Summary
الخلايا الدبقية الصغيرة يقيمون الضامة التي تقدم في السطر الأول من مراقبة الدفاع والمناعة في الجهاز العصبي المركزي. MicroRNAs هي جزيئات التنظيمية التي تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية بما في ذلك العديد من التنشيط وتمايز الضامة. في هذه المقالة، نحن تصف طريقة لقياس microRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا من سلالة الدم النخاعي الموجودة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1. هذه الخلايا تلعب دورا هاما في أمراض العديد من الأمراض المرتبطة neuroinflammation مثل التصلب المتعدد (MS) 2. الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي العادية التعبير عن بلعم علامة CD11b ويحمل النمط الظاهري يستريح بالإعراب عن مستويات منخفضة من علامات تفعيل مثل CD45. خلال أحداث مرضية في الجهاز العصبي المركزي، تصبح الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها على النحو الذي يحدده upregulation من CD45 وعلامات أخرى 3. ليست هي العوامل التي تؤثر على الخلايا الدبقية الصغيرة النمط الظاهري وظائف في الجهاز العصبي المركزي مدروسة. MicroRNAs (miRNAs) هي عائلة متزايد من الجزيئات المحمية (~ 22 النيوكليوتيدات طويلة) التي تشارك في العديد من العمليات الفيزيولوجية الطبيعية مثل نمو الخلايا والتمايز (4) والأمراض مثل التهاب 5. MiRNAs downregulate التعبير عن جينات معينة مستهدفة من قبل متواليات مكمل ملزم للالأشعة تحت الحمراء mRNAs وتلعب دورا مهما في تنشيط خلايا المناعة الفطرية بما في ذلك الضامة (6) والخلايا الدبقية الصغيرة 7. من أجل التحقيق ميرنا بوساطة المسارات التي تحدد النمط الظاهري دبقية صغيرة، وظيفة بيولوجية، وعلى التمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة من أنواع أخرى من الضامة، فإنه من المهم إجراء تقييم كمي للتعبير عن microRNAs خاصة في مجموعات فرعية مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة. الطرق الشائعة لقياس التعبير عن miRNAs في الجهاز العصبي المركزي وتشمل PCR الكمي من الأنسجة العصبية كله وتهجين موضعية. ومع ذلك، PCR الكمي من جناسة الأنسجة كله لا يسمح بتقييم التعبير عن ميرنا في الخلايا الدبقية الصغيرة، التي لا تمثل سوى 5-15٪ من خلايا الأنسجة العصبية. التهجين في الموقع يسمح بتقييم التعبير microRNA في أنواع معينة من الخلايا في المقاطع الأنسجة، ولكن هذه الطريقة ليست كمية تماما. نحن في هذا التقرير وصفا لكمية وSENSمكنته طريقة للكشف عن ميرنا من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الجهاز العصبي المركزي أو العادي خلال neuroinflammation باستخدام التهاب الدماغ والنخاع الذاتية التجريبية (EAE)، نموذج الفأر لمرض التصلب العصبي المتعدد. والطريقة الموصوفة أن تكون مفيدة لقياس مستوى من التعبير عن microRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي أو العادي خلال neuroinflammation المرتبطة بأمراض مختلفة بما في ذلك مرض التصلب العصبي المتعدد والسكتة الدماغية وإصابات الصدمة، ومرض الزهايمر وأورام المخ.
Protocol
1. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي عادي
يتم تنفيذ عزل الخلايا الدبقية الصغيرة كما وصفت سابقا مع بعض التعديلات 3.
- إعداد الأدوات اللازمة لتشريح ونضح: مقص، ملقط، 10 مل مع إبرة حقنة 27G، 15 مل Dounce الخالط (تفلون / زجاج)، و 40 خلية النايلون مصفاة ميكرون، 40٪ و 70٪ الحلول Percoll، 1X برنامج تلفزيوني.
- الموت ببطء الفئران عن طريق الخنق سريع (الحرمان من الاوكسجين) في كاميرا 2 ثاني أكسيد الكربون، ونقل فورا إلى مقاعد البدلاء المختبر للتلاعب الجراحية ونضح.
- تأدية معالجات جراحية (مقص وملقط واستخدام الايثانول 70٪ كمطهر): التجويف البريتوني مفتوحة، وقطع الحجاب الحاجز، وتجويف الصدر المفتوح وقص الأذين الأيمن مع مقص.
- تنفيذ كامل الجسم نضح intracardial عن طريق ضخ 10 مل حقنة في البطين الأيسر والضغط. تمر 8-10 مل من برنامج تلفزيوني 1X من خلال الدورة الدموية في السلطة الفلسطينية بطيئة وثابتةم.
- كرر الخطوات من 1،2-1،4 لجميع الفئران في مجموعة (الفئران عادة 5-10). بعد نضح الاحتفاظ الماوس على الجليد حتى يتم perfused جميع الفئران.
- بعد نضح من جميع الفئران، تشريح دماغ والنخاع الشوكي. (اختياري: لدراسة التعبير عن miRNAs في مناطق مختلفة من الدماغ، وتشريح هذه المناطق المحددة مثل المخيخ، وما إلى ذلك الحصين لمجموعة من الفئران 5-10 وتجمع بين بعضهم البعض للتجانس).
- التجانس العقول والنخاع الشوكي باستخدام 15 مل Dounce الخالط. مكان واحد في الدماغ والحبل الشوكي 1 في الخالط وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. نفذ غارات 10-20 لطيف؛ تمرير جناسة من خلال مصفاة خلية في أنبوب ML-مخروطي 50 و شهادة في 2000 دورة في الدقيقة في دقائق طرد مركزي كبير 5-7.
- تجاهل طاف والدماغ resuspend / الشوكي جناسة الحبل 2-3 الفئران في مل 5-7 من Percoll 70٪ وتراكب 7 مل من Percoll 40٪. تدور في 2000 دورة في الدقيقة (لا فرامل!) لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل الخلايا التالفة / الحطام الميلين على أعلى من 70٪ وجمع أحاديةالنووي في الخلايا واجهة / 40٪ 70٪. إضعاف الخلايا التي تم جمعها على الأقل في 1:01 مع PBS 1X وتدور في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 دقائق. Resuspend الخلايا في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني وتحويلها إلى 1،7 أنبوب ependorf مل. العائد النموذجي هو ~ 500 × 10 3 خلايا وحيدات النوى لكل فأر، والذي من شأنه أن يعطي عدد خلايا دبقية صغيرة ~ 1x10 6 في 0.5 مل من أجل إعداد خلايا من النخاع الشوكي والمخ من 2-3 الفئران.
2. السيطرة على الطهارة من الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل التدفق الخلوي
يتم تنفيذ تلطيخ مع الأجسام المضادة كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات 7،8.
- إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (1X برنامج تلفزيوني مع FBS 2٪)، والأجسام المضادة FCR منع ومكافحة CD11b-- المؤسسة العامة، ومكافحة CD45-APC-Cy7 الأجسام المضادة، لامتصاص العرق 1٪ في برنامج تلفزيوني.
- تأخذ 50 ميكروليتر من الخلايا من الخطوة 1.9 ونقلها إلى 1.7 جديد أنبوب إيبندورف مل وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إضافة ميكرولتر 5-10 المضادة للFCR الأجسام المضادة واحتضان 10-15دقائق على الجليد.
- انقسام الخلايا في أنابيب إيبندورف اثنين. إضافة إلى أنبوب واحد 1 ميكرولتر من CD11b المضادة - PE و 2 ميكرولتر أضداد CD45-APC-Cy7 واحتضان 10-15 دقيقة على الجليد. وسيتم استخدام أنبوب ثان كعنصر تحكم سلبية بالنسبة للتلوين الأجسام المضادة. بعد حضانة مع الأجسام المضادة إضافة 1 مل من المخزن إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية على حد سواء، وتدور في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة في 5400 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. بعد الغزل إصلاح الخلايا resuspending لهم في 400 ميكروليتر من 1٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني وvortexing.
- أداء تدفق تحليل الخلوي في عداد الكريات تدفق (LSR الثاني، العلوم البيولوجية دينار بحريني) دينار بحريني باستخدام compubeads دينار بحريني (العلوم البيولوجية) لعناصر التعويض كما وصفت 8. وترد أمثلة على الاستعدادات الجيدة والسيئة في الشكل. 1A، ب.
3. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة الطرفية من الجهاز العصبي المركزي الملتهبة في الفأر نموذج من Neuroinflammation
هو فعل المناعة الذاتية التهاب الدماغ التجريبية (EAE) كما وصفت سابقافي ورقتنا (7)؛ يتم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز على غرار بروتوكول نشرت 8.
- حث EAE عن طريق التحصين تحت الجلد مع 150 ملغ موج 35-55 الببتيد في 4 ملغ / مل كاملة مساند فرويند (CFA) من مجموعة من 5-10 من 8-12 أسابيع من العمر C57BL / 6 الفئران. وينبغي إيلاء توكسين السعال الديكي للملكية الفكرية (150 نانوغرام / الماوس) في أيام صفر وعلى مدى يومين، في مرحلة ما بعد التطعيم. ويلاحظ الفئران بحثا عن علامات على المرض ابتداء من اليوم 10 بعد التلقيح، ويتم تسجيل شدة المرض على نطاق والعددية 0-5 على النحو التالي: 0) لا المرض؛ 1) ذيل ضعيف أو سيرا على الأقدام متهاد، 2) هند شلل جزئي أطرافهم؛ 3) شلل أطرافه الخلفية، 4) شلل هند وforelimb؛ و 5) الموت أو القتل الرحيم لأسباب إنسانية. الفئران في ذروة المرض (D21 بعد التحصين) تستخدم لتجربة مع درجة المرض نموذجي تتراوح 1،5-2،5.
- عزل خلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي من مجموعة من الفئران 5-10 كما في خطوات 1،1-1،4 وصمة عار على الخلايا مع أجسام مضادة لمكافحة CD11b ومكافحة CD45، كما هو الحال في الخطوات 2،1-2،4.في الخطوة 2.4 لا تصلح الخلايا، بدلا من resuspend لهم في 400 ميكروليتر من PBS 1X بدلا من 1٪ لامتصاص العرق.
- يتم إجراء الفرز بواسطة خلية FACSAria للسكان من CD11b CD45 + الخلايا الدبقية الصغيرة المنخفضة وCD11b CD45 + الخلايا مرحبا (~ 80٪ منهم الضامة الطرفية و~ يتم تنشيط 20٪ منهم من الخلايا الدبقية الصغيرة (3)؛ في المستقبل سوف تشير مثل هذه الخلايا " الضامة "). استخدم 1.7 مل ependorf أنابيب لجمع العينات. وينبغي إضافة 300 ميكروليتر من PBS 1X مع FBS 10٪ للأنابيب جمع لمنع الضرر للخلايا التي تم فرزها. وترد أمثلة من ثلاثة تجمعات الخلايا الدبقية الصغيرة، الضامة، والخلايا اللمفية في الشكل. 2A مع الإعدادات الصحيحة بوابة الفرز هو مبين في الشكل. 2B. وكانت درجات نقاء الفرز نموذجي في 98-100٪ وفقا لما يحدده إعادة تحليل السكان فرزها من الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 2C) والضامة (الشكل 2D). العائد النموذجية 20-50 X10 3 للوالخلايا الدبقية الصغيرة50-100 X10 3 للالضامة معزولة عن مجموعة من خمسة فئران.
4. عزل الحمض النووي الريبي
وسيتم عزل الحمض النووي الريبي استخدام عدة mirVana وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع بعض التعديلات.
- تدور الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي طبيعي من الخطوة 1.9 أو مجموعات فرعية مرتبة من الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة خطوة من 3،3 في أنابيب إيبندورف 1.7 مل في 5400 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 دقائق في اجهزة الطرد المركزي الصغيرة، ونبذ بعناية طاف وتجميد الكريات الخلية على الثلج الجاف. انتقل إلى الخطوة 4.2 أو نقل كريات الخلايا المجمدة ل-70 C، حيث يمكن تخزينه لمدة 2-3 أشهر.
- نقل الكريات الخلايا المجمدة على الجليد العادية للذوبان. إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل من عدة mirVana وتخلط بلطف بواسطة pipeting 5-7 مرات.
- إضافة 30 ميكرولتر من المضافة جناسة من عدة mirVana، دوامة 30 ثانية للخلط، والحفاظ على الجليد لمدة 10 دقائق
- إضافة 300 ميكرولتر من حمض Pehnol: الكلوروفورم من عدة mirVana، دوامة 30 ثانية، وتدور لمدة 5 مفي 10000 دورة في الدقيقة في يوم الطرد المركزي الصغيرة.
- تأخذ بعناية المرحلة المائية العلوي (300 ميكرولتر) ونقل إلى أنبوب آخر 1.7 مل إيبندورف، المزيج مع 375 ميكرو لتر من الإيثانول بنسبة 100٪، ونقل لتصفية خرطوشة من عدة mirVana وتدور لمدة 1 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة.
- تجاهل التدفق من خلال العازلة، إضافة 700 ميكروليتر من محلول الغسيل أنا من عدة mirVana، وتدور لمدة 1 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة.
- غسل مرتين أخريين مع 500 ميكرولتر من غسيل حل ثانيا من عدة mirVana وأخيرا أزل الحمض النووي الريبي من خرطوشة مع 60 ميكرولتر من المياه nuclease خالية قبل ساخنة.
- ويتم تقييم كمية ونوعية من الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف Nanodrop. وينبغي تركيز الحمض النووي الريبي يكون 5-20 مل / نانوغرام والتطوير التنظيمي λ260 / λ280 نسبة ضمن نطاق 1،7-2،0. إذا تركيز الحمض النووي الريبي هو أقل من 3 نانوغرام / مل و260λ/280λ التطوير التنظيمي هو أقل من 1.6، يتم تجاهل هذه العينات. ويمكن تخزين عينات من الحمض النووي الريبي في -70 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرا.
- لمزيد من تقدير الجودة من الحمض النووي الريبي، وع العيناتتحليل الإلكتروني باستخدام الكهربائي للهلام في هلام TBE-اليوريا 15٪ (تقنيات الحياة). وترد أمثلة نموذجية من نوعية جيدة وسيئة من الاستعدادات الحمض النووي الريبي في الشكل. 3A وFig.3b، على التوالي.
5. الكشف عن ميرنا في الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة
لتحليل التعبير ميرنا، في الوقت الحقيقي الكمية عكس المنتسخة PCR (qRT-PCR) ويتم تحليل خارج باستخدام فحوصات TaqMan مع الاشعال وتحقيقات نيون للmicroRNA خاص من اهتمام واحد من RNAs على المدى القصير وأعرب بتواجد مطلق (على سبيل المثال snoRNA-55، snoRNA -135 أو U6) للتطبيع. ويمكن شراء الاشعال وتحقيقات فلوري لمجموعة معينة من البشر أو ميرنا الفار من الحياة تكنولوجيز هنا سوف نستخدم مير-124 كمثال لميرنا من الاهتمام وsnoRNA 55-كمثال للتطبيع.
- نفذ عكس رد فعل الناسخ لجعل [كدنا] من عينات الحمض النووي الريبي باستخدام TaqMan عدة النسخ العكسي:
| بند | حجم (ميكرولتر) لكل عينة |
| 5X RT التمهيدي | 1.00 |
| الحمض النووي الريبي عينة | 1.67 |
| RT الإنزيم ميكس | |
| 25 ملم كل dNTPs (100 مجموع ملي) | 0،050 |
| MultiScribe الناسخ العكسي) | 0،333 |
| 10X RT الواق | 0،500 |
| AB ريبونوكلياز المانع | 0،063 |
| Nuclease خالية من المياه | 1،388 |
| مجموع | 5.00 |
إضعاف الجيش الملكي النيبالي عينات إلى 3 تركيز نانوغرام / ميكروليتر. إعداد RT ميكس الإنزيم ووضع 3.33 ميكروليتر إلى الأنابيب PCR وإضافة 1.67 ميكروليتر من عينة الحمض النووي الريبي. احتضان في آلات PCR (BioRad) عند 16 درجة مئويةلمدة 30 دقيقة، و 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضعت في 4 درجات مئوية في الانتظار.
- نفذ في الوقت الحقيقي باستخدام PCR رد فعل TaqMan PCR المزيج:
| بند | حجم (ميكرولتر) لكل عينة |
| RT المنتج | 1.0 |
| 2X TaqMan ماستر ميكس | 5.0 |
| 5X التحقيق | 2.0 |
| Nuclease خالية من المياه | 2.0 |
| مجموع | 10.0 |
استخدام 384 لوحة واضحة تماما رد فعل بصري (تقنيات الحياة) عن كل رد فعل في الوقت الحقيقي وPCR صك AB HT 7900. الظروف الدراجات: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، [95 درجة مئوية لمدة 5 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية] دورات 40 ×.
- منحنيات نموذجية لمقدار fluoوصفت rescently محددة منتجات PCR (ص محاور) لsnoRNA-55 ومير 124 لعينات من الحمض النووي الريبي (كل عينة في التكرارات) معزولة عن الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة نخاع العظام المستمدة (BMDMs) في مقابل عدد من الدورات (X-محاور) و هو مبين في الشكل. 4A، ب.
6. التطبيع وتحليل البيانات
وتحسب مستويات التعبير النسبية لميرنا من الفائدة (مير 124) باستخدام أسلوب ΔΔCT كما هو موضح سابقا 7،9 باستخدام snoRNA-55 لتطبيع المبلغ الأولي من الحمض النووي الريبي.
- ويرد على سبيل المثال من حساب المستوى النسبي للتعبير-124 مير لالخلايا الدبقية الصغيرة وBMDMs في الجدول الأول.
- كخطوة أولى، يتم تحديد القيمة ط م لsnoRNA-55 ومير 124 لالخلايا الدبقية الصغيرة وBMDMs من qRT-PCR منحنيات (Fig.4؛ الجدول الأول، والأعمدة: snoRNA-55 ومير 124).
- وكخطوة ثانية، والقيم ΔCtوتحسب لكل مكررة من كل عينة من الطرح من ط م لsnoRNA-55 (التطبيع) من ط م لمير 124 (تجربة) (الجدول الأول، والأعمدة: CT (عرف)، ط م (التصدير)، وΔCt).
- وكخطوة ثالثة. يتم حساب القيم ΔΔCt من قبل الطرح من ΔCt من العينة المرجعية (ΔCt (المرجع)) من القيم ΔCt من عينات أخرى (الجدول الأول، العمود: ΔΔCt). يتم تعريف واحد عينة كمرجع؛ سيتم تحديد المستوى النسبي للتعبير عن ميرنا لهذه العينة و1.0. وسيتم مقارنة جميع العينات الأخرى لهذه العينة المرجعية. في حالتنا، ونحن تحديد مستوى من 124 مير في العينة الأولى لالخلايا الدبقية الصغيرة مثل 1.0، ولذلك ΔCt (المرجع) = 0.49. (الجدول الأول، الصف الأول، تميز باللون الأحمر)
- أخيرا، يتم حساب المستوى النسبي للتعبير كما ΔΔCt-2 (الجدول الأول، العمود: مير-124 هxpression).
- يتم تنفيذ جميع qRT-تقارير إتمام المشروعات في triplicates أو في التكرارات، ويقدم المستوى النسبي للتعبير كما يعني ± انحراف معياري (SD) لtriplicates (الشكل 5A، ب) أو على حد سواء جنبا إلى جنب مكررة كما هو مبين في الشكل. 5C.
7. ممثل النتائج
وتظهر منحنيات نموذجية في الوقت الحقيقي PCR والقيم CT ل 124 مير (microRNA من الفائدة) وsnoRNA 55 (التطبيع)، وكذلك المستويات النسبية للتعبير من 124 مير في الشكل. (4) والجدول الأول. في تجاربنا كنا snoRNA-55 كعنصر تحكم للتطبيع. كما ذكرنا أعلاه، يمكن في كل مكان RNAs وأخرى تستخدم أيضا للتطبيع مثل snoRNA-135 و U6.
وسيتم عرض نماذج من التعبير من 124 مير في البالغين الضامة الخلايا الدبقية الصغيرة نقي العظم مقابل المشتقة (BMDMs) في الشكل. 5A (كانت تزرع BMDMs في presenc(ه) من M-CSF كما هو موضح 7). في الشكل. 5B، قارنا التعبير من 124 مير في السكان فرزها من الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 منخفض مقابل CD45 الضامة مرحبا. في كل من هذه التجارب أثبتت لنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة تختلف عن غيرها من الضامة معربا عن مستويات أعلى من مير-124. لا يمكن أن يؤديها تجارب مماثلة في المستقبل لتفعيل حركية الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي أو في المختبر.
ويظهر التعبير مير-124 في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الجهاز العصبي المركزي من C57BL / 6 الفئران في مراحل مختلفة من التطور في الشكل. 5C. هذه البيانات تظهر أن الخلايا الدبقية الصغيرة في المراحل الأولى من التعبير عن تطوير مستويات أقل من 124 مير، التي ترتبط مع النمط الظاهري على المنشط 7. ويمكن إجراء تحليل مماثل لدراسة وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي طبيعي مثل المقارنة بين التعبير عن miRNAs خاصة في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي: المخيخ، قبينال الحبل، وما إلى ذلك الحصين
الشكل 1. الأمثلة على الاستعدادات الجيدة والسيئة من الخلايا الدبقية الصغيرة على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي. في حالة من العزلة "جيدة" من الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي العادية، 95-98٪ من الخلايا تمثل CD11b + CD45 microgla منخفض مع 2-5٪ من CD11b + CD45 مرحبا الضامة حول الأوعية. أقل من 1٪ من CD11b - CD45 الخلايا الليمفاوية مرحبا أو CD11b - CD45 - يجب أن الخلايا astroglial أو oligodendroglial أو أجزاء الخلية تكون موجودة (أ). يتم عرض حالة إعداد "سيئة" هنا (ب) حيث 18٪ من تلوث CD11b - CD45 - خلايا موجودة (ب، الربع السفلي الأيسر) مما يوحي عدم كفاية الفصل المتدرج Percoll. في حالة إعداد جيد، وينبغي أن 95-98٪ من الخلايا تمثل CD11b + CD45انخفاض الخلايا الدبقية الصغيرة (أ، رباعي اليسرى العليا)، وينبغي أن 2-5٪ من جميع الخلايا تمثل CD11b + CD45 الضامة مرحبا حول الوعاء (أ، رباعي العلوية اليمنى)، وأقل من 1٪ من كل الخلايا يجب أن تمثل CD11b سلبية الخلايا الملوثة (أ، خفض رباعي اليسار). في حالة "إعداد سيئة"، وتلوث كبير من CD11b - CD45 - خلايا أو أجزاء الخلية (دبق نجمي الخلايا والجزيئات المايلين إلخ) موجودة (ب، الربع السفلي الأيسر)، الأمر الذي يجعل من إعداد الخلايا غير مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي، وكذلك تحليل. وبالإضافة إلى ذلك، CD11b - يمكن أن خلايا CD45 مرحبا أيضا أن تكون موجودة في حالة "إعداد سيئة" (ب، الربع السفلي الأيمن) مما يدل على التلوث بواسطة الخلايا الليمفاوية في الدم بسبب عدم كفاية التروية.
الشكل 2. تدفق الخلوي تحليل سياسيق والفرز من السكان من الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة الطرفية من الجهاز العصبي المركزي المريضة (أ) خلال 3 neuroinflammation السكان من الخلايا الموجودة في الجهاز العصبي المركزي: CD11b + CD45 منخفضة (الخلايا الدبقية الصغيرة)، CD11b CD45 + مرحبا (الضامة)، وCD11b - CD45. مرحبا (الخلايا اللمفية)، كما هو موضح في اليمين، أعلى اليسار العلوي والسفلي الأيمن الأرباع، على التوالي. بوابات للفرز سكان + CD11b الخلايا الدبقية الصغيرة منخفضة CD45 وCD11b ترد + CD45 الضامة مرحبا في (ب) ويتم عرض درجات نقاء من السكان أعادوا تحليل فرزها في (ج، د). تم تنفيذ المعزولة الأولية على خلايا قابلة للحياة على أساس FSC / SSC المعلمات.
الشكل 3. أمثلة من النوعيه "جيدة" و "سيئة"المنشأ من RNAs معزولة عن الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليلها بواسطة الكهربائي للهلام. وفي حالة نوعية جيدة، والجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي الريبي الريباسي سلم هو واضح (أ). في حالة من نوعية سيئة، التشويه، وانخفاض الوزن وتدهور المنتجات الجزيئية واضحة (ب).
الشكل 4. في الوقت الحقيقي qRT-PCR منحنيات لfluorescently المسمى مير-124-55 وsnoRNA منتجات PCR. وتظهر المنحنيات لsnoRNA-55 (أ) ومير 124 (ب) عن الخلايا الدبقية الصغيرة ونقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs). وأجريت التجربة في التكرارات. وتحددت القيم المقطعية التي تقاطع خط الأساس مع الجزء السفلي من مجموعة خطية من qRT-PCR منحنيات كما هو مبين في الفقرة (ب). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| snoRNA-55 | مير-124 | DCT = ط م (التصدير)-CT (عرف) | DDCt = DCT-DCT (المرجع) | قريب من مستوى التعبير = 2-DDCt | |
| ط م (عرف) | ط م (التصدير) | DCT | DDCt | مير-124 التعبير | |
| الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي طبيعي | 24،082 | 24،572 | 0.49 (المرجع) | 0 | 1.0 |
| 23،766 | 24،291 | 0،525 | 0،035 | 1.02 | |
| نقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs) | 26،879 | 320.231 | 5،352 | 5،317 | 0،025 |
| 26،526 | 32،078 | 5،552 | 5،517 | 0،022 |
الجدول أولا حساب المستويات النسبية للمير 124 التعبير في الضامة الخلايا الدبقية الصغيرة نخاع العظم مقابل المستمدة من القيم تقوم تي سي ل 124 مير (microRNA من الفائدة) وsnoRNA 55 (مراقبة للتطبيع).
الشكل 5. تحليل مير 124 التعبير في الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة. يظهر مقارنة التعبير-124 مير في الجهاز العصبي المركزي الخلايا الدبقية الصغيرة من العادي مقابل نخاع العظم الضامة المشتقة (BMDMs) في (أ). ويرد مقارنة مير-124 في الخلايا الدبقية الصغيرة مقابل الضامة المحيطة معزولة عن الجهاز العصبي المركزي من في الفئران مع neuroinflammation في (ب). تغييرات فيويظهر مستوى التعبير مير-124 في الخلايا الدبقية الصغيرة خلال تنمية في الفئران من 1، 2، و 4 أسابيع من العمر بالمقارنة مع الفئران (في 8 أسابيع من العمر) في (ج). في (أ، ب) وأجريت التجربة في ثلاث نسخ مع يعني ± التنمية المستدامة من ثلاثة تفاعلات PCR منفصلة هو مبين. في (ج) وأجريت التجربة في التكرارات كما هو محدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مؤخرا اعطيت اهتماما كبيرا لدى الخلايا الدبقية الصغيرة وإشراك هذه الخلايا في العديد من الأمراض المرتبطة neuroinflammation وتنكس عصبي. وبالإضافة إلى ذلك، نما دور microRNAs في تمايز الخلايا المناعية والسرطان بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية 5،10. وذكرت ونحن في السابق دور مير-124 في الحفاظ على النمط الظاهري عدم تفعيلها أو يستريح من الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي العادية 7، ولكن الدور الذي تضطلع به أنواع أخرى من microRNAs في النمط الظاهري الخلايا الدبقية الصغيرة، وتفعيل دولة لا يزال يتعين اكتشافها. وهذا يتطلب تطوير أساليب جديدة لقياس التعبير ميرنا وتحديدا في الخلايا الدبقية الصغيرة.
هي الخلايا الدبقية الصغيرة صعوبة في التعامل مع التجارب في أنها تصبح تفعيلها وتتغير بشكل كبير بعد عزلتهم من الجهاز العصبي المركزي. ونشرت سابقا البروتوكولات لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي العادي 11،12. على الرغم من أن هذه البروتوكولات قد يزيد عدد الجياعد يكون من المفيد لعزل الحمض النووي الريبي، ونحن نعتقد أن هذه البروتوكولات هي أكثر ملاءمة للتعبير مرنا وليس لتقييم التعبير microRNA. أولا، استخدام العديد من المحققين الهضم الأنزيمي من النسيج المتجانس أو تنقية حبة المغناطيسي التي تستخدم لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ويؤدي إلى تغييرات كبيرة في التعبير microRNA (لم تنشر الملاحظة). ثانيا، استخدام الكتاب Trizol القائم على أساليب لعزل الحمض النووي الريبي (11) التي ليست الأمثل لتحليل microRNA في عدد صغير من خلايا دبقية صغيرة، خصوصا بالنسبة لأولئك السكان التي تم فرزها من الجهاز العصبي المركزي من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. هنا، نقدم لبروتوكول سريعة وبسيطة مع الحد الأدنى من خلال التلاعب عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي. هذا الأسلوب يسمح للاستقبال السكان نقية من الخلايا الدبقية الصغيرة مع مستويات الحد الأدنى من تفعيل تلقائي جنبا إلى جنب مع تقنية لعزل فعالة من الحمض النووي الريبي من عدد صغير من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي التي سيتم إثراء خاصةمع RNAs وغير الترميز قصيرة وmicroRNA.
وبالاضافة الى نقاء من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة، من المهم أيضا للتأكد من أن نوعية الحمض النووي الريبي هو مناسب. دون فصل مناسب من الخلايا الدبقية الصغيرة على التدرج Percoll النتيجة هي تلوث عينات من الحمض النووي الريبي مع الحطام المايلين، والتي من شأنها أن تجعل التنميط ميرنا في الخلايا الدبقية الصغيرة، ليس فقط من الصعب تفسير ذلك، ولكن أيضا يقلل من جودة من الحمض النووي الريبي بشكل جذري وليس بسبب وجود تركيز عال من الأحماض النووية والبروتينات، والدهون في جزيئات المايلين.
كما ذكرنا أعلاه، صعوبة كبيرة في التعبير عن قياس ميرنا في الخلايا الدبقية الصغيرة هو عدد قليل من الخلايا وكمية قليلة من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها حتى من مجموعة كبيرة من الفئران (10 أو أكثر). ولذلك فإننا نوصي وضع قائمة قصيرة من 10-30 microRNAs وتبدو على حدة على مستوى التعبير عن كل واحد باستخدام singleplex qRT-PCR بدلا من استخدام أقل حساسية متعددة المقايسات PCR أو صفائف أنتتطلب كمية عالية بدلا من الحمض النووي الريبي. بعد تقييم للتعبير عن microRNAs عدة singleplex qRT-PCR كما وصفنا، يمكن أن تستخدم أساليب أخرى ميرنا التنميط نطاق كبير بعد التحقق من صحة لها بعناية. مؤخرا، كان هناك تقرير عن وسيلة أكثر حساسية للتحليل متعدد microRNAs من على منصات على microfluidics 13، وهو ما يمكن اعتمدت على نطاق واسع لmicroRNA التنميط التعبير في الخلايا الدبقية الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS071039 R01-01A1 منحة بحثية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
