Summary
Описанная здесь техника, в которой липополисахарида вводят в кормящих молочных желез мышей через соску, чтобы имитировать мастит, состояние обычно вызывается бактериальной инфекцией. Липополисахаридом инъекций приводит к увеличению ядерного фактора каппа В (NF-kB) сигнализации, визуализировали через биолюминесцентного изображений NF-kB мыши люциферазы репортера.
Abstract
Животные модели заболеваний человека являются необходимыми для того, чтобы строго изучать стадии прогрессирования заболевания и связанные с ними механизмы, и в конечном итоге, как доклинических моделях для проверки вмешательства. В этих методов, мы описываем технику, в которой липополисахарида (ЛПС) вводят в кормящих молочных желез мышей через соску, эффективного моделирования мастит, или воспаление, железы. Это результаты моделирования инфекции к увеличению ядерного фактора каппа В (NF-kB) сигнализации, а визуализируется через биолюминесцентного изображений NF-kB мыши репортер люциферазы 1.
Наша конечная цель в развитии этих методов является изучение воспаления, связанные с маститом в кормящие железы, которые часто включают покраснение, отек и инфильтрация иммунных 2,3. Таким образом, мы четко осознаем, что разрез или любой тип повреждения кожи, сосков, или железы с целью введения ЛПС можетНе быть использованы в наших методов, поскольку подход, вероятно, смешал чтения из воспаление. Мы также желаемый прямым методом, который не требует специально рисованной пипетки или использование микроманипуляторами, чтобы держать эти специализированные инструменты на месте. Таким образом, мы намерены использовать имеющиеся в продаже инсулиновый шприц и впрыснуть агента в молочных проток нетронутыми соска. Этот метод был успешным и позволил нам изучить воспаление, связанное с введением ЛПС без каких-либо дополнительных эффектов накладывается процесс инъекции. Кроме того, этот метод также используется NF-kB люциферазы репортера трансгенные мыши и биолюминесцентного технологий визуализации визуально и количественно показать увеличилась NF-kB сигнализации в LPS впрыском железы 4.
Эти методы представляют интерес для исследователей из многих дисциплин, которые хотят моделью болезни в течение кормящих молочных желез, а в конечном счете, техникаописанные здесь, могут быть использованы для введения ряда веществ, и не ограничивается только ЛПС.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Университета Вандербильта Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Подготовка трансгенных мышей
- Самки мышей, положительный для СУГ (N F-kB-G FP-L uciferase) репортер трансгенов (описанные ранее 1) используются для этой процедуры. Когда женщины по крайней мере 6 недель, спариваются с ними FVB диких мужскому типу. Гарем разведения могут быть использованы (до 4 женщин в клетку с 1 мужчина). (Обратите внимание: FVB мышей штамма были использованы для настоящего исследования Темнее штамм мышей, таких как C57BL6 также может быть использован, но эти мыши должны быть бритые до визуализации.).
- Начиная с 15 дней после спаривания, проверьте женщин регулярно признаки беременности (большой выступающей обхвате). Каждая женщина должна быть отделена раз беременна и мужской удалены из разведения клетке один раз последняя женщина становится беременной.
- Смотреть отделить женщинD обратите внимание на дату рождения, когда мусор появляется. Помет по крайней мере 6 щенков необходим для адекватной лактации. Спустя восемь дней после рождения помета, приступить к протоколу (см. Рисунок 1 схематически график).
2. Подготовка к инъекции
- Растворите E. палочки LPS в PBS до конечной концентрации 0,1 мкг / мкл. 50 мкл этого раствора, или в общей сложности 5 мкг, будет вводится в молочную железу. Подготовить вторую трубку PBS в покое, чтобы быть использованы для контроля инъекции.
- Установки рассекает сферу и ИФ оборудования анестезии. Нос-конус аппарата должна быть обеспечена на стадии рассекает сферу, где мышь будет размещен. Хорошим источником света, то ли из сферы самого или от дополнительных прожекторов также должны быть готовы.
- После установки, запустите программу изофлуран машины и воздушного потока.
3. Внутрипротоковые инъекции LPS
- Загрузите короткие иглы шприца с 50 мкл раствора ЛПС. Установите эту сторону.
- Anesthetize мыши, который будет введен сначала размещении женщины в изофлуран заполнить поле, а затем один раз дыхание замедляется, переместить ее на сцену и поместить нос в нос конус. Используйте ноги щепотку, чтобы подтвердить мышь полностью под наркозом. Монитор дыхания мыши на протяжении всей процедуры и регулировать уровень изофлуран соответственно. Клетку, содержащую помет щенков, которые женщина была взята из Следует тщательно отложите до плотины могут быть возвращены после процедуры.
- Используйте маленькую каплю 70% этанолом, чтобы сделать пальто лежал и помочь себе соски прикреплен к правой № 4 паховых молочных желез на нижней части живота мыши.
- Фокус рассекает возможности для оптимального обзора из соска. Осторожно использовать набор тонких щипцов для дальнейшего вытянуть сосок от кожи, но не прокол или травмировать сосок в любом случае.щипцы никогда не должны быть плотно зажаты вместе, когда манипулирование тканей, но используется с легкой удержания, которая требует минимального количества нагрузку на соски.
- Используйте пинцет в левую руку, чтобы аккуратно удерживать соску на место. Медленно довести предустановленной шприца в поле зрения с помощью правой руки. Шприц должен быть проведен так, чтобы не репозиционирование должно произойти для того, чтобы придать содержание.
- После шприц в виду, прицеливаясь на небольшой проток открытия в центре соска, а затем вставьте шприц.
- Без изменения положения рук, вводят содержимое шприца и извлеките иглу из соска.
- Загрузите второй шприц с 50 мкл PBS для управления впрыском. Переместите мышь на сцене и за лучший вид на левый № 4 паховых сосков молочных желез на другой стороне нижней части живота мыши. Повторите шаги с 3,4 до 3,7 помощью PBS-загруженных шприц.
- После того как инъекции в сбореETE, прекратить анестезию и переместите мышь, чтобы восстановление клетке. Мониторинг женский чтобы убедиться, что она становится мобильным в течение 5 мин. Разрешить мыши, чтобы остаться в восстановлении клетке в течение 1 часа. Через 1 час подъема, поместите женщин обратно в клетку с ее помет щенков. Мыши следует периодически контролировать в течение 6 часов после инъекции прежде чем приступить к визуализации. По нашему опыту, никаких негативных последствий было отмечено ни в женской или щенков в период между впрыском и изображений. Однако, если признаки бедствия наблюдаются в женских (например, сгорбленная осанка, кусаться или охрана месте инъекции, общая вялость), или щенков (нет движения, голубоватый цвет кожи) эксперимент должен быть прекращен.
4. Bioluminescent изображений для визуализации NF-kB активность
- После мышей были перевезены в изображение объекта, начинается процесс создания образа, открыв программного обеспечения и инициализации машины. Включите являетсяoflurane машины и воздушного потока, гарантируя, что анестезия течет как к коробке и изображения камеры.
- Наведите под наркозом изофлурана в прозрачной коробке анестезии. Как только дыхание замедлилось, используют ноги щепотку, чтобы подтвердить мышь полностью под наркозом. Затем вводят 100 мкл субстрат люциферин в мышь, ретро-орбиту 5 с помощью стерильного шприца.
- Немедленно передать мыши на изображение камеры и поместить ее нос под нос изофлуран конуса, расположенных там. Мышь должна быть на спине. Закрепите каждую ногу на сцене с лентой.
- Введите соответствующие настройки в программном обеспечении ИВИС принять как белый свет фотографическое изображение и изображение биолюминесцентного деятельности. Время экспозиции должно быть 10 сек. Приобретать изображения.
- Как только изображения были приобретены, позволяет мыши, чтобы восстановиться, а затем поместить ее обратно в клетку с ее щенками и контролировать периодически.
- Фотографические и люминесцентныеИзображения автоматически накладываются и на экране, как показано на рисунке 2. Анализ полученных изображений путем размещения области интереса или "ROI" круги одинакового размера на каждой стороне нижней части живота мыши (один над PBS-инъекции железа и один над LPS-инъекции железы). Установите для чтения, чтобы фотоны. Число должно отображаться с указанием люминесценции обнаружена в пределах каждого ROI (см. Рисунок 2B). Используйте этот номер в статистическом анализе.
- Для отображения оптимального изображения, дополнительно настроить порог сигнала отображается. Это не изменит общей люминесценции считывания, но позволит вам удалить фоновый сигнал и визуализировать различия между контролем и LPS-лечение железы. Уменьшите количество люминесценции показано, пока PBS-инъекции железы без фонового сигнала. Это должно оставить повышенный сигнал в LPS-прежнему рассматривается железы проявляется в изображении, как показано на рисунке 2.
- Additionaл анализ, в том числе белков и РНК анализы, может быть укомплектован ткани молочной железы собранных из женских посмертного 6.
5. Представитель Результаты
Для получения интерпретации результатов этих методов, LPS (или ФСБ) должны быть пронизаны только в молочных протоков, в результате чего соседние ткани нетронутыми. Инъекция в подкожной ткани вокруг соска может привести к воспалению из-за травмы, а не моделируемых инфекции. Инъекции трипанового синего красителя разводят в PBS является полезным при изучении техники. 3А показывает, успешно вводят железы переплетаются с 100 мкл трипанового синего в PBS. Как показала практика, только протоковой дерево должно быть заполнено вводят раствор, и не должно быть никаких болюса в месте инъекции. "Болюс" в данном контексте является накопление закачиваемой жидкости на соски или в ткани вокруг соска без вливания в протоковой дерева. Это шсобственные на рисунке 3b. Пожалуйста, обратите внимание, что практика инъекций показано на рисунке 3 были завершены в женский на 21-й день лактации. На пике лактации (день 8-10, на какой стадии LPS вводится с использованием текущего протокола), молоко в изобилии, и трудно представить себе каналы и определить, если инъекция была завершена корректно. Таким образом, позднее пунктов в период лактации лучше для практики инъекций.
Успешное введение LPS в молочных протоков в результатах увеличилось NF-kB деятельности в железе. Это должно быть очевидным в репортеру мыши на ИВИС изображения, и LPS-инъекции железа должна быть значительно выше активности люциферазы (измеряется счета фотонов), чем PBS впрыском железы, как показано на рисунке 2 (в среднем железы LPS читает 200% сигнала управления PBS). Статистически значимое увеличение люминесценции в LPS-лечение желез Compared на противоположной контроль был достигнут несмотря на завершение группу из 4 мышей 4. Еще одно исследование также использованы внутрипротоковые молочной инъекции или E. палочки или LPS в NF-kB репортер трансгенные. Как и в нашей собственной работе, эти авторы видели значительное увеличение активности репортера 6 часов после того, как E. палочка раствор для инъекций 2.
Обратите внимание, что в связи с учредительными NF-kB активности в головном мозге и других органах брюшной полости, головы и живота нашего корреспондента мышей неизменно показывают, отображаемого сигнала, когда, даже в базовой до любой манипуляции. Таким образом, этот сигнал должен быть проигнорирован в связи с этим экспериментом. Очевидный сигнал должен оставаться в пределах LPS-молочной железы вводят по образу считывания регулируется, чтобы минимизировать фон свечения в железе PBS. Рисунке 2 показано изображение с фоном снижается.
Неудачный введения железа будетскорее всего, привести к повреждению к соску. Это приведет к тому отметил, кожа уровня воспаление, которое будет видно на визуализации. Этот тип ранения сигнал будет очень сильным и приурочены к соску области, где был причинен ущерб, не исходящие всей железы, как видно после успешной инъекции ЛПС в протоки.
Рисунок 1. Схема процедуры.
Рисунок 2. Представитель результаты ИВИС биолюминесцентного изображений. (A) полученное изображение с фоном уменьшается, что увеличилась активность люциферазы в LPS впрыском железы. (B) Изображение из с интересующей нас области количественных добавил. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3 Практика инъекций:.. Молочной железы вводят краситель с помощью инъекций внутрипротоковые Чтобы проверить точность доставки через соску, мышь на 21-й день лактации вводили 100 мкл трипанового синего красителя разводят в PBS. После жертву, железы был выставлен для визуализации. (A) успешных инъекций и (B) болюс красителя на соске.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы используем трансгенные NF-kB мыши репортер и оптимизированная техника инъекций модель мастит, воспаление ткани молочной железы чаще всего вызвано бактериальной инфекцией. Наиболее важным шагом в этой процедуре внутрипротоковые инъекции себе.
На практике, как правило, очевидны ли внутрипротоковые инъекция была успешной. Инъекции препаратов (ЛПС или PBS) должны чувствовать себя жидкость и не должно быть мало, чтобы никакого сопротивления, как шприц опустел. Наиболее распространенная ошибка это повреждение сосков приводит к препятствуют переходу в железе. Это могут быть визуализированы, глядя на соски через рассекает области. Нанесенный можно избежать достаточной практики, деликатность при обработке сосков, и гарантируя, что только самая маленькая из игл (31G или выше) используется для выполнения процедуры. Кроме того, если игла находится не правильно, или если она скользит середине инъекций, сборки-Из LPS или PBS могут образовываться в месте инъекции и жидкость не будет проникать в протоки. Если это произойдет, вы можете либо визуально увидеть скопление жидкости в коже вокруг соска, или инъекция не будет чувствовать себя жидкость. Хотя эта ловушка не может полностью устранить, случаев можно избежать, по большей части на практике и с помощью соответствующих инструментов.
Метод, используемый здесь для инъекции имеет решающее значение для данного эксперимента. Некоторые опубликованные методы внутрипротоковые инъекции в молочной железе требуют резки / удаления сосков и / или разрез через кожу 7,8. В этом случае, в качестве основной конечной точке исследования было определить NF-kB связанных воспаления в железе, любые разрезы или возмущение кожи или соска были нежелательны и будет вызывать воспалительные сигнала из-за повреждения тканей, что бы посрамить LPS-индуцированного сигнала.
Кроме того, нашаинъекция была завершена с коммерчески доступными инсулиновый шприц и без использования обращается микропипетки или микроманипуляторами, как и в ряде других методологий для инъекций, которые не используют соску удаление 9, 10. Мы считаем, что это был единственно возможным, так как кормящие соски немного увеличены и несколько проще внедрить, чем молодые, соски мыши девственница. Чтобы придать девственница мышей, более строгие инструменты могут быть необходимы.
Как видно из рисунке 2, что, если правильно выполнены, инъекции ЛПС в протоках молочной железы мышей вызывает воспаление, локализованное визуализируется увеличение NF-kB активности люциферазы репортера. Другие были проанализированы более подробно эта модель острого мастита, либо через Е. палочки или ЛПС введения в молочную железу и последующий анализ тканей 2-3, 8, 10-14. Среди многих выводов, эти исследования показывают, что воспалительный ответ яс модулированной взаимодействия с CD14, и что это приводит к притоку нейтрофилов регулируется молочной альвеолярных макрофагов. Как отмечается в обеих наших ранее опубликованных работ 4, а также, как и другие 2 этой модели мастита может быть в дальнейшем использована для изучения механизмов и методов лечения актуальна в людях, где до 3-33% от кормящих женщин страдают от этой болезненной инфекции (процент варьируется в зависимости от методологии исследования) 15. Это может также оказаться полезным инструментом исследования для тех, кто в молочной промышленности, где мастита является дорогостоящим заболеванием приводит к значительным потерям в производстве молока каждый год 16.
Наконец, NGL трансгенных мышей репортер используется здесь и аналогично функционирующие HLL мышей Репортер 17 были использованы в многочисленных исследованиях, чтобы проверить, количественно и отслеживать вверх или вниз регулирования NF-kB деятельности в рамках различных заболеваний и развитием моделей, включая острый легкоетравмы, рак легких, дыхательных путей морфогенеза ветвления, инсулинорезистентность, ожирение, инфаркт миокарда 1, 17-21. Эта модель обеспечивает дополнительный пример полезности этих трансгенных репортера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH грант CA113734 присуждена F Yull и Департамент по делам ветеранов (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
References
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10 (2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53 (2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
