Summary
B7-H1（PD-L1）とPD-1への結合は、腫瘍の微小環境における主要な腫瘍誘発免疫抑制信号を提供します。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現と局在を特徴付けるための免疫組織化学的染色法はここで説明されます。
Abstract
B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。
最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体が故にmulのための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓癌を含む12のtipleヒト固形腫瘍。
最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、devがある膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドの駆け落ちB7-H1染色プロトコール。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。
Protocol
B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。
最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体は、したがって、複数の人間のための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓12の癌を含む固形腫瘍。
最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、B7-H1 stainiを開発しました膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドのngのプロトコル。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。
1。デparafinization
- 焼く20分間55℃でスライドします。
- 10分間、キシレン中の化学フード内、浸すスライド。
- 10分間、新鮮なキシレンに浸してスライドする。
- 浸し、5分間100％エタノール中でスライドします。
- 5分間、新鮮な100％エタノールでスライドを浸す。
- 浸し、5分間、95％エタノールにスライド。
- 浸し、5分間、80％エタノールにスライド。
- 5分間脱イオン水でスライドを浸す。
2。抗原回復
- その後125℃で30秒間のTris-EDTA緩衝液（pH9.0）と圧力鍋の熱、90℃で10秒間、Cに浸しスライド。
- 60分間のクールなスライドしてみましょう。
- 5分間TBSTに浸しスライド; REPE2倍で。
3。染色
- スライド上の組織の周りのソリューションを拭き取ってください。疎水性のペンで組織の周りに円をマークします。
- 湿度室でスライドを置き、全体の染色プロセス全体を通して、スライド上の組織の乾燥を避ける。 5分間ペルオキシダーゼブロック内のスライドとインキュベートスライド上に疎水性の円内にペルオキシダーゼブロックの代わりに1滴（完全に組織領域をカバーする約200μl以上）。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
- 15分間インキュベートし、各スライドにブロッキングバッファーをブロックエースの代わりに一滴。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
- 15分間インキュベートし、各スライド上のアビジン溶液の代わりに一滴。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
- 15分間インキュベートし、各スライドにビオチン溶液の代わりに一滴。
- SLIすすぎTBSTでデ、その後5分間、TBSTで配置します。
- 4で200μlのTBST中κアイソタイプコントロールマウス抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）またはマウスIgG1の1:1000希釈でスライドをインキュベート℃で22時間+ / - のC一晩 - 1時間。 TBST中で最終的な抗体濃度が2.57μg/ mLである。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
- 30分間1:500濃度（200μlの2％ヤギ血清溶液中）でビオチン結合ラット抗マウスIgG1二次抗体を用いてスライドをインキュベートする。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
- 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン - ビオチン複合体の場所は1滴（使用前に少なくとも30分を準備しなければなりません）。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
- 4分間インキュベートし、各スライド上の増幅試薬の代わりに1滴（TBSTで2:1に希釈したもの）。
- TとスライドをすすぐBSTは、その後5分間TBSTで配置します。二回繰り返します。
- 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン-HRPの代わりに一滴。
- 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
- 場所は1つ各スライドの3,3 - ジアミノベンジジン（DAB）基板とクロモゲンのドロップと2分間発色する。
- すぐに発色した後、1〜2分間ddH 2 Oでスライドを洗浄します。
- 90秒のヘマトキシリン1滴でスライドをインキュベートする。
- 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。
- 1〜2分間石鹸水道水で洗ってください。
- 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。
4。脱水および取り付け
- 3分間80％エタノール中でスライドを浸す。
- 3分間95％エタノール中でスライドを浸す。
- 5分間100％エタノールにスライドを浸す。繰り返します。
- 5分間キシレンにスライドを浸す。繰り返します。
- 一滴を追加スライドとカバースリップ場所にCytoseal 60。
表1は、上記の手順で使用する試薬。
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Representative Results
B7-H1の成功した免疫組織化学的染色は、膵臓腺癌におけるB7-H1（茶色信号のDAB発色）の異種発現を実証します。他の人がB7-H1またはB7-H1（ 図2、図3）を少し表現のいずれかの主に細胞質発現を持っているのに対し、一部の膵臓腺癌細胞がB7-H1の主に膜状の発現（ 図1A）を持っています。通常の膵管上皮は少しB7-H1（ 図4）を発現する 。代わりに抗B7-H1抗体のマウスIgG1κアイソタイプコントロール抗体で染色すると、少しバックグラウンド染色（ 図1B）を示しています。
図1。抗B7-H1とA.免疫組織化学的染色は、クローン5H1抗体は、いくつかの膵臓腺癌細胞膜上の発現を示す。B. Immunohistocアイソタイプ対照IgG1とhemical染色は同じ膵臓腺癌組織にはほとんどのDAB発色を示しています。
膵臓腺癌細胞の細胞質内に図2 B7-H1の発現。
図3：一部の膵臓腺癌細胞がB7-H1を少し表現しています。
通常の膵管上皮の図は、4。B7-H1の発現。
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Discussion
凍結切片上のB7-H1の免疫組織化学的染色は、癌3,4の様々な先行研究で報告されている。しかし、臨床腫瘍サンプルは、通常、パラフィン包埋ブロックの形で提供されています。 5H1モノクローナル抗体は、より最近に正常腎細胞癌、子宮頚癌、膀胱癌、悪性黒色腫13から18を含むパラフィン包埋腫瘍組織の染色に応用されてきた。パラフィン包埋9,19または他のモノクローナル抗体を用いた膵臓腺癌組織のクライオスタット20節で、B7-H1の染色も報告されている。ここでは、B7-H1へ5H1モノクローナル抗体を用いたパラフィン包埋された膵臓腺癌組織の正常な染色を示した。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現は、メラノーマ4,21などの悪性腫瘍の多くの他のタイプと同様、不均一である。 B7-H1 arの膜と細胞質の両方の式eは腺癌細胞（ 図1と図2）を用いて観察。 B7-H1の膜式は、その生物学的機能と一貫性があります。腫瘍組織におけるB7-H1細胞の役割が検討されていない。通常の膵管上皮または腺細胞（ 図4）B7-H1を発現しない。
このプロトコルのすべてのステップは、4℃で一晩インキュベートした以外は、室温で行われるこのB7-H1の染色手順で使用される抗原の検索条件は、前述の刊行物9,19で報告されていませんでした。増幅工程はまた、これらの研究で採用されていませんでした。我々は、このプロトコルの重要なステップは、抗原回復、一次抗体との一晩のインキュベーション、増幅、およびDAB発色が含まれていることを発見した。一次抗体の希釈は5H1のそれぞれ異なるバッチのためにわずかに滴定することが必要になることがあります。増幅は4分で正確に保たれてい希釈増幅試薬。これらの変更には、背景を増加させることなく、正の信号の十分な増幅を与える。開発期間は、通常2分ですが、私たちは日常的に、最小限の背景に最適な染色を確保するために、顕微鏡下で開発を監視します。染色の各ラウンドでは、我々は以前のバッチからのスライドおよびポジティブコントロールとして扁桃組織の一つのスライドが含まれています。扁桃腺におけるB7-H1のParacortical染色は、以前4に記載されている。バックグラウンドが高くしたり、これらの対照スライドに典型的な信号を開発するために5分以上かかる場合は、我々は重要なステップのための試薬を交換し、すべての染色手順を調べることをお勧めします。
この染色法の使用は腫瘍膵臓腺癌細胞上のB7-H1の発現と局在の定性的および半定量分析を可能にする。 amplificatiの一次抗体の希釈の変更、長さ、および希釈ステップ、発色の時間に、このプロトコルは、他の組織型にも適用することができる。我々は、このプロトコルを変更し、乳癌、肉腫の組織のためにそれを使用している。 B7-H1および腫瘍の微小環境における主要な腫瘍誘発免疫抑制信号を提供し、PD-1への結合のように、この染色法は、腫瘍の開始、進行および抗腫瘍免疫応答における腫瘍の微小環境の役割についての我々の理解を容易にするでしょう。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
EBは、KMB、とHXは均等に貢献しています。本研究では、消化器癌P50 CA062924、NIHのK23 CA148964、ラストガーテン財団、Viragh財団、ASCOの若手研究者賞は、NIH 5T32 CA0090701-28トレーニンググラント、ソルゴールドマン膵臓癌センター、国立膵臓FoundationのNCIの胞子によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
- Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
- Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
- Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
- Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
- Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
- Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
- Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
- Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
- Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
- Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
- Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
- Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
- Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
- Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
- Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
- Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
- Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
- Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
- Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).
