Summary
우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.
Abstract
X-선 결정학은 단백질의 구조에 대한 자세한보기를 얻기위한 선택의 방법입니다. 이러한 연구는 구조 / 기능 관계에 대한 상세한 통찰력을 얻기 위해 더 생화학 분석에 의해 보완해야합니다. oligonucleotide와 유전자 합성 기술의 발전은 모두 다른 19 명의 아미노산의 대상 잔류의 대체 등의 증가 가능한 대규모 mutagenesis 전략을합니다. 이득 또는 손실 기능 phenotypes 그런 다음 촉매 활동, 단백질의 안정성 및 / 또는 단백질 단백질 상호 작용 특이성에 특정 잔류의 노력으로 체계적인 결론을 도출 할 수 있습니다.
돌연변이의 성격에 다른 phenotypes을 속성에 위해 -보다는 변동 실험 조건 - 이건 제어와 재현 방식으로 단백질을 정화하고 분석하는 매우 중요합니다. 높은 처리량 전략 및 수동 프로토콜의 자동화에로봇 액체 처리 플랫폼은 거의 인간의 개입과 최소한의 오류 속도 1-5과 같은 복잡한 분자 생물 절차를 수행 할 수있는 기회를 마련했습니다.
여기, 우리는 높은 처리량 방식으로 그의 태그 재조합 단백질의 정화를위한 일반적인 방법을 제시한다. 최근 연구에서, 우리는 TFIIB에 대한 자세한 구조 기능을 조사, 기저 전사 기계의 구성 요소에이 방법을 적용했습니다. TFIIB는 체외에서 발기인 - 이동 스크립트에 불가결하고 preinitiation 복합 6-8로 RNA의 효소의 채용을 위해 필수적입니다. TFIIB는 RNA 중합 효소의 9-11의 분열 활성 사이트를 침투 유연한 링커 도메인이 포함되어 있습니다. 이 링커 도메인 TFIIB, 즉은 (i) 스크립트 개시의 '불완전'단계에서 촉매 활동의 자극에 두 생화학 수량화 활동을 수여하고,에 (II) 추가 기부4,5,12 단지 preinitiation에 RNA 중합 효소의 특정 모집. 우리는 TFIIB 링커에서 싱글, 더블, 트리플 변환과 삭제 변이를 생성하고 이후 RNA의 효소 (4)의 촉매 활동에의 자극 효과에 대한 기능 assays에서 그들을 분석하는 높은 처리량 정화 방법을 악용. 개의 우리가 생성 정화되고 381 돌연변이 분석 - 수동으로 수행 할 시간이 오래 걸릴 힘드는했을거야 작업을. 우리는 생산 우리가 어떤 실험 유사 콘텐츠를 감사 할 수 있으며 우리의 결과의 재현성에 대한 명확한 아이디어를 준 multiplicates에 단백질 assayed.
이 방법은 그의 태그 단백질의 정화에 대한 포괄적 인 프로토콜로 제공되며, 성공적으로 다른 재조합 단백질을 정화하는 데 사용되었습니다. 그것은 현재 24 단백질의 정화에 최적화되어 있지만 최대 96 단백질 정화하도록 구성 할 수 있습니다.
Protocol
제 A : 박테리아 문화의 높은 처리량 성장.
1. 24 잘 접시를 사용 Autoinduction 매체 2 ML에서 숙박 박테리아 성장
- microwaving하여 24 잘 접시를 Sterilise.
- 갓 성장 박테리아 식민지 또는 냉동 글리세롤 주식과 autoinduction 매체 (숙박 익스프레스 매체)의 1.5 ML의 예방. 우리는 일반적으로 세 개인 복제 식민지와 돌연변이 당 3 우물의 예방. 긍정적이고 부정적인 컨트롤에 대한 예약은 여섯 우물. 긍정적 인 컨트롤을 위해 세 wildtype의 클론을 성장하고 부정적인 컨트롤 우리는 비 표현 플라스미드로 변환 된 두 클론을 성장. 매체 전용 제어를위한 잘 공백을 남겨 판의 충분한 살균이 있는지 확인합니다.
- 37 18 시간 동안 세포를 성장 ° C 및 250 rpm으로 흔들어. 우리는 LAC-inducible BL21 (DE3) 로제 두 셀을 사용합니다. Autoinduction 매체 포도당과 유당의 혼합물을 포함하고 있습니다. 처음에 박테리아또한 재조합 단백질의 표현을 유도 유당을 사용하기 시작 한 후 포도당을 먹이로합니다.
- 뚜껑을 제거하고 로봇 플랫폼에서 판을 놓습니다.
부품 B : 재조합 단백질의 로봇 정화.
2. 로봇 플랫폼을 준비
20 MM 이미 다졸으로 구성된 세탁 버퍼를 구성, 0.1 % Triton은 X-100, 0.5 M NaCl, 20 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 7.9, 10 MM MgOAc 2, 0.7 MM ZnOAc 2, 10 % 글리세롤, 그리고 용출 버퍼로 구성 0.5 M 이미 다졸의, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 M NaCl, 20 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 7.9, 10 MM MgOAc 2, 0.7 MM ZnOAc 2, 10 % 글리세롤. 이 버퍼는 태그가 단백질이 그들에게 구속 된 후 구슬을 씻으하거나 각각 구슬에서 단백질을 elute하는 데 사용됩니다.
- 세균 희석제 (15 μl antifoam 시약 100 ML 증류수)를 구성합니다. 이 솔루션은 사용됩니다광학 밀도 (A600) 측정을위한 세균 밤 문화의 dilutions을 확인합니다. 희석제의 antifoam의 존재는 플레이트 리더 측정을 방해 하는것 기포의 형성을 방지한다.
- 10X FastBreak 시약, 샘플 당 2 μl lysonase 15 MM MgOAc이 구성된 용해 솔루션을 확인하십시오. FastBreak은 세균 세포 벽을 해제하고 세포 단백질의 출시를 촉진 세제와 소금의 조화가 포함되어 있습니다. Lysonase은 라이소자임 및 nuclease의 독점적 인 혼합이다. 라이소자임은 세포벽을 방해에 지원하고 nuclease가 출시 박테리아 핵산을 소화.
- 선택 사항 : 6 M 구아니딘 히드로 클로라이드 솔루션을 확인하십시오. 일부 재조합 단백질은 테플론 코팅 pipetting 바늘에 충실하는 경향이 있습니다. 구아니딘 히드로 클로라이드 솔루션 denatures 단백질과 정기적으로 각 성 후 빨 로봇 pipetting 팁을 씻어하는 데 사용됩니다 물을보다 더 효율적를 씻어EP.
- 혼합 bicinchoninic 산성 용액 (시약)과 구리 황산염 솔루션 (시약 B)에 의해 BCA (bicinchoninic 산) 단백질 quantitation 시약을 준비 : 펩타이드 채권은 + BCA 시약에있는 CuSO 4 구성 요소에서 잘라 내기 1 잘라 내기 2를 줄일 +된다 잘라 내기 1의 금액 + 솔루션에 존재하는 펩타이드 결합의 수에 비례합니다. 두 번째 단계에서는 bicinchoninic 산 킬레이트 구리 한 두 분자가 + 보라색 색상의 결과, 562 nm의에 흡광도 변화의 결과. 색 반응은 시간 의존하고 일반적으로 확신 할 수 몇 시간이 필요합니다. 그 후 색상은 몇 시간 동안 안정적이다.
- 오른쪽 크기의 골짜기 또는 접시를 입력하고 로봇 플랫폼에서의 사전 할당 된 위치에 배치합니다.
- 구아니딘 히드로 클로라이드의 폐기물 놓으 24 잘 접시, OD 600 흡광도 측정 한 블루 96도 일에 대한 판을위한 두 명확 96 - 웰 플레이트전자 플랫폼에 자신의 위치에서 단백질을 정제. 자기 스탠드에서 한 96 deepwell 판을 놓습니다.
- MagneHis을 희석 니켈 입자 형성하여 단백질을 구속 증류수 5 배와 구슬 - 저어 장치에 그들을 채우기의 그 .. 태그 chelates. 정지에 구슬을 유지하기에 교반기를 전환합니다.
- 로봇 플랫폼에 전환하고 그렇지 않으면 pipetting 정확도에 영향을 것이다 기포를 제거하는 데 몇 분 동안 pipetting 바늘을 플러시. 재사용 가능한 pipetting 바늘은 개별 pipetting 단계 사이에 플러시됩니다. 또한, 일회용 팁을 사용할 수 있습니다. 이후의 모든 단계 robotically 수행하고 있습니다. 로봇 프로토콜 요청하실 수 있습니다.
3. 세포의 성장은 OD600를 측정하여 검사
- 밤 문화의 10 μl는 희석제 솔루션의 90 μl에 희석되어 있습니다.
- 박테리아가 비슷한 밀도로 성장했는지 확인하기 위해 OD 600 측정(그림 1).
4. 세포는 단백질을 해제하고 허용하도록 깨진 비드 바인딩
- 자기 니켈 구슬 정지의 100 μl는 두 번째 24 잘 플레이트의 각도에 배포됩니다.
- 각 소규모 박테리아 문화를 900 μl은 구슬이 들어있는 24 잘 플레이트로 전송됩니다. 10X FastBreak / lysonase 믹스 100 μl를 추가합니다.
- 24 잘 플레이트는 실온에서 30 분을위한 빠른 진동 (800 RPM)의 흔들림 플랫폼에 전송됩니다. 세균 세포 벽이 기계적 힘과 화학 작업 및 recombinantly 생산 단백질이 솔루션으로 릴리스의 조합에 의해 중단됩니다. 자신의 친 화성 태그 그들은 즉시 상자성체의 킬레이트 화 니켈 구슬을 바인딩합니다.
5. 비즈 씻겨 아르
- resuspended 자기 구슬을 포함하는 세포 lysates는 m과 독립에 위치 96 deepwell 판으로 전송됩니다agnetic 막대 그 우물 사이에 슬라이드. 96 - 웰 플레이트는 표면에 뜨는을 쉽게 제거 할 수있는 사각형 콘 모양의 바닥을 얻었습니다. 우물 2.1 ML까지의 볼륨을 수용 할 수 그렇지만 아주 작은 볼륨으로 가득합니다. 이것은 우리가 splashing에 의해 샘플 교차 오염없이 힘차게 흔들어 단계를 수행 할 수 있습니다.
- 피펫 팁은 6 M 구아니딘-HCL 개별 pipetting 단계 사이를 세척합니다. 이 단계는 교차 오염을 방지하기 위해 TFIIB 및 기타 "끈적"단백질의 정화에 매우 중요합니다. 다른 단백질과의 pipetting 단계 사이에 물을 광범위하게 주사 바늘을 씻어하기에 충분 수 있습니다.
- 자기 스탠드의 자기로드는 상자성의 구슬을 유치 우물의 중심에서 멀리 당겨하고 pipetting 바늘에게 표면에 뜨는에 무료로 액세스 할 수 있습니다. 표면에 뜨는는 삭제됩니다.
- 세탁 버퍼 500 μl 먼저 24 잘 판에 추가 된 이후 전자에 96 - 웰 플레이트에 전달된다비즈의 전체 전송 nsure. 24 잘 플레이트는 셰이커에서 제거됩니다.
- 세탁 버퍼의 또 다른 500 μl가 96 - 웰 플레이트에 직접 추가, 플레이트 흔드는로 전송하고 힘차게 1 분에 흔들리고 있습니다. 플레이트는 자기 스탠드로 다시 이동하여 세척 버퍼가 삭제됩니다.
- 이 단계를 두 번 반복되고 세척 절차는 접시에서 모든 버퍼 잔해를 제거하여 완료합니다.
6. 용출 버퍼에있는 단백질을 Elute
- 용출 버퍼 100 μl가 구슬에 추가되고, 플레이트가 흔드는로 옮겨 적극적으로 실온에서 30 분에 흔들리고 있습니다.
- 플레이트는 정화 재조합 단백질을 포함 흔드는 및 eluate로 이동, 새 접시로 전송됩니다.
7. 정화 단백질의 농도를 측정
- BCA 시약 믹스의 190 μl은 분명 96 - 웰 플레이트로 옮겨와 프로의 10 μl 수 있습니다tein 솔루션이 추가되었습니다.
- 부화 (일반적으로 5-6 또는 야간)의 몇 시간 후, 흡광도를 측정하고 정화 단백질 준비 (그림 2)의 각각의 농도를 결정하기 위해 BSA 표준에 비교합니다.
- 정화 단백질은 이제 적절한 농도 (그림 3)에서 하류 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
8. 대표 결과
정화 프로토콜은 두 품질 관리 단계, 표시되는의 예제를 제공합니다. 우리는 정화 단백질의 수율 (그림 2) 평가시 세균 성장 단계 (그림 1)에서와 나중에 잠재적 인 문제를 파악하고 문서화 할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 단백질을 정화하고 세중의에서 그들을 테스트합니다. 이것은 두 개의 품질 관리 단계와 함께, 우리가 우리의 기능 assays에서 관찰 된 변화는 돌연변이 phenotyp로 인해 있다는 자신감을 제공합니다전자 (그림 3)이 아닌이 실험 유사 또는 실패 purifications에 의해 발생했습니다. 수율은 50-200 μg에서 일반적으로 범위를 획득하고 다양한 기능 assays에 대한 충분한보다 더 있습니다.
1 그림. 밤 문화가있는 24 잘 접시의 OD 측정 히스토그램.뿐만 아니라 wildtype TFIIB의 등 여섯 TFIIB 돌연변이 변종의 세 가지 클론이 성장하고 있습니다. 매체가 아닌 표현 플라스미드와 잘 들고 두 클론은 부정적인 제어 역할을합니다. OD 측정은 개별 문화 사이의 성장 속도의 작은 변화가 있다는 것을 보여줍니다.
그림 2. BCA 분석에 의해 결정되며 SDS 페이지로 확인 이러한 문화에서 얻은 단백질 수율이. 변종 중 하나는 높은 수준에서 표현되지 않습니다. co.kr 사이트의그림 1과 bination, 우리는이 차동 세포의 성장으로 인해 아니 였지만 인해 단백질의 발현에 제대로 유도되지 않는 것이 결론 할 수 있습니다.
그림 3. 전사 검정 대표 결과. 우리는 RNAP의 작은 불완전 성적 증명서의 생산에 TFIIB 변종의 자극 활동을 측정. 여기 TFIIB 잔류 K87의 단일 아미노산 대체의 전체 라이브러리의 자극 효과가 표시됩니다. 재현성의 높은 수준은 작은 오류 속도에 의해 확인된다. wildtype (중량), 음성 제어 (NC) 및 용출 버퍼에 비해 3 개 돌연변이의 성능을 보여주는 샘플 젤은 제어가 아래에 그려져 있습니다.
Discussion
여기에 설명 된 자동 재조합 단백질 정제 방법은 최소한의 인간의 개입과 매우 재현 조건 하에서 소규모 형식의 돌연변이 단백질의 많은 수의 생산 및 정화 할 수 있습니다. 그림 1과 체계적인 품질 관리와의 예제 2 쇼 결과는 단백질을 정제. 그림 3 공연이 예에서 사용되는 정제 된 전사 인자는 기능 assays의 높은 재현 방식으로 수행.
프로 시저가 archaeal TFIIB의 정화하기 위해 개발되었습니다하더라도, 그것은 친화 태그 단백질의 정화에 널리 적용됩니다. 이러한 자동 정화 프로토콜의 사용은 따라서 크게 재조합 단백질의 생화학 분석을 용이하게하고 따라서 수동으로 달성하기 어려운 규모의 단백질 단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해를 촉진합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 ROJW에 웰컴 프로젝트 기금 (078043/Z/05/Z)에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
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