Summary
Mikroglia er bosiddende makrofager, der giver den første linje i forsvaret og immun-overvågning af det centrale nervesystem. MicroRNA er regulatoriske molekyler, som spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske processer, herunder aktivering og differentiering af makrofager. I denne artikel beskriver vi metoden til måling af microRNA i mikroglia.
Abstract
Mikroglia er celler af myeloid herkomst, som ligger i det centrale nervesystem (CNS) 1. Disse celler spiller en vigtig rolle i sygdomme i mange sygdomme forbundet med neuroinflammation såsom dissemineret sklerose (MS) 2. Mikroglia i en normal CNS udtrykke makrofag markør CD11b og udviser en hvilende fænotype ved at udtrykke lave niveauer af aktivering markører såsom CD45. Under patologiske begivenheder i centralnervesystemet, er blevet microglia aktiveres som bestemt ved opregulering af CD45 og andre markører 3. De faktorer, der påvirker microglia fænotype og funktion i CNS er ikke godt undersøgt. MicroRNA (miRNA) er en voksende familie af konserverede molekyler (ca. 22 nukleotider lange), der er involveret i mange normale fysiologiske processer, såsom cellevækst og-differentiering 4 og patologier, såsom inflammation 5. MiRNA nedregulere ekspressionen af visse målgener ved at binde komplementære sekvenserir mRNA'er og spiller en vigtig rolle i aktiveringen af medfødte immunceller, herunder makrofager 6 og mikroglia 7. For at undersøge miRNA-medierede veje, som definerer mikroglial fænotype, biologisk funktion, og til at skelne microglia fra andre typer af makrofager, er det vigtigt at kvantitativt at vurdere ekspressionen af bestemte microRNA'er i særskilte undergrupper af CNS-resident microglia. Almindelige metoder til måling af ekspression af miRNA i CNS omfatter kvantitativ PCR fra hele neuronvæv og in situ hybridisering. Imidlertid ikke kvantitativ PCR fra hele vævshomogenat ikke tillade vurdering af ekspressionen af miRNA i microglia, som kun udgør 5-15% af cellerne i neuronalt væv. Hybridisering in situ tillader vurdering af ekspressionen af microRNA i specifikke celletyper i vævssnit, men denne metode er ikke helt kvantitativ. I denne rapport beskriver vi en kvantitativ og sensitive fremgangsmåde til påvisning af miRNA ved real-time PCR microglia isoleret fra normale CNS eller under neuroinflammation hjælp eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), en muse-model for MS. Den beskrevne fremgangsmåde vil være nyttig til at måle niveauet af ekspression af microRNA'er i mikroglia i normale CNS eller under neuroinflammation forbundet med forskellige patologier, herunder MS, slagtilfælde, traumatisk skade, Alzheimers sygdom og hjernetumorer.
Protocol
1. Isolering af mikroglia fra normale CNS
Isolering af mikroglia udføres som beskrevet tidligere med modifikationer 3.
- Forberede instrumenter til dissektion og perfusion: saks, tænger 10 ml sprøjte med 27g kanyle 15 ml Dounce-homogenisator (Teflon / glas), 40 um nylon cellefilter, 40% og 70% Percoll opløsninger, 1X PBS.
- Afliv mus ved hurtig kvælning (berøvelse af ilt) i CO 2 kamera og straks overføre dem til laboratoriet bænk for kirurgiske manipulationer og perfusion.
- Udføre kirurgiske manipulationer (brug sakse og tænger og 70% ethanol som et antiseptisk): åben bughulen, skære membranen, åbne brysthulen og klippe det højre atrium med en saks.
- Udfør hele kroppen intracardial perfusion ved at injicere 10-ml sprøjte ind i venstre hjertekammer og pres. Pass 8-10 ml 1X PBS gennem blodcirkulationen ved langsom og stabil pace.
- Gentag trin 1,2-1,4 for alle mus i gruppen (typisk 5-10 mus). Efter perfusion holde musen på is indtil alle mus perfunderes.
- Efter perfusion i alle mus, dissekere hjerne og rygmarv. (Valgfrit: at studere udtryk for miRNA i forskellige områder af hjernen, dissekere disse specifikke områder såsom lillehjernen, hippocampus mv for gruppen af 5-10 mus og samle dem sammen til homogenisering).
- Homogenisere hjerne og rygmarv med 15 ml Dounce homogenisator. Placer en hjerne og en rygmarven i homogenisator og tilsættes 5 ml 1X PBS. Udfør 10-20 blide strejker; passere homogenatet gennem cellefilter i 50 ml-konisk rør og certifikat ved 2000 rpm på en stor centrifuge 5-7 minutter.
- Bortkast supernatanten, resuspender hjerne / rygmarv homogenat fra 2-3 mus i 5-7 ml 70% Percoll og belægning 7 ml 40% Percoll. Centrifugering ved 2000 rpm (ingen bremse!) I 30 minutter.
- Kassér beskadigede celler / myelin debris på toppen af 70% og indsamle mononukleare celler ved 40% / 70% grænsefladen. Fortynd opsamlede celler mindst en 1:1 med 1X PBS og centrifugering ved 2000 opm i 5-7 minutter. Resuspender celler i 0,5 ml PBS og overføre dem til 1,7 ml ependorf rør. Typisk udbytte er ~ 500 x 10 3 af mononukleære celler per mus, hvilket ville give antallet af mikrogliaceller celler ~ 1x10 6 i 0,5 ml til fremstilling af celler fra hjerner og rygmarv fra 2-3 mus.
2. Kontrol af renheden af Mikroglia ved flowcytometri
Farvning med antistoffer udføres som tidligere beskrevet med modifikationer 7,8.
- Forberede FACS-puffer (1X PBS med 2% FBS), FcR blokerende antistoffer, anti-CD11b - PE, anti-CD45-APC-Cy7 antistoffer, 1% paraformaldehyd i PBS.
- Tage 50 ul af cellerne fra trin 1.9 og overføre dem til nye 1,7 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 350 pi af FACS-buffer.
- Tilsæt 5-10 pi anti-FcR-antistoffer og inkuberes 10-15minutter på is.
- Opdele celler i to Eppendorf-rør. Tilføje et rør 1 pi anti-CD11b - PE og 2 pi anti-CD45-APC-Cy7 antistoffer og inkuber 10-15 minutter på is. Andet rør vil blive anvendt som en negativ kontrol for antistoffarvning. Efter inkubation med antistoffer tilsættes 1 ml af FACS-buffer til begge rør og centrifugering i små centrifuge ved 5400 rpm i 5 min. Efter centrifugering fiksere cellerne ved resuspendering dem i 400 pi 1% paraformaldehyd i PBS og vortexing.
- Udfør flowcytometri analyse på flowcytometer (LSR II, BD Biosciences) ved hjælp af BD compubeads (BD Biosciences) for kompensation kontrol som blev beskrevet 8. Eksempler på gode og dårlige præparater er vist i fig. 1a, b.
3. Isolering af Mikroglia og perifere Makrofager fra betændt CNS i musemodel af neuroinflammation
Eksperimentel autoimmun encephalitis (EAE) er induceret som tidligere beskreveti vort papir 7 FACS-sortering udføres på samme måde som offentliggjort protokol 8.
- Induktion af EAE ved subkutan immunisering med 150 mg MOG 35-55 peptid i 4 mg / ml komplet Freunds adjuvans (CFA) af gruppe på 5-10 8-12-uger gamle C57BL / 6 mus. Pertussis-toksin skal gives ip (150 ng / mus) på dag nul og dag to efter immunisering. Mus observeres for tegn på sygdom startende på dag 10 post-immunisering, og sygdommens alvorlighed vurderes på en numerisk skala fra 0-5 som følger: 0) ingen sygdom; 1) svag hale eller slingrende gang, 2) bagbenet parese; 3) bagbensparalyse; 4) bagben og forlem paralyse og 5) død eller aflivning grund humane årsager. Mus på toppen af sygdommen (D21 efter immunisering) anvendes til forsøg med typiske sygdom score i området fra 1,5 til 2,5.
- Isolere mononukleære celler fra CNS fra gruppen af 5-10 mus som i trin 1.1-1.4 og farves cellerne med anti-CD11b og anti-CD45-antistoffer som i trin 2,1-2,4.I trin 2,4 ikke løse celler, i stedet resuspenderes dem i 400 pi 1X PBS i stedet for 1% paraformaldehyd.
- Cell sortering udføres af FACSAria for populationer af CD11b + CD45 lav mikroglia og CD11b + CD45 hi celler (~ 80% af dem er perifere makrofager og ~ 20% af dem er aktiveret mikroglia 3, i fremtiden vil vi henvise disse celler som " makrofager "). Brug 1,7-ml ependorf rør til opsamling af prøverne. 300 gl af 1X PBS med 10% FBS skal tilføjes til opsamlingsrør for at forhindre beskadigelse af de sorterede celler. Eksempler på de tre populationer af mikroglia, makrofager og lymfocytter, er vist i fig. 2a med korrekte sortering gate indstillinger vist i fig. 2b. Typiske sortering renheder blev ved 98-100% som bestemt ved reanalyzing sorteret populationer af mikroglia (fig. 2c) og makrofager (fig. 2D). Typisk udbytte er 20-50 x10 3 til microglia og50-100 x10 3 for makrofager isoleret fra gruppen bestående af fem mus.
4. Isolering af RNA
RNA isoleres ved hjælp af Mirvana kittet ifølge producentens anvisninger med modifikationer.
- Spin microglia fra normale CNS fra trin 1.9 eller sorteret delmængder af mikroglia og makrophager fra trin 3.3 1,7 ml-Eppendorf-rør ved 5400 opm i 5-7 minutter i små centrifuge, omhyggeligt Supernatanten kasseres, og fryse de cellepellets på tøris. Videre til trin 4.2 eller overføre frosne cellepellets til -70 C, hvor den kan opbevares i 2-3 måneder.
- Overfør frosne cellepelleter jævnligt is til optøning. Tilsæt 300 pi lysisbuffer fra Mirvana kit og forsigtigt blandes ved pipettering 5-7 gange.
- Tilsæt 30 gl af homogenatet Additiv fra Mirvana kit, vortex 30 sekunder for at blande, holde på is i 10 minutter
- Tilsæt 300 ul af syre-Pehnol: Chloroform fra Mirvana kit, vortex 30 sekunder, spin for 5 mi ved 10.000 rpm i små centrifuge.
- Omhyggeligt tage øvre vandige fase (300 pi) og overføres til et 1,7 ml eppendorfrør, blandes med 375 ul 100% ethanol, overført til filterpatronen fra Mirvana kit og centrifugering i 1 minut ved 10.000 omdrejninger pr.
- Skille gennemstrømning buffer tilsættes 700 ul vaskeopløsning I fra Mirvana kit, og centrifugering i 1 minut ved 10.000 omdrejninger pr.
- Vaskes to gange med 500 ul vaskeopløsning II fra Mirvana kit og til slut elueres RNA fra patronen med 60 ul af forvarmet nuclease-frit vand.
- Mængden og kvaliteten af RNA vurderes ved anvendelse Nanodrop spektrofotometer. Koncentrationen af RNA bør være fra 5 til 20 ng / ml og OD λ260 / λ280 forholdet i området fra 1,7 til 2,0. Hvis koncentrationen af RNA er lavere end 3 ng / ml og OD 260λ/280λ er lavere end 1,6, er prøverne kasseres. RNA-prøver kan opbevares ved -70 ° C i 6-12 måneder.
- For yderligere vurdering af kvaliteten af RNA, prøver ARe analyseret under anvendelse af gelelektroforese i 15% TBE-urea-gel (Life Technologies). Typiske eksempler på gode og dårlige kvalitet af RNA-præparater er vist i fig. 3a og fig. 3b, hhv.
5. Påvisning af miRNA i Mikroglia og makrofager
Til analyse af miRNA ekspression analyser kvantitativ realtids-revers transkriptase PCR (QRT-PCR) udføres under anvendelse af TaqMan assays med primere og fluorescerende prober til særlig microRNA af interesse og en af de ubikvitært udtrykt korte RNA (f.eks snoRNA-55, snoRNA -135 eller U6) til normalisering. Primere og fluorescerende prober for bestemte grupper af mennesker eller muse miRNA kan købes fra Life Technologies Inc. Her vil vi bruge miR-124 som et eksempel for miRNA af interesse og snoRNA-55 som et eksempel for normalisering.
- Reverse transkriptase-reaktionen til at fremstille cDNA fra RNA-prøver under anvendelse TaqMan revers transcription kit'et:
| Item | Volumen (pl) pr prøve |
| 5x RT Primer | 1,00 |
| RNA-prøven | 1,67 |
| RT enzymblanding | |
| 25 mM af hver (100 mM total) dNTP'er | 0,050 |
| MultiScribe revers transkriptase) | 0,333 |
| 10X RT-buffer | 0,500 |
| AB RNase-inhibitor | 0,063 |
| Nuklease-frit vand | 1,388 |
| Total | 5,00 |
Fortyndes RNA-prøver til koncentration 3 ng / ul. Forberede RT enzymblanding og sat 3,33 uL til PCR-rør, og der tilsættes 1,67 pi af RNA-prøven. Inkuber i PCR Instrument (BioRad) ved 16 ° Ci 30 minutter, 42 ° C i 30 minutter, 85 ° C i 5 minutter, og indstillet til 4 ° C i venteposition.
- Udføre real-time PCR reaktion under anvendelse TaqMan PCR-blanding:
| Item | Volumen (pl) pr prøve |
| RT produkt | 1,0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5,0 |
| 5X Probe | 2,0 |
| Nuklease-frit vand | 2,0 |
| Total | 10,0 |
Brug en 384-godt klar optisk reaktionsplade (Life Technologies) for hver reaktion og real-time PCR instrument AB 7900 HT. Cyklusbetingelser: 95 ° C i 10 minutter, [95 ° C i 5 sek, 60 ° C i 60 sek] x 40 cyklusser.
- Typiske kurver for mængden af Fluorescently mærkede specifikke PCR-produkter (Y-akse) for snoRNA-55 og miR-124 til RNA-prøver (hver prøve er dubletter) isoleret fra mikroglia og knoglemarv afledte makrofager (BMDMs) vs antal cykler (x-akse) er vist i fig. 4a, b.
6. Normalisering og dataanalyse
Relative ekspressionsniveauer for miRNA af interesse (MIR-124) er beregnet ved hjælp af ΔΔCT metoden som tidligere beskrevet 7,9 anvendelse snoRNA-55 til normalisering af den oprindelige mængde af RNA.
- Eksempel til beregning af det relative niveau af miR-124 ekspression af mikroglia og BMDMs er vist i tabel I.
- Som et første skridt, er Ct-værdier for snoRNA-55 og miR-124 bestemmes for mikroglia og BMDMs fra QRT-PCR-kurver (Fig. 4, tabel I, kolonne: snoRNA-55 og miR-124).
- Som et andet skridt, værdier ΔCtberegnes for hver kopi af hver prøve ved subtraktion af CT til snoRNA-55 (normalisering) af CT til miR-124 (eksperiment) (tabel I, kolonne: Ct (NORM), CT (Exp) og ΔCt).
- Som et tredje skridt. ΔΔCt værdier beregnes ved subtraktion af ΔCt af referenceprøven (ΔCt (Ref)) fra ΔCt værdier af andre prøver (tabel I, kolonne: ΔΔCt). En prøve er defineret som en reference; det relative niveau af miRNA udtryk for denne prøve vil blive defineret som 1,0. Alle andre prøver vil blive sammenlignet med denne reference prøve. I vores tilfælde, definerer vi niveauet for miR-124 i den første prøve for mikroglia som 1,0, derfor ΔCt (Ref) = 0,49 (tabel I, første række, markeret med rødt).
- Endelig er det relative niveau af ekspression beregnet som 2-ΔΔCt (tabel I, kolonne: miR-124 eXPRESSION).
- Alle QRT-PCR'er udført i tredobbelt eller dubletter, og det relative niveau af ekspression er vist som middelværdi ± standardafvigelser (SD) for triplikater (fig. 5a, b) eller både dubletter ved siden af hinanden som vist i fig. 5c.
7. Repræsentative resultater
Typiske kurver for real-time PCR og CT-værdier for miR-124 (microRNA af interesse) og snoRNA-55 (normalisering) og relative niveauer af ekspression af miR-124 er vist i fig. 4 og tabel I. I vores eksperimenter anvendte vi snoRNA-55 som en kontrol for normalisering. Som nævnt ovenfor kan andre allestedsnærværende RNA kan også anvendes til normalisering, såsom snoRNA-135 og U6.
Eksempler på ekspressionen af miR-124 i voksne mikroglia vs knogle-marv-afledte makrofager (BMDMs) er vist i fig. 5a (BMDMs blev dyrket i presence M-CSF som beskrevet 7). I fig. 5b, sammenlignede vi ekspressionen af miR-124 i sorterede populationer af CD45 lav microglia vs CD45 hi makrofager. I begge disse eksperimenter demonstrerede vi, at mikroglia er forskellige fra andre makrofager ved at udtrykke høje niveauer af miR-124. Lignende eksperimenter kan udføres i fremtiden for kinetik microglia aktivering in vivo eller in vitro.
Ekspression af miR-124 i microglia isoleret fra CNS af C57BL / 6 mus på forskellige stadier af udvikling er vist i fig. 5c. Disse data viser, at mikroglia i de tidlige stadier af udvikling udtrykker lavere niveauer af miR-124, som stemmer overens med deres fænotype 7. Lignende analyse kan udføres for at studere funktionen af mikroglia i normale CNS, såsom sammenligning af ekspressionen af bestemte miRNA i microglia isoleret fra forskellige områder af centralnervesystemet: cerebellum, sPinal ledning, hippocampus etc.
Figur 1. De eksempler på gode og dårlige tilberedninger af mikroglia som bestemt ved flowcytometri. I tilfælde af "gode" isolering af mikroglia fra normale CNS, udgør 95-98% af cellerne CD11b + CD45 lav microgla med 2-5% af CD11b + CD45 hi perivaskulære makrofager. Mindre end 1% af CD11b - CD45 hi lymfocytter eller CD11b - CD45 - astrogliale eller oligodendroglial celler eller cellefragmenter bør være til stede (a). Sagen om "dårlige" præparat er vist her (b), hvor 18% af forurenende CD11b - CD45 - celler er til stede (b, nederste venstre kvadrant) tyder på utilstrækkelig Percoll gradient adskillelse. I tilfælde af god præparat bør 95-98% af cellerne repræsenterer CD11b + CD45lav microglia (a, øvre venstre kvadrant), bør 2-5% af alle celler repræsenterer CD11b + CD45 hi perivaskulære makrofager a, øvre højre kvadrant), og mindre end 1% af alle celler repræsentere CD11b negative kontaminerende celler (en, nederste venstre kvadrant). I tilfælde af "dårlige præparat", signifikant forurening af CD11b - er celler eller cellefragmenter (astroglia, myelin partikler etc.) til stede (b, nederste venstre kvadrant), hvilket gør forberedelsen af cellerne uegnede til RNA-isolering og yderligere - CD45 analyse. Hertil kommer, CD11b - kunne CD45 hi celler også være til stede i tilfælde af "dårlige præparat" (b, nederste højre kvadrant), hvilket indikerer forurening af blodlymfocytter på grund af utilstrækkelig perfusion.
Figur 2. Flowcytometri analysis og sortering af populationer af mikroglia og perifere makrofager fra syge CNS (a) Under neuroinflammation tre populationer af celler er til stede i CNS'et: CD11b + CD45 lav (microglia), CD11b + CD45 HI (makrofager), og CD11b - CD45. hi (lymfocytter), som vist i øvre venstre, øvre højre og nederste højre kvadranter, hhv. Porte til sortering populationer af CD11b + CD45 lav mikroglia og CD11b + CD45 hi makrofager er vist i (b) og renheder på genanalyseret sorterede populationer er vist i (c, d). Indledende gating på levedygtige celler baseret på FSC / SSC parametre blev gennemført.
Figur 3. Eksempler på "gode" og "dårlige" kvsøgelser af RNA'er isoleret fra mikroglia og analyseret ved gelelektroforese. I tilfælde af god kvalitet, er RNA stige og ribosomalt RNA tydelig (a). I tilfælde af dårlig kvalitet, udstrygning, og lavmolekylære nedbrydningsprodukter er tydelig (b).
Figur 4. Tidstro QRT-PCR kurver for fluorescensmærket miR-124 og snoRNA-55 PCR-produkter. Kurver for snoRNA-55 (a) og miR-124 (b) er vist for mikroglia og knogle-marv-afledte makrofager (BMDMs). Eksperimentet blev udført in duplo. Ct-værdier blev bestemt ved skæringen mellem basislinje med den nedre del af lineære område QRT-PCR kurver som vist i (b). se større figur .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = Ct (Exp)-Ct (Norm) | DDCt = DCT-DCT (Ref) | Relative Expression = 2-DDCt | |
| Ct (Norm) | Ct (EXP) | DCT | DDCt | miR-124 Expression | |
| Microglia fra normale CNS | 24,082 | 24,572 | 0,49 (Ref) | 0 | 1,0 |
| 23,766 | 24,291 | 0,525 | 0,035 | 1,02 | |
| Knoglemarv afledte makrofager (BMDMs) | 26,879 | 320,231 | 5,352 | 5,317 | 0,025 |
| 26,526 | 32,078 | 5,552 | 5,517 | 0,022 |
Tabel I. Beregning af relative niveauer af miR-124 udtryk i mikroglia vs knoglemarv afledt makrofager baseret på C t værdier for miR-124 (microRNA af interesse) og snoRNA-55 (kontrol for normalisering).
Figur 5. Analyse af miR-124-ekspression i mikroglia og makrophager. Sammenligning af miR-124-ekspression i microglia fra normale CNS vs knoglemarvsafledte makrofager (BMDMs) er vist i (a). Sammenligning af miR-124 i microglia vs perifere makrofager isoleret fra CNS af i mus med neuroinflammation er vist i (b). Ændringer iNiveauet af ekspression af miR-124 i microglia under udvikling hos mus med 1, 2 og 4 uger gamle ved sammenligning med voksne mus (ved 8 uger gamle) er vist i (c). I (a, b) eksperiment blev udført in triplo med middelværdi ± SD af tre separate PCR-reaktioner er vist. I (c) eksperiment blev udført in duplo som angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylig væsentlig interesse blev givet til microglia og involvering af disse celler i mange patologier forbundet med neuroinflammation og neurodegeneration. Desuden har rolle microRNA'er i differentieringen af immun-og cancerceller dramatisk dyrket i løbet af de sidste mange år 5,10. Vi har tidligere rapporteret rolle miR-124 i opretholdelse af ikke-aktiverede eller hvilende fænotype af mikroglia i normale CNS 7, men rollen af de andre typer microRNA'er i microglia fænotype og aktivering tilstand stadig at blive opdaget. Dette kræver udvikling af nye metoder til måling miRNA ekspression specifikt i microglia.
Mikroglia er vanskelige celler til at håndtere i eksperimenter, da de bliver aktiveret og væsentlig ændret efter deres isolation fra CNS. Protokollerne for isolering af mikroglia fra normale CNS tidligere publiceret 11,12. Selv om disse protokoller could være nyttige til RNA-isolering, mener vi, at disse protokoller er mere egnede til mRNA-ekspression frem for at vurdere microRNA ekspression. Første, mange forskere bruger enzymatisk nedbrydning af homogeniseret væv eller magnetisk perle rensning at aktivere mikroglia og medfører væsentlige ændringer i microRNA udtryk (ikke offentliggjort observation). Sekund, anvender forfatterne Trizol-baserede fremgangsmåder til RNA-isolering 11, som ikke er optimal for microRNA analyse i et lille antal mikrogliaceller celler, især for de populationer, der blev sorteret fra CNS ved FACS. Her præsenterer vi en hurtig og simpel protokol med minimale manipulationer under isolering af mikroglia fra CNS. Denne fremgangsmåde tillader modtagelse af rene populationer af microglia med minimale niveauer af spontan aktivering kombineret med en teknik til effektiv isolering af RNA fra et lille antal celler. Derudover brugte vi protokollen til isolering af RNA, som vil blive særligt berigetmed korte ikke-kodende RNA og microRNA.
Udover renheden af isoleret mikroglia, er det også vigtigt at sikre, at kvaliteten af RNA, er egnet. Uden passende adskillelse af mikroglia på Percoll-gradient resultatet er forurening af RNA-prøver med myelin rester, som ville gøre miRNA profilering i microglia ikke blot vanskelig at fortolke, men også nedsætter kvaliteten af RNA snarere drastisk på grund af en høj koncentration af nucleinsyrer, proteiner og lipider i myelin partikler.
Som nævnt ovenfor, en væsentlig vanskelighed ved måling miRNA ekspression i microglia er det lille antal celler og lav mængde af RNA opnået selv fra en stor gruppe af mus (10 eller mere). Derfor vil vi anbefale, at lave en kort liste over 10-30 microRNA og se særskilt på niveauet for ekspression af hver af en bruger singleplex QRT-PCR stedet for at bruge mindre følsomme multiplex PCR-analyser eller arrays, derkræver en temmelig stor mængde af RNA. Efter vurdering af ekspressionen af adskillige microRNA'er ved singleplex QRT-PCR, som vi beskrevet, kan andre store miRNA profilering metoder anvendes efter omhyggelig validering. For nylig var der en rapport om en mere følsom metode til multiplex-analyse af microRNA på mikrofluidik platforme 13, som potentielt kunne blive vedtaget i stor skala microRNA udtryk profilering i mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af NIH R01 NS071039-01A1 forskningsbevilling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
