Summary
Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.
Abstract
Homeostasis de la glucosa se controla principalmente por la insulina y glucagon endocrino hormonas, secretada por la beta del páncreas y las células alfa, respectivamente. Masa funcional de las células beta está determinada por la masa de células beta anatómica, así como la capacidad de las células beta para responder a una carga de nutrientes. Una pérdida de masa funcional de las células beta es fundamental para ambas formas principales de diabetes 1-3. Considerando que los resultados la disminución de masa de células beta funcionales de un ataque autoinmune en la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, este decremento se desarrolla a partir tanto de la incapacidad de las células beta que segregan la insulina de manera adecuada y la destrucción de las células beta de un grupo de mecanismos. Por lo tanto, los esfuerzos para restaurar la masa funcional de las células beta son fundamentales para el tratamiento y la mejor de las curas potenciales para la diabetes.
Se están realizando esfuerzos para identificar las vías moleculares que pueden ser aprovechados para estimular la replicación y mejorar la función de las células beta.Idealmente, los objetivos terapéuticos que mejoraría tanto el crecimiento de las células beta y su función. Quizás lo más importante es sin embargo para identificar si una estrategia que estimula el crecimiento de las células beta es a costa de perjudicar la función de las células beta (por ejemplo, con algunos oncogenes) y viceversa.
En forma sistemática supresión o la sobreexpresión de la expresión de los genes diana en islotes aislados de rata, se puede identificar posibles dianas terapéuticas para el aumento de la masa funcional de las células beta 6.4. Los vectores adenovirales pueden ser empleados para las proteínas eficientemente sobreexpresan o desmontables en los islotes de rata aislados 4,7-15. A continuación, presentamos un método para manipular la expresión génica utilizando transducción adenoviral y evaluar la replicación del islote y la función de células beta en los islotes aislados de rata (Figura 1). Este método ha sido utilizado anteriormente para identificar nuevos objetivos que modulan la replicación de las células beta o de la función 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Transducción adenoviral y el cultivo de islotes de rata
- Preparar un 6-así no tejido recubierto con placa de cultivo mediante la adición de 2 ml de medio (RPMI 1640 que contienen 8 mM de glucosa, 10% de suero fetal bovino, 50 unidades / ml de penicilina, y 50 ug / ml de estreptomicina) para el número requerido de pozos. Por ejemplo, un experimento típico puede requerir tres pozos, uno cada uno para un control sin virus, un control de virus (por ejemplo, GFP-expresión de adenovirus), y el grupo experimental.
- Calentar la placa a 37 ° C colocándolo en una incubadora de cultivo de tejido por lo menos durante 30 min.
- Inmediatamente después de aislamiento rata islote 18,19, 100-200 islotes lugar en pocillos individuales de la placa de cultivo de 6-bien no tejido revestido. Sesenta islotes son necesarios para la secreción de insulina y ensayos de incorporación de timidina. Los islotes restantes pueden ser utilizados para el aislamiento del ARN para estudios de expresión génica o el aislamiento de proteínas para inmunotransferencia.
[Nota: A partir de este punto en adelante, por favor, siga los protocolos institucionales para el manejo, uso y desecho de materiales de riesgo biológico.]
- Girar suavemente la placa para llevar a los islotes al centro del pozo.
- Pipetear el adenovirus directamente sobre los islotes en el centro del plato. Utilizar 100-500 multiplicidades de infección (MOI, la proporción de las células diana a virales unidades formadoras de placas).
- Que el resto islotes durante 5 min.
- Colocar la placa en el tejido incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO 2).
- Después de 24 h, agitar suavemente la placa para llevar a los islotes a los centros de los pozos y transferir los islotes utilizando una micropipeta P200 a un nuevo pozo que contiene medio fresco. Si los islotes se une a la placa, que puede ser desplazado suavemente con la punta de la pipeta.
[Nota: Para verificar la efi transducción adecuadaCY, el uso de un virus de control que expresa GFP es beneficioso, como islotes entonces se pueden obtener imágenes a través de microscopía confocal para verificar la penetración del adenovirus en el núcleo de islotes.]
- Cultura de los islotes de un adicional de 24 a 72 h, en función del tiempo deseado de la experiencia de los estudios piloto de optimización. Por ejemplo, la inducción de una respuesta proliferativa puede requerir tiempos que van desde 24 hasta 72 horas o desmontables del gen de interés puede requerir 48 o 72 horas. Traslado de los islotes a medio fresco cada día.
- Para el final de las 24 horas del experimento, la cultura de los islotes en los medios de comunicación que contienen 1 Ci [metil-3H] -thymidine/ml los medios de comunicación (generalmente de 1 l de timidina / ml de los medios de comunicación).
[Nota: A partir de este punto en adelante, por favor, siga los protocolos institucionales para el manejo, uso y disposición de materiales radiactivos.]
2. La insulina secreción de ensayo
- Preparar elsecreción tampón de ensayo (SAB) solución madre 10 veces (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM de KH 2 PO 4, 11,6 mM de MgSO 4) y CaCl 2 solución madre 100X (0,25 M CaCl 2). Estas soluciones madre se pueden preparar antes de tiempo y se almacenan a temperatura ambiente.
- Recién preparar 50 ml de la SAB de trabajo (5 ml de 10X SAB, 1 ml de HEPES 1 M, 0,5 ml de CaCl 100X 2, 0,28 ml de 35% de BSA, 0,11 g de NaHCO 3, y agua estéril para 50 ml) en un de 50 ml cónica del tubo y se calienta a 37 ° C, colocando en un baño de agua a 37 ° C.
- Pipeta 10 ml de la SAB de trabajo en un tubo cónico de 15 ml y añadir 66,8 l de 2,5 M de D-glucosa para preparar la glucosa alta (16,7 mM) SAB.
- Añadir 44,8 l de 2,5 M de D-glucosa a los restantes 40 ml de la SAB de trabajo para preparar la baja de glucosa (2,8 mM) SAB.
- Etiqueta de tres de 1,7 ml tubos de microcentrífuga para cada pocillo de la placa de 6 pocillos y añadir 1 ml de buffer fosfato salino (PBS). [Nota: A medida que los islotes son radiactivos, por favor, siga los protocolos institucionales para el manejo, uso y disposición de materiales radiactivos.]
- Coloque 20 islotes en cada tubo de microcentrífuga. Haga todo lo posible para añadir islotes de tamaño comparable a cada tubo de microcentrífuga. Por ejemplo, cada tubo puede contener 5 de pequeño, mediano 10, y 5 de gran tamaño islotes (véase Figura 1).
- Después de que los islotes se han asentado en la parte inferior del tubo por gravedad (~ 2 min), aspirar el PBS con una micropipeta y desechar.
- Para la pre-incubación, añadir 400 l de la glucosa bajaSAB glucosa, colocar los tubos (con sus tapas abiertas) en el tejido incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO 2), y pre-incubar durante 60 min. Aspirar el SAB pre-incubación de baja la glucosa y los descartes.
- Para la secreción de insulina basal, añadir 400 l de la glucosa baja SAB, colocar los tubos (con sus tapas abiertas) en el tejido incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO 2), y se incuba durante 60 min. Recoger la baja de glucosa en SAB y ahorrar para el radioinmunoensayo de insulina.
- Para la secreción de insulina estimulada, añadir 400 l de la glucosa alta SAB, colocar los tubos (con sus tapas abiertas) en el tejido incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO 2), y se incuba durante 60 min. Recoger la alta glucosa en la SAB y ahorrar para el radioinmunoensayo de insulina.
- Añadir 1 ml de PBS, después de los islotes se han asentado en la parte inferior del tubo por gravedad, aspirar el PBS con una micropipeta, desechar, y repetir esteEntra una vez.
- Añadir 500 l de ácido hielo frío tricloroacético (TCA, 10% w / v) y se incuba en hielo durante 30 min.
- Centrifugar los tubos a 16 000 g durante 3 min a 4 ° C.
- Aspirar el TCA, añadir 80 l de 0,3 N NaOH, y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Durante este tiempo, vigorosamente vórtice las muestras para s 5-10 cada 10 min.
- Agregar 4 ml de cóctel de conteo de Econo-seguro para 7 tubos de centelleo ml de líquido de recuento.
- Añadir 50 l de la muestra al tubo de centelleo contando, tapar el tubo, agitar brevemente, y cuentan en un contador de centelleo líquido.
- Medir la concentración de proteína utilizando el ácido bicinconínico (BCA) de ensayo y 10 ul de muestra de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Lleve a cabo el radioinmunoensayo de insulina siguiendo el protocolo del fabricante.
- Normalizar la secreción de insulina y los datos de la incorporación de timidina con el concentrado de proteínaentration.
[Nota: Los islotes se pueden visualizar utilizando un estereoscopio de disección o un microscopio estándar.]
[Nota: Como alternativa a la sedimentación por gravedad, los tubos pueden ser centrifugadas a 300 xg durante 1 min.]
3. Ensayo de incorporación de timidina
4. Análisis de Datos
5. Los resultados representativos
Un ejemplo del experimento para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata se muestra en la Figura 2. Este ejemplo muestra que la sobreexpresión adenoviral de la hipotética "Gene # 6" con firmeza estimula la replicación del islote, sin alterar la función celular beta. En el panel superior, los resultados del ensayo demuestran que la incorporación de timidina aumentar la expresión de "Gene # 6" aumenta la síntesis de ADN, medida por la incorporación de timidina. Dado que la mayoría de las células en el islote de rata son células beta, es probable que este aumento de la incorporación de timidina indica un aumento en la replicación de las células beta. Sin embargo, los experimentos de confirmación se debe realizar para establecer firmemente este. En el panel inferior, los resultados de la prueba de la secreción de insulina demuestran que la sobreexpresión de "Gene # 6" no alteró una de las funciones celulares primarias beta, es decir, insulin la secreción de la glucosa en baja y alta. La calidad del aislamiento de islotes y la salud de los islotes después del tratamiento con adenovirus se indica por el aumento de veces en la secreción de insulina en concentraciones de glucosa de baja y alta. Si el aumento de la expresión de "Gene # 6" alteración de la función de las células beta, esto es probable que se refleja como una disminución en la insulina secretada en altas concentraciones, estimuladores de glucosa (16,7 mM). Una curva dosis-respuesta para variar las concentraciones de glucosa también podría llevarse a cabo.
Figura 1. Visión general de protocolo para evaluar la replicación del islote y la función de células beta en los islotes aislados de ratas después de mediada por adenovirus alteraciones en la expresión génica. Recién aislados islotes de rata están expuestos a adenovirus durante 24 horas y después se cultivaron hasta 96 h. La incorporación de timidina se evalúa en la final de 24 h, seguido por la medición de la secreción de insulina ala glucosa baja y alta.
Figura 2. Los resultados de un experimento utilizando un adenovirus control y un adenovirus que sobreexpresan un gen hipotético etiquetado como "Gene # 6". El panel superior muestra la incorporación de timidina y el panel inferior de la secreción de insulina.
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Discussion
El establecimiento de las vías que pueden ser moduladas para estimular la replicación y mejorar la función de las células beta son relevantes para las dos formas principales de diabetes. Debido a que la masa de células beta funcionales depende de la existencia y función de las células secretoras de insulina, la evaluación de estos factores determinantes al mismo tiempo tiene sus ventajas. Este protocolo se describe un protocolo simplificado para determinar si la sobreexpresión o la supresión de una proteína conduce a cambios en la masa funcional de las células beta in vitro, que luego pueden ser analizadas para determinar la eficacia in vivo.
Una limitación de este protocolo es que el islote es un órgano de micro-compuesto de muchos tipos de células, incluyendo pero no limitado a alfa, beta, delta, épsilon, y las células de PP. Un cambio en la replicación del islote no completamente puede traducirse en un cambio en la replicación de las células beta porque el 80-90% de las células en el islote de rata son las células beta. La posibilidad de que un cambio observado en los islotesreplicación es debido a la replicación de células no beta existe. Por lo tanto, el siguiente paso lógico y de confirmación de este protocolo podría ser el examen de la replicación de las células beta con el uso de análogos de la timidina, junto a la inmunofluorescencia o análisis FACS 5,6. Este análisis de confirmación también puede aliviar el problema potencial de la incorporación de timidina no específica en islotes independientes de la proliferación.
Otro inconveniente potencial reside en la eficacia de transducción de los adenovirus. Una transducción de la eficiencia de 60-70% es razonable de conseguir, pero un factor determinante de la eficacia es el momento de la transducción adenoviral. Es esencial a la cultura de los islotes aislados de los adenovirus, tan pronto como sea posible para maximizar la eficiencia de la transducción. A las pocas horas después de que el aislamiento de islotes de la isla comienza a contraerse, lo que limita la capacidad de los adenovirus para penetrar profundamente en el corazón de la isla. El uso de un constructo reportero, tales comoun adenovirus GFP expresar, junto con el microscopio confocal puede ser beneficiosa para evaluar la eficacia de transducción.
Las principales ventajas de este protocolo son: 1) la eficacia de las pruebas múltiples determinantes de la masa funcional de las células beta en el mismo grupo de islotes y 2) el pequeño número de islotes necesarios para llevar a cabo el protocolo (un aislamiento de islotes de rata típica produce 400 islotes) . Estas ventajas permiten este protocolo para ser utilizado como una herramienta de detección de múltiples genes a un ritmo moderado.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH DK078732 (para PTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
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