Summary
En spectrofluorometric protokoll for måling av mitokondrie permeabilitet overgangen pore åpningen i isolerte mus hjerte mitokondrier er presentert her. Analysen involverer samtidig måling av mitokondrier Ca
Abstract
Mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mtPTP) er en ikke spesifikk kanal som dannes i den indre mitokondrielle membranen å transportere oppløste stoffer med en molekylvekt mindre enn 1,5 kDa. Selv om definitive molekylære identiteten til pore er fortsatt under debatt, proteiner som cyclophilin D, VDAC og ANT bidra til mtPTP formasjon. Mens involvering av mtPTP åpning i celledød er godt etablert 1., samler bevis indikerer at mtPTP serverer en fysiologisk rolle under mitokondrie Ca 2 + homeostasis 2, bioenergi og redoks signalering 3.
mtPTP åpning er utløst av matrix Ca 2 +, men sin aktivitet kan moduleres av flere andre faktorer som oxidative stress, adenin nukleotid utarming, høye konsentrasjoner av Pi, mitokondrie membran depolarisering eller frakobling, og langkjedede fettsyrer 4. In vitro mtPTP åpning kan være achieved ved å øke Ca 2 + konsentrasjon inne i mitokondriematrix gjennom eksogene tilsetninger av Ca 2 + (kalsium oppbevaring kapasitet). Når Ca 2 + nivåer innenfor mitokondrier når en viss terskel, åpnes mtPTP og legger til rette Ca 2 + utgivelse, spredning av proton drivkraften, membranpotensiale kollaps og en økning i mitokondriematrix volum (hevelse) som til slutt fører til brudd på ytre mitokondriemembranen og irreversibelt tap av organeller funksjon.
Her beskriver vi en fluorometrisk analyse som gjør det mulig for en omfattende karakterisering av mtPTP åpning i isolerte mus hjerte mitokondrier. Analysen involverer samtidig måling av 3 mitokondrie parametere som endres når mtPTP åpning oppstår: mitokondrie Ca 2 + håndtering (opptak og utslipp, målt ved Ca 2 + konsentrasjon i analysemedium), mitokondriell membranpotensiale og mitochondrial volum. Fargestoffene anvendt for Ca 2 + måling i analysemedium og mitokondrielle membranpotensiale er Fura FF, en membran impermeant, Proporsjonal indikator som gjennomgår en endring i eksitasjonsbølgelengde i nærvær av Ca 2 +, og JC-1, en kationisk, Proporsjonal indikator som danner grønne monomerer eller røde aggregater ved lav og høy membranpotensiale, henholdsvis. Endringer i mitokondrie volum måles ved å registrere lysspredning ved mitokondrie suspensjonen. Siden høy kvalitet, funksjonelle mitokondrier er nødvendig for mtPTP åpningen analysen, har vi også beskrive de nødvendige skritt for å få intakt, svært kombinert og funksjonelle isolert hjerte mitokondrier.
Protocol
1. Isolasjon av Mitokondrier fra Mouse Hjerte
- Å isolere hjerte mitokondrier, bedøve og ofre mus i henhold til prosedyrer godkjent av den lokale Institutional Animal Care og bruk komité.
Merk: Alle trinnene i mitokondriene isolasjon protokollen må utføres på is. Bruk iskalde buffere og pre-kjølt petriskåler, Falcon rør og Eppendorf rør. Volumene gitt i protokollen er for en prøve inneholdende 2 mus hjerter.
- Fjern hjerter, plassere dem i kaldt Mitokondrier Isolation Buffer (300 mM sukrose, 10 mM Na-HEPES, 200 pM EDTA, pH 7,4) og skyll av blod.
Merk: For optimale resultater, bør pH i det mitokondrielle buffere justeres med KOH og eddiksyre.
- Sted hjerter på en kald petriskål, fjerne fett og atriene, og hakke fint å bruke en kniv til taking et homogent produkt.
- Overfør hakket hjerter til en 50 ml Falcon rør, tilsett 10 ml Mitokondrier Isolation Buffer med 0,1 mg / ml trypsin og tillate prøven å fordøye på is i 10 min.
Merk: Trypsin under isolasjon prosedyren øker utbyttet av isolerte mitokondrier og bør holdes konstant mellom mitokondrielle preparater. Vi anbefaler testing mitokondrielle funksjoner på preparater isolert er fraværet av trypsin å sikre at enzymet ikke forstyrrer funksjonalitet.
- Tilsett 10 ml Mitokondrier Isolation Buffer med 0,1% fettsyre fri BSA og 5 mg trypsin inhibitor (soyabønne) og bland ved å snu røret flere ganger for å nøytralisere trypsin.
Merk: Mitokondrier Isolation Buffer kan fremstilles på forhånd og kan lagres ved -20 ° C. Sjekk pH ved tining. Trypsin, trypsin-inhibitor eller BSA må være etdded til mitokondriene Isolation Buffer på dagen av eksperimentet.
- Gjenvinn fordøyd vev ved lave til middels hastighet sentrifugering i 1 minutt ved 4 ° C.
- Gjensuspender vev i 8 ml Mitokondrier Isolation Buffer med 0,1% fettsyre fri BSA og homogenisere ved hjelp av en motorisert Dounce homogenisator med en Teflon pistill (4-6 passerer på 1,200-14,00 rpm). Hold prøven på isen mens homogenisering.
- Overfør homogenat i en 15 ml Falcon rør og sentrifuger ved 800xg i 10 min ved 4 ° C for å pelletere atomkjerner og vev rusk.
- Gjenvinn supernatanten inneholdende mitokondriene inn Eppendorf-rør og sentrifuger ved 8000 xg i 15 min, ved 4 ° C.
- Fjern forsiktig den øverste hvite laget og vaske den gjenværende mørkere pellet inneholder mitokondrier i 1 ml Mitokondrier Isolation Buffer.
- Sentrifuger ved 8000xg i 15 min ved 4 ° C. Kast supernatant og resuspender mitokondrier pellet i 150 ul Mitokondrielt Isolasjon Buffer. Hold mitokondrier på isen for ytterligere analyser.
Merk: For best resultat under funksjonelle analyser, bruker mitokondrier innen 4 timer av isolasjon.
- Kvantifisere mitokondrie protein ved hjelp av Bradford analysen.
2. Kvalitetskontroll av Isolated Mitokondrier
2.1. Måling av respiratorisk kontroll ratio (RCR)
- Kalibrer Oxytherm oksygenelektrode med luftmettet vann å etablere maksimal oksygen linje. Når et stabilt nivå av oksygen oppnås legge 100 ul av en ferskt fremstilt 10 mM natriumhydrosulfitt løsning for å etablere det null oksygenlinjen. Utføre målinger ved 30 ° C.
- Tilsett 2 ml Mitokondrier Respirasjon Buffer (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl 2, 400 uM EGTA, 300 pM DTT, 5 mM KH 2 4 PO, pH 7,2) med 1 uM rotenon til Oxytherm kammeret, forsegle kammeret og start registding.
- Når oksygen-signalet er stabilt, tilsett 250 ug mitokondrier og registrere basal respirasjon i 1 min. Respirasjonen på dette punktet bør være svært lav som mitokondrier er respiring på endogene substrater (stat en respirasjon).
- Tilsett 5 mM succinate og ta signal i 1 min. Oksygenforbruk bør øke under State 2 åndedrett.
- Fremkall State 3 åndedrett ved å legge 150 uM ADP. På dette punktet oksygenforbruk bør øke grunnet ATP syntese ved oksidativ fosforylering. Record signal til respirasjon bremser, noe som indikerer ADP forbruk og overgang til tilstand 4 åndedrett. Record State 4 åndedrett i minst 1 min.
- Tilsett 1 pM CCCP og ta signal i 1 min. Frikoblet åndedrett bør være maksimal.
Merk: Effekten av CCCP på mitokondriell respirasjon er doseavhengig: høye konsentrasjoner av CCCP kan hemme oksygenforbruk og bør derfor være nøye titrated.
- Beregn luftveiene kontroll ratio (RCR) ved å dividere oksygenforbruket prisen under State 3 åndedrett ved oksygenforbruk prisen under State 4 åndedrett. Et mål RCR bør være ≥ 4.
2.2. Vurdering av mitokondriemembranen integritet (cytokrom c test)
- Grundig vask Oxytherm kammer med 70% etanol og vann og gjenta trinn 2.1.2 -2.1.4.
- Tilsett 1 mM ADP og ta oksygenforbruk i 1 min.
- Tilsett 10 pM cytokrom c. Siden cytokrom c er ugjennomtrengelig for intakte mitokondrie membraner, indikerer en økning i respirasjon ødelagt eller skadet mitokondrielle membraner.
3. Måling av Mitokondrie Permeabilitet Transition pore åpningen
- Setup spektrofluorometer for multi-parameter måling av mtPTP åpning. Bruke FelixGx til å opprette en ny maskinvare konfigurasjon (Quanta mester jevn staTe) omfattende lyskilden, magnetisering monokromator, sample kupé og to detektorer plassert i 90 ° og 270 ° med hensyn til eksitasjon monokromator (figur 4). For å oppnå maksimal tid oppløsning, må både utslipp monochromators (90 ° og 270 °) bli deaktivert og utslipp filtre på 90 ° og 270 ° i utvalget kupé aktivert i maskinvarekonfigurasjonen menyen. Dette trinnet vil fjerne motoren kontroll av utslipp bølgelengder og fikse hver monokromator på en bestemt bølgelengde. Hvis utslipp monochromators ikke er deaktivert, vil hver detektor syklus mellom begge bølgelengder og like målinger blir registrert.
- Opprett et nytt oppkjøp protokollen ved hjelp av Multi Dye og angi følgende fargestoffer:
- Fura (høy Ca + +): eksitasjon 340 nm, emisjon 525 nm (detektor 1)
- Fura (lav Ca + +): eksitasjon 380 nm, emisjon 525 nm (detektor 1)
- JC1 (samlet): eksitasjon 543 nm, Utslipp 595 nm (detektor 2)
- JC1 (monomer): eksitasjon 498 nm, emisjon 525 nm (detektor 1)
- Hevelse: eksitasjon 525 nm, 525 utslipp nm (detektor 1)
- Still eksisterings-og emisjonsegenskaper slisser til 1 nm og temperaturen til 37 ° C.
- For å få den Proporsjonal signal for Fura og JC-1, generere to avledet spor: Fura (høy Ca + +) / Fura (lav Ca + +) og JC1 (samlet) / JC1 (monomer).
- Manuelt justere emisjonsbølgelengde på detektorer 1 og 2 til 525 nm og 595 nm, hhv.
- Bland 1 ml Mitokondrier Assay Buffer (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 4 PO, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) med 1 pM rotenon, 5 mM succinat og 800 nM Fura FF i en engangs 4-sidig metakrylat kyvetten. Tilsett 250 mikrogram mitokondrier og sted prøve i utvalget kupé. Kontroller at magnetrører er slått på.
- Starte innspillingen. Etter 1 min, pause oppkjøpet legge til 500 nM JC-1 og deretter starte encquisition. JC-1-forhold signalet skal øke, noe som indikerer fargestoff opptak ved aktiv mitokondriene. Fortsette opptaket til JC-1 signal har nådd et platå (vanligvis innen 5 min).
- Tilsett 20 pM CaCl 2. En momentan økning i Fura FF ratio signalet skal bli observert av økte Ca 2 + tilstedeværelse i analysebuffer, etterfulgt av en gradvis reduksjon grunnet mitokondrie Ca 2 +-opptak. JC-1-forhold signal skal kunne fremvise en kort forbigående reduksjon indikerer liten mitokondrie membran depolarisering.
- Vent til Fura FF ratio signal tilbake til basal nivå før tilsetning av en annen CaCl 2 puls (1 til 1,5 min). Fortsett pulserende med faste intervaller inntil mitokondriene ikke kan samle Ca 2 + og begynne å slippe Ca 2 + inn i analysebuffer. mtPTP åpning er visualisert ved en samtidig økning i Fura FF ratio signalet på grunn Ca 2 + utgivelse, en nedgang i JC-1-signalet forholdet skyldes membran potential kollaps, og en nedgang i lysspredning grunnet mitokondriell hevelse (figur 5).
- Etter mtPTP aktivering, verifisere spesifisitet Fura FF, JC-1 og hevelse signaler henholdsvis med 1 mM EGTA, en uM CCCP og 5 mikrogram / ml alamethicin.
- Å verifisere spesifisitet mtPTP åpning, gjenta trinn 3,6 til 3,9 i nærvær av 1 uM av cyclophilin D inhibitoren ciklosporin A (cyclophilin D er en komponent i mtPTP). I nærvær av cyklosporin A, åpning av mtPTP krever betydelig mer CaCl 2 pulser enn kontrollprøver (figur 6).
4. Representant Resultater
Figur 2 viser en typisk respiratorisk kontroll av isolert mus hjerte mitokondrier. Tilstand 3 respirasjon oppnås ved tilsetning av ADP til mitokondriene respiring på suksinat, og er karakterisert ved betydelig økt oksygenforbruk med hensyn til substrate alene. Nedbryting av tilsatt ADP innviede State 4 respirasjon, der oksygenopptak bremser og kan sammenlignes med priser oppnådd før ADP tillegg. RCR oppnås ved å dele oksygenforbruk prisen for State 3 respirasjon ved at av State 4 åndedrett. Cytokrom c test brukes til analysen integriteten av den ytre mitokondrielle membranen: når cytokrom c blir lagt til mitokondriene respiring på succinat og ADP, ingen ytterligere økning i respirasjon er observert, noe som indikerer en intakt ytre mitokondrie membraner (figur 3).
En representativ bilde for mtPTP åpningen i isolerte hjerte mitokondriene er vist i Figur 4. I dette tilfellet mtPTP åpningen ble utløst ved tilsetning av 4 CaCl 2 pulser (20 uM hver) ved 1,5 min intervaller. mtPTP åpning er åpenbart av den nær samtidige lanseringen av mitokondriell Ca 2 + (økning i Fura FF ratio signal), kollaps av mitochondrial membranpotensiale (reduksjon i JC-1 ratio signal) og økt mitokondrie volum (reduksjon i hevelse signal). Når ciklosporin A tilsettes, binder som til cyclophilin D komponenten mtPTP krever mtPTP åpning 7 pulser av CaCl 2 istedenfor 4 (figur 5).
Figur 1. Flytskjema av multi-parameter mitokondrie permeabilitet overgang pore åpningen protokoll for isolert hjerte mitokondrier. Hjerte er høstet fra mus og mitokondrier isoleres gjennom differensial sentrifugering. Mitokondrie preparatet blir deretter kvalitativt evaluert av polarographic måling av respiratoriske kontroll ratio og mitokondriemembranen intactness i nærvær av cytokrom c. Mitokondrie permeabilitet overgang pore åpningen i isolerte mitokondrier utløses ved sekvensiell CACl 2 tilføyelser og måles med en spektrofluorometer ved å overvåke Ca 2 + utgivelse fra mitokondriene, membranpotensiale kollaps og hevelse i mitokondriematrix.
Figur 2. Måling av luftveiene kontroll ratio (RCR) av isolerte hjerte mitokondrier. Oksygenforbruk isolert hjerte mitokondriene måles under State 3 respirasjon i nærvær av succinat og ADP, og under State 4 åndedrett etter ADP forbruk. Responsen isolert mitokondrier å uncouplers måles ved tilsetning av CCCP. Tall på grafen er satsene for oksygenforbruk ved isolert mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 3. Tiltak ling av membran integritet isolert hjerte mitokondrier. Mitokondriemembranen integritet blir bestemt ved å måle oksygenforbruk i isolert mitokondrier i nærvær av succinat og ADP og etter tilsetningen av cytokrom c. Tall på grafen er satsene for oksygenforbruk ved isolert mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 4. Spektrofluorometer maskinvarekonfigurasjon for multi-parameter måling av mtPTP åpning. Maskinvarekonfigurasjonen av spektrofluorometer innbefatter en lyskilde, en eksitasjon monokromator, en prøve kupé og to detektorer med faste Emisjons bølgelengder ved 525 nm og 595 nm. Detektor 1 brukes for signaldeteksjon av Fura FF høy og lav Ca 2 +, JC-1 monomer, og hevelsen signalet. Detektoren 2 måler JC-1 samlet signal.
Figur 5. Multi-parameter måling av mtPTP åpning i isolerte hjerte mitokondrier. mtPTP åpningen ble utløst av sekvensielle tillegg av 20 uM CaCl 2 og var preget av Ca 2 + utgivelse fra mitokondriene, mitokondrie membran potensialet kollaps og økt mitokondriematrix volum (hevelse). Extramitochondrial Ca 2 + og membranpotensialet ble målt med Proporsjonal indikatorene Fura FF (grønne kurven) og JC-1 (rød spor). Hevelse av mitokondrier ble målt ved å registrere lysspredning på 525 nm (svart spor). Spesifisitet av JC-1 og hevelse signaler ble testet med en uM CCCP og 5 ug / ml alamethicin (en mikrobiell toksin).
Figur 6. Multi-Parameter måling av mtPTP åpning i isolerte hjerte mitokondrier i nærvær av ciklosporin A. Cyclosporine A (1 uM) øker antallet CaCl 2 pulser som kreves for å åpne mtPTP i isolert hjerte mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver de nødvendige eksperimentelle skritt for å vurdere permeabilitet overgang pore åpningen i isolerte hjerte mitokondrier (Figur 1 og Figur 4): prosedyren for å isolere mus hjerte mitokondriene, respiratoriske kontroll som sikrer deres integritet og funksjonalitet, mitokondrie parametre overvåkes under mtPTP åpning og fargestoffer som benyttes for måling deres, opprettelsen av den spectrofluorometric instrumentering, og karakterisering av mtPTP åpning. Den spektrofluorometer ansatt i denne protokollen tillater rask måling av disse tre parametrene samtidig. Imidlertid, kan den grunnleggende protokollen benyttes ved hjelp av andre kommersielt tilgjengelige instrumenter, enskjønt med redusert tidsoppløsning. Ikke-Proporsjonal fargestoffer kan også anvendes, men ikke tillater kvantitative mål på både Ca 2 + og mitokondrielle membranpotensiale 5.
Agod kvalitet mitokondrie forberedelse er viktig når måler den mtPTP åpningen, siden både evne til å akkumulere Ca 2 + og opprettholde en membran potensialet er tett forbundet med hverandre. For eksempel fant vi at mitokondriene med en lav RCR utstillingen redusert JC-1 akkumulering og dårlig Ca 2 + mobilisering. Prosedyren vi bruker for å isolere hjertet mitokondriene ble tilpasset fra tidligere utgitt seks protokoller, 7 og viste seg å være veldig konsekvent i å generere høy kvalitet mitokondrier målt ved RCR og cytokrom c tester.
Åpning av mtPTP er et komplekst fenomen som innebærer endringer på flere nivåer i mitokondrie anatomi og fysiologi. Analysen beskriver vi her måler spectrofluorometrically de samtidige endringer i extramitochondrial Ca 2 + nivåer, mitokondrie membran potensial og mitokondrie volum. Målingen av flere parametere samtidig tilbyr en mer comprehensive bilde av fenomen enn målingen av enkelte parametre alene, for eksempel Ca2 + mobilisering eller hevelse. Videre begrenser bruken av Proporsjonal fargestoffer Fura FF og JC-1 for Ca 2 + og membran potensial målinger eksperimentell gjenstand knyttet til farge konsentrasjon, opptak eller photobleaching. Disse fargestoffer kan også lett kalibrert for å få mer kvantitative målinger. En viktig observasjon er at alle fargestoff konsentrasjoner bør holdes så lav som mulig for å unngå interferens med mitokondrier åndedrett og membranpotensialet samt sensibilisere mtPTP åpning. I våre hender, JC-1 konsentrasjoner over 1 mikroM redusere antall pulser som trengs for å åpne mtPTP med 1-2 pulser. Derfor egnede kontroller bør utføres ved å ekskludere fargestoffer og opptak andre parametere (for eksempel hevelse alene) for å være sikker på at antall pulser som trengs for å åpne PTP forblir konsistent.
Gjennom denne protokollenhar vi målt mtPTP åpning for mitokondrier respiring på komplekse II substrat succinat i nærvær av rotenon, som inhiberer revers elektrontransportkjeden fra komplekse II til komplekse I. Andre respiratoriske substrater kan brukes i tillegg, for eksempel pyruvat / malat som støtter respirasjon på komplekse I. Imidlertid, substrat-relaterte forskjeller i antallet av Ca 2 + pulser som kreves for å åpne mtPTP er rapportert 8. Samme protokoll for å måle mtPTP åpningen kan anvendes med mitokondrier isolert fra forskjellige vev eller cellelinjer. Vi har med hell benyttet denne protokoll for lever, muskel og hjerne mitokondrier, selv om antallet av Ca 2 + pulser nødvendig for å utløse mtPTP åpningen var vev avhengig som tidligere rapportert 9, 10. Mitokondriene isolasjon protokollen må være tilpasset og optimalisert for hver vev eller cellelinje skyldes bestemte krav til homogenisering prosedyre og isolasjon buffere 11, 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av HL094536 (BJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
