细菌冻干制剂及其对细胞存活率的影响

摘要

冷冻干燥通常是获得可存活细菌细胞干燥产物的一种简便且有效的方法。该过程的一个问题是细胞存活率。本文详细阐述了一种用于研究冻干过程中细胞存活率如何受到所用配方特性影响的实验方案。

摘要

细胞中的水分可以被去除，以可逆地使微生物失活，从而便于储存。其中一种脱水方法是冷冻干燥，被认为是一种温和的脱水方式。为了提高细胞在干燥过程中的存活率，通常需要预先对细胞进行配方处理。该配方形成一种基质，将细胞包埋其中，从而在冷冻和干燥过程中保护细胞免受多种有害应力的影响。本文介绍了一种评估细胞冷冻干燥后存活率的通用方法，并通过比较四种不同配方对两种细菌菌株——P. putida KT2440 和 A. chlorophenolicus A6 的影响来加以说明：分别为二糖蔗糖、由蔗糖衍生的聚合物Ficoll PM400，以及相应的多糖羟乙基纤维素（HEC）和羟丙基甲基纤维素（HPMC）。本研究展示了如何制备用于冷冻干燥的配方，并通过差示扫描量热法（DSC）、表面张力测定、X射线分析和电子显微镜对配方进行表征，将这些数据与细胞在复水后的存活率相关联，以探究细胞存活的机制。所选用的聚合物旨在使其单体结构在不同程度上模拟蔗糖对应的多糖结构。通过该实验体系，我们证明，只要控制配方的某些物理特性，聚合物对细胞存活的保护效果可与二糖相媲美¹。

方案

1. P. putida 的培养与收获

1. 通过将一株在添加胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基上培养的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌落接种至100 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，制备恶臭假单胞菌（P. putida）的种子培养物。将培养物置于30 °C、130 rpm的摇床上培养。
2. 7小时后，取相当于主培养最终体积1/10的种子培养物等分试样，转接到新鲜的TSB培养基中。将细胞在30 °C、130 rpm的摇床上继续培养16小时。
3. 培养16小时后，将细胞培养物在室温下以1,500 × g离心20分钟收集细胞。倒去上清液，并用与培养基等渗的NaCl溶液重悬细胞沉淀进行洗涤。本实验中使用150 mM NaCl溶液。随后再次离心，弃去上清液，再将细胞重悬于配方培养基中，参见步骤3.2。

2. 其他物种的培养

1. 若要将该方案适用于其他细菌种类，应根据该物种的需求调整培养和收获步骤。在收获及洗涤步骤中处理细胞时，为避免渗透压休克，所用溶液的渗透压需与收获时培养基的渗透压相匹配。

3. 细胞的制备

1. 称取相应的基质组分，溶于水中，制备配方溶液。为达到等渗条件，可通过调整辅料用量，或添加 NaCl 或其他细胞相容性溶质，使渗透....

结果

表1展示了配方组成的数据、DSC在加热冷冻制剂过程中记录的热事件、干燥样品的结构以及配方溶液的表面张力。T_g'（玻璃化转变温度）对于蔗糖已被确定为-40 °C^{2, 3}，且当蔗糖浓度低于20% w/w时，该温度可能难以检测。-35 °C处的热事件可能与冰开始溶解有关²。通过X射线在HEC和HPMC样品中检测到的结晶结构，以及在SEM中观察到的结构（见图2b和2c），与NaCl的正常晶体形态重叠。

图1A展示了革兰氏阴性菌P. putida和革兰氏阳性菌A. chlorophenolicus在不同基于糖类的制剂中的存活数据。请注意，两种细菌在不同制剂中存活能力的趋势相同。图1B中的图表说明了冻干存活率与制剂表面张力之间的相关性。

图2展示了干燥制.......

讨论

本研究的目的是探讨一些可能对细胞在冻干过程中存活有重要意义的配方特性。尽管不同物种固有的干燥耐受性存在差异（如图1A所示），但不同配方对细胞存活的支持效果总体趋势相似。首先比较蔗糖和菲可尔（Ficoll）具有参考意义。人们认为，配方成分能否在脱水过程中替代水分子，从而在干燥状态下维持细胞内蛋白质和膜结构的完整性，是决定其是否能够支持细胞存活的关键因素。二糖类物质（如蔗糖以及海藻糖）具有这种特性，而多糖类聚合物（如淀粉）则不具备^5,11。由于聚合物分子过大，无法像二糖那样与膜脂发生有效相互作用。另一个对微生物成功冻干至关重要的特性是支撑基质在冻干过程中形成玻璃化状态（即转变为非晶态固体）的能力。非晶态结构有利于屏蔽外界影响并保持细胞彼此分离。有趣的是，只要冻干操作得当，二糖和聚合物均能容易地实现玻璃化。我们的结果表明，基于蔗糖和菲可尔的配方在冻干后均形成非晶态结构（见表1），且对细胞存活的支持效果相当。然而，这两种糖类之间仍存在显著差异。与蔗糖不同，菲可尔分子量高达400 kDa，体积过大，无法在冻干过程中与脂质膜相互作用时替代水分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC（Natrosol-M 药用级）	Ashland		由 Ashland 赠送
HPMC（Methocel F4M）	Dow		由乌普萨拉大学药学系赠送
蔗糖	Sigma-Aldrich	S2395
氯化钠	Sigma-Aldrich	71376
胰蛋白胨大豆肉汤	Merck	105459
胰蛋白胨大豆琼脂	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k 衍射仪	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss 教学用张力计	Krüss	N.A.