciferasi 1.
Il nostro obiettivo finale nello sviluppo di questi metodi era quello di studiare l'infiammazione associata con mastite nella ghiandola in allattamento, che spesso include arrossamento, gonfiore, e infiltrazione di cellule immunitarie 2,3. Pertanto, eravamo consapevoli che incisione o qualsiasi tipo di ferite della pelle, il capezzolo, o la ghiandola per introdurre i LPS possono fermarsinon essere utilizzati nei metodi poiché l'approccio sarebbe probabilmente confondere il read-out di infiammazione. Abbiamo anche voluto uno straight-forward metodo che non ha richiesto appositamente realizzati disegnati a mano pipette o l'uso di micromanipolatori di detenere tali strumenti specializzati in atto. Così, abbiamo deciso di utilizzare una siringa da insulina disponibile in commercio e per iniettare l'agente nel condotto mammaria di un capezzolo intatta. Questo metodo ha avuto successo e ci ha consentito di studiare l'infiammazione associata con iniezione di LPS assenza di effetti addizionali sovrappone il processo di iniezione. Inoltre, questo metodo anche utilizzato un NF-kB reporter di luciferasi di topo transgenico e bioluminescente tecnologia di imaging per mostrare visivamente e quantitativamente maggiore NF-KB di segnalazione all'interno della ghiandola iniettato LPS-4.
Questi metodi sono di interesse per i ricercatori di molte discipline che desiderano malattia modello all'interno della ghiandola mammaria durante l'allattamento, in quanto in ultima analisi, la tecnicaqui descritto potrebbe essere utilizzato per l'iniezione di un certo numero di sostanze, e non è limitato a solo LPS.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Vanderbilt University e del Comitato Istituzionale uso.
1. Preparazione di topi transgenici
- Topi femmina, positivo per la (N F-kB-G FP-L uciferase) giornalista transgene NGL (descritto in precedenza 1) vengono utilizzati per questa procedura. Quando le femmine sono almeno 6 settimane di età, li accoppiarsi con un maschio FVB tipo selvatico. Harem di allevamento possono essere utilizzati (fino a 4 femmine in una gabbia con 1 maschio). (Nota: topi FVB ceppo sono stati utilizzati per lo studio attuale topi ceppo scuri come C57Bl6 possono anche essere utilizzati, ma questi topi deve essere rasata prima imaging.).
- A partire da 15 giorni dopo l'accoppiamento, le femmine controllare regolarmente per i segni di gravidanza (grande circonferenza sporgente). Ogni femmina deve essere separato una volta in stato di gravidanza e il maschio tolto dalla gabbia di allevamento una volta che l'ultima femmina rimane incinta.
- Guarda le femmine separate di und notare la data di nascita, quando una cucciolata compare. Un disordine di almeno 6 cuccioli è necessario per l'allattamento adeguato. Otto giorni dopo la nascita della cucciolata, procedere con il protocollo (vedere la Figura 1 per uno schema temporale).
2. Preparazione per iniezione
- Sciogliere la E. coli LPS in PBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. 50 pl di questa soluzione, o un totale di 5 pg, verrà iniettato nella ghiandola mammaria. Preparare un secondo tubo di PBS solo da utilizzare per il controllo dell'iniezione.
- Set-up di un ambito dissezione e apparecchiature per l'anestesia isoflurano. Un naso-cono apparecchio deve essere fissato alla fase della portata dissezione cui il mouse viene posizionato. Una sorgente di luce buona, se dallo stesso campo di applicazione o da faretti supplementari dovrebbe anche essere preparato.
- Una volta che il set-up, avviare la macchina isoflurano e il flusso d'aria.
3. Iniezione intraduttale di LPS
- Caricare la siringa corta dell'ago con 50 microlitri della soluzione di LPS. Impostare questa parte.
- Anestetizzare il mouse per essere iniettato in primo luogo mettendo la femmina in una scatola piena di isoflurano e poi una volta che la respirazione è rallentata, il suo muoversi sul palco e mettere il naso all'interno del naso-cono. Utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Monitorare il respiro del mouse durante tutta la procedura e regolare il livello isoflurano di conseguenza. La gabbia che contiene la cucciolata di cuccioli che la femmina è stata presa dal deve essere attentamente da parte fino alla diga può essere restituito dopo la procedura.
- Utilizzare una piccola goccia di etanolo al 70% per rendere il pelo distesi e per aiutare a visualizzare il capezzolo attaccato a destra # 4 ghiandola mammaria inguinale sul basso ventre del mouse.
- Mettere a fuoco la portata dissezione per una visione ottimale del capezzolo. Usare con attenzione una serie di una pinza sottile per disegnare ulteriormente il capezzolo dalla pelle, ma non forare o danneggiare il capezzolo in alcun modo. Ilpinza non deve mai essere fissata solidamente insieme quando la manipolazione del tessuto, ma utilizzato con una presa luce che richiede la minima quantità di stress sul capezzolo.
- Utilizzare la pinza nella mano sinistra per tenere delicatamente il capezzolo in posizione. Portare lentamente la siringa precaricata nel campo visivo con la mano destra. La siringa deve essere mantenuta in modo che nessun riposizionamento deve avvenire in modo da iniettare il contenuto.
- Una volta che la siringa è in vista, mirano attentamente la piccola apertura duttale nel centro del capezzolo, e inserire la siringa.
- Senza riposizionare la mano, iniettare il contenuto della siringa e rimuovere l'ago dal capezzolo.
- Caricare una seconda siringa con 50 pl di PBS per il controllo dell'iniezione. Riposizionare il mouse sul palco e per la vista migliore della sinistra # 4 capezzolo inguinale ghiandola mammaria al di là del basso addome del mouse. Ripetere i passaggi 3,4-3,7 con il PBS-caricato siringa.
- Una volta che entrambe le iniezioni sono complete, interrompere l'anestesia e spostare il mouse in una gabbia di recupero. Monitorare la femmina per assicurarsi che lei diventa mobile entro 5 minuti. Permettono il mouse per rimanere nella gabbia di recupero per 1 ora. Dopo 1 ora di recupero, disporre di nuovo la femmina nella gabbia con la sua cucciolata di cuccioli. I topi devono essere controllati periodicamente per 6 ore dopo l'iniezione, prima di procedere con l'imaging. Nella nostra esperienza, senza conseguenze negative sono state rilevate sia nel femminile o dei cuccioli nel periodo compreso tra l'iniezione e di imaging. Tuttavia, se i segni di sofferenza si osservano nella femmina (es. postura ingobbita, mordere o guardia del sito di iniezione, letargia generale) o di cuccioli (nessun movimento, il colore bluastro della pelle), l'esperimento deve essere interrotto.
4. Bioluminescent Imaging Per visualizzare NF-kB Attività
- Una volta che i topi sono stati trasportati alla struttura di imaging, avviare la procedura di imaging aprendo il software e l'inizializzazione della macchina. Accendere il èmacchina oflurane e flusso d'aria, assicurando che l'anestesia fluisce sia la scatola e la camera di imaging.
- Posizionare il mouse in anestesia isoflurano nella casella anestesia chiaro. Una volta che ha rallentato la respirazione, utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Poi, iniettare 100 ml di substrato luciferina nel mouse da retro-orbitale iniezione 5 utilizzando una siringa sterile.
- Trasferire immediatamente il mouse per la camera di imaging e mettere il naso sotto il naso isoflurano cono si trova lì. Il mouse deve essere supino. Fissare ogni piede sul palco con nastro adesivo.
- Ingresso le impostazioni corrette al software IVIS di prendere sia un immagine in bianco luce fotografica e un'immagine dell'attività bioluminescenti. Il tempo di esposizione deve essere di 10 secondi. Acquisire l'immagine.
- Una volta che le immagini sono state acquisite, consentono il mouse per recuperare e quindi inserire la schiena nella gabbia con i suoi cuccioli e monitorare periodicamente.
- La fotografico e luminescenteimmagini vengono automaticamente sovrapposti e visualizzati sullo schermo, come in Figura 2. Analizzare le immagini acquisite ponendo regione di interesse o "ROI" cerchi di grandezza uguale su ciascun lato del basso addome del mouse (uno sopra la ghiandola PBS-iniettata e uno sopra l'LPS-iniettato ghiandola). Impostare la lettura ai fotoni. Un numero deve essere visualizzato indica la luminescenza rilevata all'interno di ogni ROI (vedere la Figura 2B). Utilizzare questo numero nell'analisi statistica.
- Per visualizzare l'immagine ottimale, regolare ulteriormente la soglia del segnale visualizzato. Questo non modificherà la luminescenza totale lettura, ma vi permetterà di rimuovere segnale di fondo e visualizzare le differenze tra il controllo e la LPS-trattati ghiandola. Ridurre la quantità di luminescenza mostrato fino alla ghiandola PBS-iniettato è privo di segnale di fondo. Questo dovrebbe lasciare il segnale aumentato nella ghiandola LPS-trattata ancora visibili nell'immagine, come visto nella Figura 2.
- AdditionaL analisi, comprese proteine e analisi dell'RNA, può essere completato con tessuto mammario raccolti dalla femmina post-mortem 6.
5. Risultati rappresentativi
Per ottenere risultati interpretabili da questi metodi, LPS (o PBS) deve essere infuso solo nei dotti mammari, lasciando il tessuto adiacente indisturbati. Iniezione nel tessuto sottocutaneo circonda il capezzolo comporterà infiammazione a causa di un danno più che l'infezione simulata. Iniezione di trypan blu colorante diluito in PBS è utile quando si impara la tecnica. Figura 3A mostra una ghiandola successo iniettato infuso con 100 ml di tripan blu in PBS. Come mostrato, solo l'albero duttale deve essere riempito con la soluzione iniettata, e non dovrebbe essere bolo al sito di iniezione. Un "bolo" in questo contesto è un accumulo di liquido iniettato il capezzolo o nel tessuto che circonda il capezzolo senza infusione nell'albero duttale. Questo è shproprio in Figura 3B. Si noti che le iniezioni pratica illustrate nella Figura 3 sono stati completati in una femmina al giorno 21 di lattazione. Durante l'altezza di lattazione (giorni 8-10, la fase in cui viene iniettato LPS utilizzando il protocollo corrente), il latte è abbondante ed è difficile visualizzare i dotti e determinare se l'iniezione è stata completata correttamente. Pertanto, i punti più tardi di orario di allattamento sono migliori per le iniezioni di pratica.
Iniezione di LPS successo nei risultati mammarie condotti in un aumento di NF-kB attività all'interno della ghiandola. Questo dovrebbe essere evidente nel topo giornalista upon IVIS imaging, e la ghiandola LPS-iniettato dovrebbe avere sostanzialmente più alta attività di luciferasi (misurata mediante conteggio di fotoni) rispetto al PBS-iniettato ghiandola, come mostrato nella Figura 2 (in media, la ghiandola LPS legge 200% del segnale di controllo PBS). Un aumento statisticamente significativo di luminescenza nelle ghiandole LPS-trattati come compAred al controllo controlaterale è stato raggiunto con la realizzazione di un gruppo di 4 topi 4. Un ulteriore studio ha inoltre utilizzato intraduttale iniezione mammaria di una E. coli o LPS in NF-kB giornalista transgenici. Simile al nostro lavoro, questi autori ha visto un aumento significativo dell'attività giornalista 6 ore dopo E. coli iniezione 2.
Si prega di notare, a causa costitutiva di NF-kB attività del cervello e di altri organi addominali, le teste e addomi dei nostri topi reporter dimostrano costantemente un segnale quando ripreso, anche al basale prima di qualsiasi manipolazione. Così, questo segnale deve essere ignorato per quanto riguarda questo esperimento. Un segnale evidente dovrebbe rimanere entro il LPS-iniettato ghiandola mammaria dopo la lettura dell'immagine viene regolato per ridurre al minimo luminescenza di fondo nella ghiandola PBS. Figura 2 mostra le immagini con lo sfondo ridotto.
Iniezione riuscita della ghiandola volontàpiù probabile risultato danni al capezzolo. Questo farà sì rilevato, a livello di infiammazione della pelle che sarà evidente upon imaging. Questo tipo di segnale ferimento sarà molto forte e limitato alla zona del capezzolo dove il danno, non emana tutta la ghiandola, come visto dopo una iniezione di successo LPS nei condotti.
Figura 1. Schema di procedura.
Figura 2. Risultati rappresentativi IVIS bioluminescente imaging. (A) immagine acquisita con sfondo ridotta, rivelando aumento dell'attività luciferasica nel LPS-iniettato ghiandola. (B) Immagine da A con regione di quantificazioni di interesse aggiunto. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3 iniezione pratica:.. Ghiandola mammaria iniettato colorante mediante iniezione intraduttale Per verificare la precisione della consegna attraverso il capezzolo, un topo al giorno 21 di lattazione è stato iniettato con 100 ml di colorante blu tripano diluito in PBS. Seguendo sacrificio, la ghiandola è stato esposto per la visualizzazione. (A) iniezione di successo e (B) bolo di colorante al capezzolo.
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Discussion
Qui ci avvaliamo di un transgenico NF-kB topo giornalista e una tecnica di iniezione ottimizzata per mastite modello, infiammazione del tessuto mammario più comunemente causata da un'infezione batterica. La fase più critica in questa procedura è la stessa iniezione intraduttale.
In pratica, di solito è evidente se l'iniezione intraduttale ha avuto successo. L'iniezione di agenti (LPS o PBS) dovrebbe sentire fluido e ci dovrebbe essere poca o nessuna resistenza come la siringa viene svuotato. L'insidia più comune è un danno per il capezzolo che porta al passaggio ostruito nella ghiandola. Questo può essere visualizzato guardando il capezzolo attraverso l'ambito dissezione. Danni possono essere evitati pratica sufficiente, delicatezza durante la manipolazione del capezzolo, e assicurando che solo il più piccolo di aghi (31G o superiore) viene utilizzato per eseguire la procedura. Inoltre, se l'ago non è posizionata correttamente, o se scivola mid-iniezione, una generazione-Up di LPS o PBS possono formare al sito di iniezione e il liquido non penetrerà i condotti. In questo caso, si può sia vedere visivamente l'accumulo di liquido nella pelle intorno al capezzolo, o l'iniezione non si sente fluido. Sebbene questa trappola non può essere totalmente eliminato, eventi può essere evitato per la maggior parte dalla pratica e attraverso l'uso di strumenti adeguati.
La tecnica utilizzata per l'iniezione è critico per questo particolare esperimento. Alcuni metodi pubblicati per iniezione intraduttale nella ghiandola mammaria richiedono taglio / rimozione del cappuccio e / o incisione attraverso la pelle 7,8. In questo caso, come end-point primario dello studio era di determinare NF-kB infiammazione connesso all'interno della ghiandola, eventuali incisioni o perturbazione della pelle o del capezzolo sono indesiderabili e indurrebbe un segnale infiammatorio dovuto al danno tissutale che confondere il segnale indotto da LPS.
Inoltre, la nostrainiezione è stata completata con una siringa da insulina commercialmente disponibili e senza l'uso di una micropipetta o disegnato micromanipolatori, come in molti altri metodi per iniezione che non utilizzano la rimozione capezzolo 9, 10. Riteniamo che questo è stato possibile solo perché il capezzolo durante l'allattamento è leggermente allargata e un po 'più facile da iniettare di un giovane, capezzolo del mouse vergine. Per iniettare topi vergini, strumenti più rigorosi possono essere richiesti.
È chiaro dalla figura 2 che, se correttamente eseguita, iniezione di LPS nei condotti della ghiandola mammaria topo provoca infiammazione localizzata come visualizzato da un aumento dell'attività di NF-KB reporter luciferasi. Altri hanno analizzato più ampiamente questo modello di mastite acuta, attraverso sia E. coli o iniezione di LPS nella ghiandola mammaria e successiva analisi del tessuto 2-3, 8, 10-14. Tra i molti risultati, questi studi dimostrano che la risposta infiammatoria is modulata da interazioni con CD14, e che si traduce in un afflusso neutrofili regolata da mammarie macrofagi alveolari. Come suggerito in precedenza sia nostro lavoro pubblicato 4, così come quella degli altri due questo modello di mastite possono essere ulteriormente utilizzati per studiare i meccanismi e terapie importanti nell'uomo, in cui ben il 3-33% delle donne in allattamento soffrono di questa infezione dolorosa (percentuale varia in base alla metodologia di studio) 15. Infine, può essere un utile strumento di ricerca per gli operatori del settore lattiero-caseario, dove mastite è una malattia costosa che porta a perdite significative nella produzione di latte ogni anno 16.
Infine, i topi transgenici LGN giornalista utilizzati qui e similmente i topi funzionamento del reporter HLL 17 sono stati utilizzati in numerosi studi per verificare, quantificare e monitorare la regolazione o giù di NF-KB attività all'interno di una varietà di malattie e modelli di sviluppo compreso acuta polmonelesioni, il cancro del polmone, delle vie aeree morfogenesi ramificazione, insulino-resistenza, obesità, e infarto del miocardio 1, 17-21. Questo modello fornisce un ulteriore esempio dell'utilità di questi transgenici reporter.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH CA113734 assegnato a F Yull e il Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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