Non du plasma Collage de PDMS pour fabrication bon marché de dispositifs microfluidiques

Summary

Dans cette vidéo, nous montrent comment utiliser le neurone dispositif microfluidique sans collage plasma.

Abstract

Dans cette vidéo, nous montrent comment utiliser l'appareil neurone microfluidique sans collage plasma. Dans certains cas il peut être souhaitable d'appareils réversible obligataire au verre Corning n ° couvercle 1. Cela pourrait être dû, peut-être, un nettoyeur de plasma ne sont pas disponibles. Dans d'autres cas, il peut être souhaitable de supprimer le périphérique du verre après la mise en culture des neurones à certains types de microscopie ou d'immunomarquage, si elle n'est pas nécessaire d'enlever l'appareil pour l'immunocoloration depuis les neurones peuvent être colorées dans l'appareil. Certains chercheurs, cependant, préfèrent encore pour supprimer le périphérique. Dans ce cas, le collage réversible de l'appareil pour le couvercle en verre rend cela possible. Il ya certains inconvénients à la non-plasma collage des dispositifs dans ce pas aussi serré d'un joint est formé. Dans certains cas, les axones peuvent croître sous les rainures plutôt que par eux. Aussi, parce que le verre et le PDMS sont hydrophobes, liquides ne sont pas facilement entrer dans le dispositif qui rend parfois nécessaire de forcer les médias et les autres réactifs dans l'appareil. Liquides entreront dans le dispositif via l'action capillaire, mais cela prend beaucoup plus de temps par rapport aux dispositifs qui ont été collés de plasma. Le nettoyeur plasma crée temporaires charges hydrophiles sur le verre et le dispositif qui facilitent l'écoulement des liquides à travers le dispositif après le collage en quelques secondes. Pour les non-plasma appareils liés, le flux de liquide à travers les appareils prend plusieurs minutes. Il est également important de noter que les dispositifs pour être utilisé avec du plasma non collage doivent être stérilisés d'abord, alors que les appareils plasma traité n'ont pas besoin d'être stérilisés avant leur utilisation, car le nettoyeur plasma va les stériliser.

Protocol

Préparation Dispositifs microfluidiques pour la culture cellulaire Neuron

1) Nettoyer Corning No.1 24 X 40 mm lames de verre mm

• Soniquer les lames de verre dans un bain d'eau sonicateur pendant 30 minutes
• Rincer les lames de verre avec de l'EtOH 70%
• Laver les lames trois fois avec dH ₂ O
• Diapositives à sec dans une hotte de culture tissulaire pendant plusieurs heures, de préférence la nuit

Note: Nous avons des plateaux métalliques spéciales que nous charger avec les diapositives. Les lames sont séparées individuellement et placé dans des fentes dans cette grille métallique. Nous pouvons alors placer ces plateaux de chargement de métal dans un plat en verre que nous remplir d'eau, place dans le sonicateur bain d'eau, et soniquer pendant 30 minutes. Lavages suivants sont effectués dans ce plat.

2) Préparer les périphériques PDMS

• Découpez le moule PDMS de la plaquette de silicium, percer des trous dans le plâtre et le PDSM trimestre, elle
• Nettoyer les appareils PDMS abord par soufflage de gaz inerte (argon ou azote) à travers eux. Ensuite, utilisez 3M Scotch 471 ruban adhésif à décoller tous les débris

Note: Il est important de garder les appareils face. Initialement, lorsque nous avons coupé le PDMS loin de la plaquette de silicium, la face en contact avec la plaquette est du côté propre: il contient les canaux microfluidiques. Nous essayons d'être aussi prudents que nous pouvons pour ne pas endommager l'appareil, et de garder la face latérale de nettoyage jusqu'à ce que nous sommes prêts pour le collage de plasma.

• Périphériques autoclave dans des contenants en plastique
• Après autoclavage, propre n ° 1 des lames de verre Corning et de plasma traitent dispositifs utilisant un nettoyant Harrick plasma de marque, www.harrickplasma.com
• Placez les appareils propres à l'envers sur la lame de verre.

Le dispositif est maintenant le plasma collé à la lame de verre.

3) Les appareils avec revêtement en poly L-lysine (PLL)

• PLL est ajoutée à un puits de chaque côté de l'appareil et s'écouler à travers dans le puits la prochaine

=> 150 pi de PLL pour les grands godets et 30 μ L PLL pour les puits plus petits. Il n'a pas à être exact aussi longtemps que les puits sont pleins.

Remarque: Si vous regardez un appareil, vous verrez 4 puits: chaque deux sont liés. Vous voulez mettre la PLL dans un puits afin qu'il s'écoule à travers le dispositif dans le puits suivant.

• Autoriser la PLL de circuler à travers l'appareil pendant environ 10 minutes, puis ajouter de PLL dans les puits pour les remplir
• Placez les appareils contenant PLL dans une étuve à 37 ° C pour un minimum de 4 heures (une nuit de préférence)
• Vide à l'excès PLL après le traitement, mais attention à ne pas aspirer tout le liquide hors de l'appareil

Remarque: Vous ne voulez pas d'introduire des bulles d'air vers les canaux ou de la chambre. Juste à vide à l'excès de PLL dans les puits.

• Ajouter autoclavé dH ₂ O pour chaque puits de chaque côté de l'appareil, et laisser couler pour le bien des autres par capillarité

La figure 1 est un schéma d'un dispositif microfluidique. Remarquez comment le bleu (Soma côté) est connecté et la Croix-Rouge (côté axonale) sont connectés. Quand nous disons mis le PLL, ou de l'eau ou des médias, sur un puits de chaque côté de l'appareil, ce que nous entendons, par exemple, est la suivante: Placer 150 ul d'autoclave dH O ₂ dans un bleu bien puis placez 150 pi de autoclavé dH ₂ 0 dans un rouge bien. L'eau (ou PLL, ou des médias, ou cellules) circulera à travers le dispositif pour le bien d'autres correspondants.

Figure 1

Note: S'il vous plaît noter que, à partir de maintenant, quand je dis «médias lieu, les cellules, l'eau ou PLL dans le TOP puits", je me réfère au schéma ci-dessus où le Soma serait sur ​​la gauche et les axones va croître à l' droite.

• Aspirer l'eau (encore une fois attention à ne pas supprimer complètement tout le liquide de l'appareil), puis ajouter un autre 150 ul d'autoclave dH ₂ O à l'un de chaque bien relié et lui permettre de circuler à travers le puits correspondant.
• Placez l'appareil contenant dH ₂ O dans une étuve à 37 ° C pendant 1 heure, puis répétez l'étape de lavage à nouveau. Laver les appareils à trois reprises avec dH ₂ O pour une heure chacune, ce qui est du total.

Remarque: En raison de la possibilité que le borate de la PLL peut absorber dans le PDMS, certains dans le laboratoire de Jeon recommandons incubant les appareils pendant la nuit avec autoclave dH ₂ O après une couple de iINITIALE rinçages rapides. Cela permettra d'assurer que tous borate libre lixiviation hors du PDMS avant le chargement des cellules. Si cela n'est pas fait, il peut y avoir un communiqué de borate dans les médias au fil du temps, ce qui pourrait conduire à une cytotoxicité.

• Ajouter Neural milieux de base (NBM) avec les facteurs nécessaires (glutamax, B27, Penstrep) dans les puits de haut

Remarque: Les appareils peuvent être incubées pendant la nuit et plaqué avec des cellules le jour suivant, ou incubés un minimum de 3 heures avec des facteurs + NMB avant l'étalement des cellules.

Préparer les neurones pour le chargement dans les dispositifs

Nous utilisons 18 jours cortex vieille de fœtus de rat que l'on soit d'acheter d'une compagnie appelée Bits cerveau ou qui est préparé sur le campus pour nous. Nous préférons pour obtenir le tissu frais.

1. Obtenir une cortex cérébral du foetus (2 morceaux de tissus) stockés dans Hibernate E
2. Prenez 3 pipettes de verre longues et les incendies dans des tailles de chaque successivement plus petits en utilisant une lampe à alcool
3. retirer les tissus d'Hibernate E avec une pipette en verre et le placer dans 2 ml de facteurs + NMB dans un tube de 15 ml stériles.
4. Trituration: aide d'une pipette en verre bulbe et le cortex est passé de haut en bas d'environ 5 à 10 fois. Ensuite, la pipette inférieur suivant est utilisé pour la pipette de haut en bas le tissu. Enfin, la plus petite pipette est utilisé pour la pipette de haut en bas le tissu. Nous aimons à vous assurer qu'il n'ya pas de morceaux visibles.
   
   Remarque: Récemment, le laboratoire a commencé à comparer les cellules Jeon à partir de tissus conservés dans Hibernate E aux cellules qui ont été préparés à partir de tissus initialement traités par la trypsine 0,125% dans 50% de Ca + + libre et Mg + + tampon de dissection libre. Le consensus est que les tissus préparés en utilisant la trypsine rendement des cellules plus viable que les tissus initialement placé dans Hibernate E. Si vous n'allez pas utiliser le tissu tout de suite, alors vous avez besoin pour stocker les tissus dans Hibernate E.
   
   Si vous envisagez d'utiliser le tissu de suite et je voudrais la viabilité accrue, puis de traiter les tissus par la trypsine avant trituration mécanique comme suit: 1) diluer 1 ml 0,25% de trypsine (Gibco, Invitrogen) avec 1 ml de Ca + + libre Mg + + gratuitement mémoire tampon de dissection (finale trypsine = 0,125%) dans un tube de 15 ml (conserver au froid de la glace); tissus placer 2) dans un tampon et incuber immédiatement à 37 ° C pendant 8 minutes; 3) ajouter 10 ml DMEM/10% de FBS pour arrêter le réaction de la trypsine et de continuer le protocole ci-dessous.
   
   
5. Centrifuger les cellules à 1100 rpm pendant 1 minute
6. Les médias aspiré hors attentivement le culot cellulaire
7. Ajouter 1 ml de facteurs + NMB au culot et remises en suspension par aspiration et refoulement
8. Passez les cellules remises en suspension par écoulement gravitaire à travers un filtre pour enlever les grumeaux (BD Falcon cellules tamis en nylon 40 um)
9. Comte et cellules de la plaque:
   • Dans un tube de centrifugeuse, ajouter 60 ul + NMB facteurs, 20 pl de suspension cellulaire, et 20 pi de bleu trypan puis mélanger
   • Ajouter environ 10 pi de cette solution à un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (pas bleu)
   • Ajuster la concentration de 2.5 à 4.5 x10 ⁶ cellules / ml
     
     Remarque: Nous obtenons généralement une concentration d'environ 2.5 à 4.5 x 106 cellules / ml. selon le volume des cellules sont remises en suspension dans (normalement 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Si le tissu a été préparé par la trypsine, le rendement sera probablement augmenté.

Placage Les dispositifs

1. Charge cellules (neurones primaires) dans un puits de l'appareil
2. Planche 5 ul par petit appareil et 20 pi par appareil grands
   
   Note: Vous pouvez charger 10 pi de cellules sur le dessus de l'appareil et 10 ul sur le fond de l'appareil (la moitié du volume total), ou directement tous les 20 ul de cellules dans le bien supérieure Somal (5 pi dans le Somal dessus ainsi pour les petits appareils).
   
   
3. Incuber pendant 10 minutes dans un incubateur à 37 ° C pour les cellules peuvent commencer à attacher
4. Ajouter ul environ 150/30 de facteurs + NMB dans chaque puits selon la taille du dispositif de
   
   Remarque: Les volumes peuvent varier en fonction de l'épaisseur du PDMS. Tout ce qui importe est que les puits sont pleins.

Supplémentaire sur l'utilisation des appareils sans plasma Collage

Sans traiter le plasma, Christina Tu, un technicien, qui ne réussi chaque semaine sans plasma, dit il suffit de charger les cellules immédiatement.

N'oubliez pas de retirer le support des deux puits sur le côté Soma (côté axone sera pas grave si vous laissez les médias en). C'est l'écoulement du fluide qui permet aux cellules d'entrer dans le chenal principal. Si vous avez des médias dans le puits, vous n'obtiendrez pas l'écoulement du fluide.

Discussion

Ici, nous a montré comment utiliser le neurone dispositif microfluidique sans avoir besoin d'un nettoyeur à plasma. Nous nous référons à cette liaison que la non-plasma.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass	Cover Glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C