Summary
Beskrivs här är en teknik i vilken lipopolysackarid injiceras i mjölkproducerande mus bröstkörteln via nippeln att simulera mastit, ett tillstånd som vanligen orsakas av bakteriell infektion. Lipopolysackarid injektion resulterar i ökad nukleär faktor kappa B (NF-kB) signalering, som visualiseras genom bioluminiscent avbildning av en NF-KB luciferas reporter mus.
Abstract
Djurmodeller av human sjukdom är nödvändiga för att noggrant studera stadier av sjukdomsutveckling och tillhörande mekanismer, och slutligen, som pre-kliniska modeller för att testa interventioner. I dessa metoder, beskriver vi en teknik i vilken lipopolysackarid (LPS) injiceras i mjölkproducerande mus bröstkörteln via nippeln, effektivt modellering mastit, eller inflammation, av körteln. Denna simulerade infektion resulterar i ökad nukleär faktor kappa B (NF-kB) signalering, visualiserades såsom genom bioluminescent avbildning av en NF-KB luciferas reporter mus 1.
Vårt slutgiltiga mål att utveckla dessa metoder var att studera inflammation i samband med mastit i mjölkproducerande körtel, som ofta inkluderar rodnad, svullnad och immunceller infiltration 2,3. Därför var vi mycket medvetna om att snitt eller någon typ av såra av huden, bröstvårtan eller körtel i syfte att införa LPS kundeinte användas i våra metoder eftersom det tillvägagångssätt skulle sannolikt förbrylla utlästa av inflammation. Vi önskar också en rättfram metod som inte kräver specialtillverkade handritade pipetter eller användning av mikromanipulatorer att hålla dessa specialiserade verktyg på plats. Sålunda bestämde vi att använda en kommersiellt tillgänglig insulin spruta och att injicera medlet i mammär kanalen av en intakt nippel. Denna metod var lyckad och tillät oss att studera inflammation i samband med LPS-injektion utan några ytterligare effekter överlagras genom förfarandet enligt injektionen. Dessutom har denna metod användes också ett NF-KB luciferas reportern transgen mus och bioluminescent bildteknik att visuellt och kvantitativt visar ökad NF-kB signalering inom LPS-injicerade körtel 4.
Dessa metoder är av intresse för forskare från många discipliner som vill modell sjukdom inom den ammande bröstkörteln, som slutligen teknikenbeskrivs här kan användas för injektion av ett antal ämnen, och är inte begränsad till enbart LPS.
Protocol
Samtliga djurförsök godkändes av Vanderbilt University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Förbereda Transgena möss
- Honmöss, positiva för NGL (NF-kB-G FP-L uciferase) reporter transgenen (tidigare beskrivits 1) används för detta förfarande. När kvinnor är minst 6 veckor, para dem med en FVB vildtyp hane. Harem avel kan användas (upp till 4 honor i en bur med en hane). (Observera: FVB stam möss användes för den aktuella studien Mörkare stam möss som C57BL6 kan också användas, men dessa möss måste rakas före avbildning.).
- Börjar på 15 dagar efter parning, kontrollera honorna regelbundet för tecken på graviditet (stor utskjutande omkrets). Varje hona måste separeras gång gravid och hanen ur avel bur när den sista honan blir gravid.
- Titta de separerade kvinnor ettD Obs födelsedatum när en kull visas. En kull på minst 6 valpar krävs för adekvat amning. Åtta dagar efter födelsen av kullen, fortsätt med protokollet (se figur 1 för en tidslinje schema).
2. Förberedelse för injektion
- Lös E. coli LPS i PBS till en slutlig koncentration av 0,1 | ig / | il. 50 pl av denna lösning, eller en totalt 5 pg, kommer injiceras i bröstkörteln. Förbered ett andra rör av enbart PBS som skall användas för kontroll injektion.
- Set-up ett dissekera omfattning och isoflurananestesi utrustning. En noskonen apparat bör fästas vid steg i dissekera omfattning där musen kommer att placeras. En bra ljuskälla, bör om från tillämpningsområdet själv eller från extra strålkastare också vara beredd.
- När uppställningen är klar, starta isofluran maskinen och luftflöde.
3. Intraductal Injektion av LPS
- Ladda kort sprutnålen med 50 ul av LPS-lösningen. Ställ detta åt sidan.
- Söva musen för att injiceras genom att först placera den kvinnliga i en fylld isofluran låda och sedan en gång andningen långsammare, flytta henne på scenen och placera näsan i noskonen. Använd en tå nypa för att bekräfta musen är helt bedövad. Övervaka musens andning under hela förfarandet och justera isofluran nivå i enlighet därmed. Buren innehåller kullen valpar att honan har tagits från bör försiktigt åt sidan tills dammen kan återföras efter ingreppet.
- Använd en liten droppe 70% etanol för att göra pälsen ligger plant och att hjälpa till att visualisera nippeln sitter på höger # 4 inguinal bröstkörteln på musens nedre buken.
- Fokusera dissektionsmikroskop för en optimal bild av bröstvårtan. Försiktigt använda en uppsättning av fina pincett för att ytterligare dra ut bröstvårtan bort från huden, men inte punktera eller skada bröstvårtan på något sätt. Denpincett ska aldrig tätt klämmas ihop när manipulera vävnad, men används med en lätt grepp som kräver minimalt med stress på bröstvårtan.
- Använd pincett i vänster hand för att försiktigt hålla bröstvårtan på plats. Långsamt föra förladdade sprutan i synfältet med hjälp av höger hand. Sprutan ska hållas så att ingen ompositionering måste ske för att injicera innehållet.
- När sprutan är i sikte, sikta noga på lilla duktal öppningen i mitten av bröstvårtan, och sätt i sprutan.
- Utan att flytta handen, injicera innehållet i sprutan och ta bort nålen från bröstvårtan.
- Ladda en andra spruta med 50 pl PBS för kontroll injektion. Flytta musen på scenen och för den bästa utsikten över den vänstra # 4 inguinal bröstkörteln nippel på andra sidan av musen nedre delen av magen. Upprepa steg från 3,4 till 3,7 med användning av PBS-laddade spruta.
- När båda injektioner är komplEte, avbryta anestesi och flytta musen till en återhämtning bur. Övervaka honan att försäkra att hon blir rörlig inom 5 minuter. Låt musen att förbli i återhämtningen buren under 1 timme. Efter 1 timme av återhämtning, placera den kvinnliga tillbaka till buren med sin kull valpar. Möss bör följas regelbundet under 6 timmar efter injektionen innan du fortsätter till avbildning. Enligt vår erfarenhet har inga negativa konsekvenser noteras i antingen honan eller valparna under perioden injektion och bildhantering. Men om tecken på ångest observeras i den kvinnliga (t.ex. krökt kroppshållning, bita eller bevakning av injektionsstället, allmän slöhet) eller valparna (ingen rörelse, blåaktig hudfärg) experimentet bör avbrytas.
4. Bioluminescent Imaging att visualisera NF-KB aktivitet
- När möss har transporterats till bildbehandling anläggningen börja avbildning förfarande genom att öppna programvaran och initieras av maskinen. Slå på äroflurane maskin och luftflöde, se till att anestesi flödar både lådan och den avbildande kammaren.
- Placera musen i isoflurananestesi i det klara anestesi rutan. När andningen har avtagit, använd en tå nypa för att bekräfta musen är helt bedövad. Därefter, injicera 100 pl av luciferin substrat i musen genom retroorbital injektion 5 med användning av en steril spruta.
- Överför omedelbart musen till avbildning kammaren och placera näsan under isofluran noskonen finns där. Musen bör vara liggande. Säkra varje fot till scenen med tejp.
- Input lämpliga inställningar till IVIS programvara för att ta både ett vitt ljus fotografisk bild och en bild av den självlysande verksamheten. Exponeringstiden bör vara 10 sek. Hämta bilden.
- När bilderna har förvärvats, låt musen för att återhämta sig och placera henne tillbaka i buren med sina valpar och övervaka regelbundet.
- Den fotografiska och självlysandebilder automatiskt överlagras och visas på skärmen, såsom i fig 2. Analysera de förvärvade bilderna genom att placera regionen av intresse eller "ROI" cirklar av samma storlek över varje sida av musens nedre buken (en över PBS-injicerade körteln och en över LPS-injicerade körteln). Ställ utläsningen till fotoner. Ett nummer ska visas anger luminiscens detekteras i varje ROI (se figur 2B). Använd detta nummer i statistisk analys.
- För att visa den optimala bilden ytterligare justera tröskeln visade signalen. Detta kommer inte att ändra den totala luminiscens avläsning men gör att du kan ta bort bakgrunden signal och visualisera skillnader mellan kontroll och LPS-behandlade körtel. Minska mängden luminiscens visas tills PBS-injicerade körteln är fri från bakgrundssignal. Detta bör lämna den ökade signalen i LPS-behandlade körtel fortfarande uppenbar i bilden, såsom visas i figur 2.
- AdditionaL analys, inklusive protein och RNA-analyser, kan kompletteras med bröstvävnad samlats in från den kvinnliga obduktion 6.
5. Representativa resultat
För att få tolkningsbara resultat från dessa metoder måste LPS (eller PBS) infunderas bara i de mammary kanaler, lämnar intilliggande vävnad ostört. Injektion i den subkutana vävnaden som omger bröstvårtan kommer att resultera i inflammation på grund av skada snarare än den simulerade infektionen. Injektion av trypanblått färgämne utspätt i PBS är användbart när man lär tekniken. Figur 3A visar ett framgångsrikt injicerade körtel infunderas med 100 pl av trypanblått i PBS. Som visas ska endast duktal trädet fyllas med den injicerade lösningen, och det bör inte finnas någon bolus vid injektionsstället. En "bolus" i detta sammanhang är en ansamling av den insprutade vätskan vid bröstvårtan eller i vävnaden som omger bröstvårtan utan infusion i duktal trädet. Detta är shegen i fig. 3B. Observera att praktiken injektioner som visas i figur 3 slutfördes en kvinnlig dag 21 av amning. Under höjden av amning (dag 8-10, det stadium då LPS injiceras med det nuvarande protokollet), är mjölk riklig och det är svårt att visualisera kanalerna och avgöra om injektionen har slutförts korrekt. Därför, senare tidpunkter i amning är bättre för praktiken injektioner.
Framgångsrik injektion av LPS i de mammary kanaler resulterar i ökad NF-KB aktivitet inom körteln. Detta torde vara uppenbart i reporter mus vid IVIS avbildning, och LPS-injicerade körtel bör ha avsevärt högre luciferasaktivitet (uppmätt med fotonen antal) än den PBS-injicerade körtel, såsom visas i figur 2 (i genomsnitt läser LPS körtel 200% av PBS styrsignalen). En statistiskt signifikant ökning av luminiscens inom LPS-behandlade körtlar som kompARöda den kontralaterala kontrollen uppnåddes trots slutförandet av en grupp av 4 möss 4. En ytterligare studie har också utnyttjat intraductal bröst injektion av antingen E. coli eller LPS i NF-kB reportern transgener. Liknar vårt eget arbete, såg dessa författare en betydande ökning av reporter aktivitet 6 timmar efter E. E. coli injektion 2.
Observera grund konstitutiv NF-KB aktivitet i hjärnan och andra bukorganen, huvuden och magar av vår reporter möss visar genomgående en signal när avbildas, även vid baslinjen innan någon manipulation. Sålunda bör denna signal ignoreras med avseende på detta experiment. En uppenbar signal bör förbli inom LPS-injicerade mjölkkörtlarna efter bilden avläsningen justeras för att minimera bakgrunden luminiscens i PBS körteln. Figur 2 visar bilder med bakgrunden minskas.
Misslyckad injektion av körteln kommersannolikt resultera i skador på bröstvårtan. Detta kommer att orsaka pekade, hud-nivå inflammation som kommer att vara uppenbara vid avbildning. Denna typ av sårskada signal kommer att vara mycket stark och begränsad till bröstvårtan område där skadan uppstod, inte härrör hela körteln, sett efter en lyckad LPS injektion i kanalerna.
Figur 1. Schematisk bild av arbetsordningen.
Figur 2. Representativa resultat från IVIS självlysande bildbehandling. (A) Förvärvade bild med bakgrund minskas avslöjar ökad luciferasaktivitet i LPS-injicerade körtel. (B) Bild från A med regionen av intresse kvantifieringar tillsätts. Klicka här för att se större bild .
Figur 3 Practice injektion:.. Bröstkörteln injicerades med färgämne genom intraductal injektion att testa noggrannheten hos leverans via nippeln, var en mus vid dag 21 av laktation injicerades med 100 | il av trypanblått färgämne utspätt i PBS. Efter offer var körtel utsätts för visualisering. (A) lyckad injektion och (B) bolus av färgämne vid bröstvårtan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här använder vi en transgen NF-kB reporter mus och en optimerad injektionsteknik att modellera mastit, inflammation i bröstvävnaden oftast orsakas av bakteriell infektion. Det mest kritiska steget i denna procedur är intraductal injektionen själv.
I praktiken är det vanligtvis uppenbart huruvida intraductal injektionen har varit framgångsrik. Injektionen av medlen (LPS eller PBS) bör känna fluid och det bör vara liten eller ingen motstånd då sprutan töms. Den vanligaste fallgrop är skador på bröstvårtan som leder till blockerade passagen i körteln. Detta kan visualiseras genom att titta på nippeln genom dissektionsmikroskop. Skador kan undvikas genom tillräcklig praxis delikatess när manipulera bröstvårtan, och genom att se till att endast de minsta nålar (31G eller högre) används för att utföra proceduren. Dessutom, om nålen inte är korrekt, eller om det glider mitt injektion, en byggnadUpp av LPS eller PBS kan bildas vid injektionsstället och vätskan kommer inte genomsyra kanalerna. Om detta inträffar kan du antingen visuellt se ansamling av vätska i huden runt bröstvårtan eller injektionen kommer inte att känna vätska. Även om denna fallgrop inte helt kan elimineras, kan händelser undvikas till största delen genom praktik och genom att använda rätt verktyg.
Den teknik som används här för injektion var kritisk för detta experiment. Några publicerade metoder för intraductal injektion i bröstkörteln kräver skärning / avlägsnande av bröstvårtan och / eller snitt genom huden 7,8. I detta fall, som den primära slutpunkt av studien var att fastställa NF-KB relaterade inflammation i körteln, fanns några snitt eller störning av huden eller bröstvårtan oönskad och skulle få en inflammatorisk signal på grund av vävnadsskada som skulle förbrylla LPS-inducerade signalen.
Dessutom, vårinjektion avslutades med en kommersiellt tillgänglig insulinspruta och utan användning av en dragen mikropipett eller mikromanipulatorer, liksom i flera andra metoder för injektion som inte använder bröstvårtan bort 9, 10. Vi tror att detta var bara möjligt eftersom lakterande bröstvårtan är något förstorad och något lättare att injicera än en ung, oskuld mus bröstvårtan. Att injicera jungfrulig möss kan strängare verktyg krävs.
Det framgår av figur 2 att om korrekt utförd, orsakar injektion av LPS in i kanalerna av mus bröstkörteln lokal inflammation som visualiserades genom en ökning i NF-KB-luciferas reporteraktivitet. Andra har analyserat mer omfattande denna modell av akut mastit, antingen genom E. coli eller LPS-injektion till bröstkörteln och efterföljande analys av vävnaden 2-3, 8, 10-14. Bland många fynd dessa studier visar att det inflammatoriska svaret is moduleras genom interaktioner med CD14, och att det resulterar i en neutrofil tillströmning regleras av mammära alveolära makrofager. Som föreslås i både vår tidigare publicerade arbeten 4, liksom andras maj 2 denna modell av mastit vidare användas för att studera mekanismer och terapi relevans för människa, där så många som 3-33% av ammande kvinnor lider av denna smärtsamma infektion (procent varierar beroende på studie metod) 15. Det kan även vara ett användbart sökverktyg för de i mejeriindustrin där mastit är en kostsam sjukdom som leder till betydande förluster i mjölkproduktionen varje år 16.
Slutligen har NGL transgena reporter möss som användes här och liknande fungerande HLL möss reporter 17 använts i ett flertal studier för att verifiera, kvantifiera och spåra upp eller nedreglering av NF-kB aktivitet inom en rad olika sjukdomar och utvecklingsstörningar modeller inklusive akut lungaskada, lungcancer, luftvägarna förgrening morfogenes, insulinresistens, fetma, och hjärtinfarkt 1, 17-21. Denna modell ger ett ytterligare exempel på användbarheten av dessa reporter transgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag CA113734 tilldelas F Yull och Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
References
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10 (2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53 (2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
