Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Immunhistokemisk färgning av B7-H1 (PD-L1) på Paraffininbäddade Bilder av Pancreatic Adenocarcinom Tissue

Published: January 3, 2013 doi: 10.3791/4059
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1, 1,2,4, 3,5, 6, 1,2,5,7,8, 1,2,5,8, 1,2,4,5,7
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

B7-H1 (PD-L1) och dess bindning till PD-1 tillhandahåller en stor tumör-inducerad immunosuppressiv signal i tumörens mikromiljö. En immunohistokemisk färgning teknik för att karakterisera uttryck och lokalisering av B7-H1 i pankreatiskt adenokarcinom beskrivs här.

Abstract

B7-H1/PD-L1, en medlem av B7-familjen av immun-reglerande cell-ytproteiner, spelar en viktig roll vid negativ reglering av cell-medierade immunsvar genom dess interaktion med dess receptor, programmerad död-1 (PD -1) 1,2. Överexpression av B7-H1 av tumörceller har noterats i ett antal humana cancerformer, inklusive melanom, glioblastom, och karcinom i lunga, bröst, kolon, äggstock, och njurceller, och har visat sig försämra anti-tumör-T- cellsimmunitet 3-8.

Nyligen har B7-H1 expression genom vävnader pankreatiskt adenokarcinom identifierats som en potentiell prognostisk markör 9,10. Dessutom har blockad av B7-H1 i en musmodell för cancer i bukspottskörteln visats producera ett anti-tumörsvar 11. Dessa data tyder på vikten av B7-H1 som ett potentiellt terapeutiskt mål. Anti-B7-H1 blockad antikroppar därför testas i kliniska prövningar för multiple humana fasta tumörer, inklusive melanom och cancer i lunga, kolon, njure, mage och pankreas 12.

För att på sikt kunna identifiera de patienter som kommer att gynnas av B7-H1 inriktning behandlingar är det viktigt att undersöka sambandet mellan uttryck och lokalisering av B7-H1 och patientens svar på behandling med B7-H1 blockad antikroppar. Undersöka uttrycket av B7-H1 i mänskliga vävnader pankreas adenocarcinom genom immunohistokemi ger en bättre förståelse för hur detta samarbete hämmande signalmolekyl bidrar till förtryck av antitumörimmunitet i tumörens mikromiljö. Anti-B7-H1 monoklonal antikropp (klon 5H1) som utvecklats av Chen och medarbetare har visat sig ge tillförlitliga färgning resulterar i kryosnitt av flera typer av humana neoplastiska vävnader 4,8, men färgning på paraffininbäddade objektglas hade varit en utmaning tills nyligen 13-18. Vi har devrymt B7-H1 färgningsprotokollet för paraffininbäddade diabilder av vävnader i bukspottkörteln adenocarcinom. B7-H1 färgningsprotokollet beskrivs här ger konsekvent membranös och cytoplasmisk färgning av B7-H1 med lite bakgrund.

Protocol

B7-H1/PD-L1, en medlem av B7-familjen av immun-reglerande cell-ytproteiner, spelar en viktig roll vid negativ reglering av cell-medierade immunsvar genom dess interaktion med dess receptor, programmerad död-1 (PD -1) 1,2. Överexpression av B7-H1 av tumörceller har noterats i ett antal humana cancerformer, inklusive melanom, glioblastom, och karcinom i lunga, bröst, kolon, äggstock, och njurceller, och har visat sig försämra anti-tumör-T- cellsimmunitet 3-8.

Nyligen har B7-H1 expression genom vävnader pankreatiskt adenokarcinom identifierats som en potentiell prognostisk markör 9,10. Dessutom har blockad av B7-H1 i en musmodell för cancer i bukspottskörteln visats producera ett anti-tumörsvar 11. Dessa data tyder på vikten av B7-H1 som ett potentiellt terapeutiskt mål. Anti-B7-H1 blockad antikroppar därför testas i kliniska prövningar för flera människorsolida tumörer, inklusive melanom och cancer i lunga, kolon, njure, mage och pankreas 12.

För att på sikt kunna identifiera de patienter som kommer att gynnas av B7-H1 inriktning behandlingar är det viktigt att undersöka sambandet mellan uttryck och lokalisering av B7-H1 och patientens svar på behandling med B7-H1 blockad antikroppar. Undersöka uttrycket av B7-H1 i mänskliga vävnader pankreas adenocarcinom genom immunohistokemi ger en bättre förståelse för hur detta samarbete hämmande signalmolekyl bidrar till förtryck av antitumörimmunitet i tumörens mikromiljö. Anti-B7-H1 monoklonal antikropp (klon 5H1) som utvecklats av Chen och medarbetare har visat sig ge tillförlitliga färgning resulterar i kryosnitt av flera typer av humana neoplastiska vävnader 4,8, men färgning på paraffininbäddade objektglas hade varit en utmaning tills nyligen 13-18. Vi har utvecklat B7-H1 staining protokoll för paraffininbäddade diabilder av vävnader i bukspottkörteln adenocarcinom. B7-H1 färgningsprotokollet beskrivs här ger konsekvent membranös och cytoplasmisk färgning av B7-H1 med lite bakgrund.

1. De-parafinization

  1. Baka glider vid 55 ° C under 20 minuter.
  2. I en kemisk huva, fördjupa bilder i xylen i 10 min.
  3. Sänk ned objektglasen i färsk xylen i 10 min.
  4. Doppa glider i 100% etanol under 5 min.
  5. Doppa glider i färsk 100% etanol under 5 min.
  6. Doppa glider i 95% etanol under 5 min.
  7. Sänk glider i 80% etanol under 5 min.
  8. Doppa glider i avjoniserat vatten under 5 min.

2. Antigenåtervinning

  1. Doppa objektglasen i Tris-EDTA-buffert (pH 9,0) och värme i en tryckkokare till 125 ° C under 30 sekunder, därefter 90 ° C under 10 sek.
  2. Låt bilderna svalna i 60 minuter.
  3. Sänk ned objektglasen i TBST under 5 min, repEvid två gånger.

3. Färgning

  1. Torka av lösningar runt vävnaden på bilderna. Markera en cirkel runt vävnaden med en hydrofob penna.
  2. Placera objektglasen i en fuktkammare och undvika torkning av vävnaden på objektglaset hela färgningsprocessen. Placera en droppe (ca 200 pl eller mer för att täcka vävnadsområdet helt) av peroxidas blocket i hydrofoba cirkel på bilden och bilder inkubera i peroxidas block för 5 minuter.
  3. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min.
  4. Placera en droppe av Block Ace blockeringsbuffert på varje objektglas och inkubera under 15 min.
  5. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min.
  6. Placera en droppe av avidin lösning på varje objektglas och inkubera under 15 min.
  7. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min.
  8. Placera en droppe av Biotin lösning på varje objektglas och inkubera under 15 min.
  9. Skölj SLIdes med TBST, sedan plats i TBST under 5 min.
  10. Inkubera objektglasen med 1:1000 utspädning av mus-anti-B7-H1 monoklonal antikropp (klon 5H1) eller en mus lgG1 κ isotypkontroll i 200 pl TBST vid 4 ° C över natten under 22 h + / - 1 timme. Den slutliga antikroppskoncentrationen i TBST är 2,57 pg / ml.
  11. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min. Upprepa två gånger.
  12. Inkubera objektglasen med en biotin-konjugerad rått-anti-mus-lgG1 sekundär antikropp vid en koncentration 1:500 (i 200 pl 2% getserum lösning) under 30 minuter.
  13. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min. Upprepa två gånger.
  14. Placera en droppe av Streptavidin-biotin-komplex (måste framställas minst 30 minuter före användning) på varje objektglas och inkubera under 15 min.
  15. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min. Upprepa två gånger.
  16. Placera en droppe av amplifieringsreagens (utspädd 2:1 med TBST) på varje objektglas och inkubera i 4 minuter.
  17. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min. Upprepa två gånger.
  18. Placera en droppe av Streptavidin-HRP på varje objektglas och inkubera under 15 min.
  19. Skölj objektglasen med TBST, sedan plats i TBST under 5 min. Upprepa två gånger.
  20. Placera en droppe av 3,3-diaminobensidin (DAB) substrat och kromogen om varje bild och utveckla färgen i 2 min.
  21. Omedelbart efter färgutvecklingen, tvätta objektglas med DDH 2 O för 1-2 minuter.
  22. Inkubera objektglasen med en droppe hematoxylin under 90 sekunder.
  23. Tvätta med DDH 2 O för 1-2 minuter.
  24. Tvätta med tvål och kranvatten 1-2 minuter.
  25. Tvätta med DDH 2 O för 1-2 minuter.

4. Uttorkning och montering

  1. Sänk glasen i 80% etanol i 3 min.
  2. Sänk glasen i 95% etanol i 3 min.
  3. Sänk bilderna i 100% etanol i 5 min. Upprepa.
  4. Sänk bilderna i xylen under 5 min. Upprepa.
  5. Tillsätt en droppe avCytoseal 60 till bilden och placera täckglaset.

Tabell 1 listar de reagens som används i de ovan beskrivna förfarandena.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En framgångsrik immunhistokemisk färgning av B7-H1 kommer att visa den heterogena uttryck av B7-H1 (brun-signaler DAB färgutveckling) i pankreas adenocarcinom. Vissa pankreatiska adenokarcinomceller har övervägande membranös uttryck av B7-H1 (figur 1A) medan andra har antingen övervägande cytoplasmisk expression av B7-H1 eller liten uttryckning av B7-H1 (figurerna 2 och 3). Normal pankreas kanal epitel uttrycker lite B7-H1 (Figur 4). Färgning med en mus lgG1 κ isotyp kontroll-antikropp i stället för anti-B7-H1 antikropp visar föga bakgrundsfärgning (Figur 1B).

Figur 1
Figur 1. A. Immunhistokemisk färgning med anti-B7-H1, visar klon 5H1 antikroppar membranös uttryck på vissa celler i bukspottkörteln adenocarcinom. B. Immunohistochemical färgning med isotypkontroll lgG1 visar lite DAB färgutveckling på samma pankreas adenocarcinom vävnad.

Figur 2
Figur 2. B7-H1 uttryck i cytoplasman av celler pankreatiskt adenokarcinom.

Figur 3
Figur 3. Vissa pankreas adenokarcinomceller uttrycker liten B7-H1.

Figur 4
Figur 4. B7-H1 uttryck på normal pankreas duktal epitel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunohistokemisk färgning av B7-H1 på kryosnitt har rapporterats i tidigare studier för olika cancertyper 3,4. Men kliniska tumörprover är oftast bara tillgängliga i form av paraffininbäddade block. Den 5H1 monoklonala antikroppen har på senare tid framgångsrikt tillämpats på färgning av paraffininbäddade tumörvävnad, inklusive njurcellscancer, cervixcancer, blåscancer och melanom 13-18. B7-H1 färgning på paraffininbäddade 9,19 eller kryostaten 20 delar av vävnader pankreatiskt adenokarcinom med andra monoklonala antikroppar har också rapporterats. Här har vi visat framgångsrika färgning av paraffininbäddade vävnader pankreatiskt adenokarcinom med 5H1 monoklonala antikroppen till B7-H1. Uttrycket av B7-H1 i pankreatiskt adenokarcinom är heterogen, liknande den i många andra typer av maligniteter såsom melanom 4,21. Både membranös och cytoplasmisk uttryck av B7-H1 are observerats med adenokarcinomceller (figur 1 och 2). Membranös uttryck av B7-H1 är förenligt med dess biologiska funktion. Den roll som cytoplasmiskt B7-H1 i neoplastiska vävnader återstår att utforskas. Normala pankreas kanal epitelceller eller acinar celler uttrycker inte B7-H1 (Figur 4).

Alla steg i detta protokoll äga rum vid rumstemperatur, utom för inkubering över natten vid 4 ° C. Antigenåtervinning villkor som används i denna B7-H1 färgningsprocedur rapporterades inte i ovannämnda publikationer 9,19. Amplifieringssteget var inte heller anställd av dessa studier. Vi fann att de kritiska stegen i detta protokoll inkluderar antigenåtervinning, inkubering över natten med den primära antikroppen, förstärkning, och DAB färgutvecklingen. Utspädningen av den primära antikroppen kan behöva titreras något för varje enskild sats av 5H1. Förstärkning har hållits exakt 4 minuter meden utspädd amplifieringsreagens. Dessa modifieringar ger tillräcklig förstärkning av positiva signaler utan att öka bakgrunden. Utvecklingen är typiskt 2 min, men vi rutinmässigt följa utvecklingen under ett mikroskop för att säkerställa optimal färgning med minimal bakgrund. Med varje omgång av färgning inkluderar vi en bild från en tidigare sats och en bild av tonsill vävnad som positiva kontroller. Paracortical färgning av B7-H1 i tonsill har tidigare beskrivits 4. Om bakgrunden är hög eller om det tar mer än 5 minuter att utveckla typiska signaler i dessa kontrollmekanismer bilder rekommenderar vi ersätta reagenser för de kritiska stegen och kontroll av alla fläckar steg.

Användningen av denna färgning teknik möjliggör kvalitativ och semikvantitativ analys av B7-H1 uttryck och lokalisering på neoplastiska celler pankreatiskt adenokarcinom. Med modifiering av utspädning av den primära antikroppen, längd och utspädning av amplificatii steg, och tiden av färgutveckling, kan detta protokoll kan tillämpas på andra vävnadstyper. Vi har modifierat detta protokoll och använde den för bröstcancer och vävnader sarkom. Som B7-H1 och dess bindning till PD-1 tillhandahåller en stor tumör-inducerad immunosuppressiv signal i tumörens mikromiljö kommer denna färgningsteknik underlätta vår förståelse för den roll av tumörens mikromiljö i tumörinitiering, progression och anti-tumör immunsvar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

EB, KMB, och HX bidrar lika. Denna studie stöddes av NCI SPORE i gastrointestinal cancer P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Träning Grant, Sol Goldman bukspottkörtel Cancer Center och National Pancreas Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CSA System Dako K1500 Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
Block ACE Serotec BUF029
Biotin anti-mouse IgG1 BD 553441
Mouse IgG1 K Isotype Control eBioscience 14-4714-85
TBS(Tris-buffered saline), 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs;
Diluted to 1X with ddH2O for washes;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST
Target Retrieval, 20x Celerus Wave 014-3000-000 Diluted to 1x with ddH2O
190 Proof Ethyl Alcohol Pharmco-Aaper 111000190
200 Proof Ethyl Alcohol Pharmo-Aaper 111000200
Xylene VWR 95057-827
Hematoxylin Richard-Allan Scientific 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan Scientific 8310-4
Coverslips Corning 2940-245
Humidity chamber Sigma H6644
Table 1. Reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).

Tags

Cancer Biology medicin immunologi biokemi molekylärbiologi Cellulär biologi kemi onkologi immunohistokemi B7-H1 (PD-L1) bukspottkörtel adenocarcinom pankreascancer bukspottkörtel tumör T-cells immunitet cancer
Immunhistokemisk färgning av B7-H1 (PD-L1) på Paraffininbäddade Bilder av Pancreatic Adenocarcinom Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bigelow, E., Bever, K. M., Xu, H.,… More

Bigelow, E., Bever, K. M., Xu, H., Yager, A., Wu, A., Taube, J., Chen, L., Jaffee, E. M., Anders, R. A., Zheng, L. Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue. J. Vis. Exp. (71), e4059, doi:10.3791/4059 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter