多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。
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本文内容
摘要
摘要
多巴胺是中枢神经系统中被广泛研究的一种神经递质。事实上，由于其在运动活动和奖赏相关行为中的重要作用，过去五十年来，科研人员一直在深入探究与多巴胺调控相关的分子缺陷。这些关于大脑中多巴胺调控的研究，主要集中于黑质纹状体通路和中脑伏隔核通路的终末区域——即纹状体和伏隔核——中多巴胺调控的分子基础。此外，此类研究通常仅将多巴胺组织含量归一化至湿组织重量进行分析。对于调控多巴胺的蛋白质（如酪氨酸羟化酶（TH）蛋白、TH的磷酸化状态、多巴胺转运体（DAT）以及囊泡单胺转运体2（VMAT2）蛋白）的研究，往往未在同一组织样本中同时分析多巴胺的组织含量。能够同时分析多巴胺组织含量及其调控蛋白（包括翻译后修饰）不仅有助于深入理解多巴胺与TH、DAT或VMAT2的蛋白水平及功能之间的关系，还能提高样本利用效率。这不仅降低了研究成本，而且使研究人员能够在几乎任意实验范式下获得关于多巴胺分子调控机制的深刻见解。
我们将分析重点聚焦于中脑。尽管在大多数多巴胺调控研究中，黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）通常被忽视，但经过练习后，这些核团可以较容易地进行分离。可对多巴胺组织含量以及酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）或囊泡单胺转运体2（VMAT2）进行系统性检测。目前已有大量文献报道了SN和VTA中多巴胺功能对行为的影响，以及外源性物质或疾病过程对这些区域的干扰作用1-5。此外，某些化合物（如生长因子）对多巴胺及其调控蛋白具有显著影响，且这种影响在SN或VTA中尤为明显6-8。因此，本文介绍该方法旨在为希望深入探究特定处理如何调节行为及多巴胺调控机制的实验室提供参考。本文提供了一种多步骤方法，用于分析来自啮齿类动物中脑的黑质和VTA组织中的多巴胺含量、TH、DAT或VMAT2蛋白水平，以及TH的磷酸化状态。对TH磷酸化的分析不仅有助于深入了解TH活性的调控机制，还可揭示在特定实验范式下影响胞体-树突核团的信号转导级联变化。
我们将演示分离这两个核团的解剖技术，以及对分离组织进行样本处理的方法，从而获得揭示多巴胺调控分子机制的表达谱 体内 特异于每个细胞核 （图1）.
方案
1. 解剖
- 在冰水浴上冷却啮齿类动物脑切片模具（冠状面切片间隔1 mm）、含有5把刀片的培养皿以及一把#11解剖刀。另取一个容器，将已标记的2 ml离心管置于干冰中预冷。
- 实验人员将选择安乐死方法。我们采用异氟烷进行极短时间的麻醉，已获得可重复的结果。理想情况下应使用挥发性麻醉剂蒸发器。若无此设备，可使用一个大型电池罐并内置平台。将电池罐置于经批准的通风橱内，在平台下方放置浸透异氟烷的纱布垫，等待3–5分钟使罐内充分饱和。将大鼠放入罐内，待其意识丧失后立即取出并实施断头。迅速取出脑组织（理想情况下在两分钟内完成），用冷水冲洗后立即放入预冷的啮齿类动物脑切片模具中。
- 将脑组织放入模具后1分钟，开始插入预冷的刀片，若需同时分析纹状体、伏隔核及中脑核团，则从视交叉前方约2 mm处开始。每隔1 mm插入一片预冷刀片，直至脑桥中段，每次插入时应错开位置，以便后续更轻松地逐个取出刀片。
- 拔出刀片时，观察海马起始位置。当海马完全环绕中脑后，开始使用#11刀片进行切片，如图2所示。
- 立即将分离的组织放入干冰上预冷的离心管中。在大鼠中，通常可从至少两个、最多三个冠状切片中分离出黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）。将组织储存于-80 °C，待后续处理时使用。
2. 组织分析：多巴胺及其代谢物的高效液相色谱法
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讨论
如图1所示，上述方法可从大鼠或小鼠的黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）单一样本中，同时获得多组关于多巴胺及其调控蛋白TH、DAT和VMAT2的检测结果。再次强调，实施本方案的优势在于研究者能够获得操作条件匹配的多巴胺调控机制读数 体内 在几乎所有实验范式下均可实现这一目标，从而通过减少每次实验所需的动物数量，显著节约实验资源。
研究人员必须严格遵守解剖过程中（4°C）、组织储存（至少-70°C）、组织超声处理（从储存温度取出后立即在冰冻HPLC缓冲液中进行超声）以及后续沉淀形成和处理步骤中的温度要求。一旦沉淀物在SDS溶液中完成超声和煮沸处理，样品可继续在室温下进行后续操作。用于HPLC分析的存档样品以及为蛋白质分析制备的样品缓冲液应保存在-80°C。
该方案的主要优势再次体现在其内在的操作性匹配方法，可用于分析与多巴胺调节相关的结果 体内 此外，将多巴胺组织检测结果标准化为多巴胺能神经纤维标志物（TH、DAT），可在很大程度上确保研究者一致且准确地分离黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）.......
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致谢
本工作的资助来源如文献2,10所引，部分来自美国衰老研究联合会、Edward P. Stiles 信托基金和路易斯安那州西北部生物医学研究基金会向 MF Salvatore 提供的研究资助，以及 LSU 健康科学中心-什里夫波特分校向 BS Pruett 提供的 Ike Muslow 博士前奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
高效液相色谱系统： | |||
基本系统由 Shimadzu LC10-ADvp 高效液相色谱泵、Waters WISP 717 自动进样器以及一根 250 × 4.4 mm、5 微米 Spherosorb ODS-1 C18反相色谱柱（Waters），Bioanalytical Systems（BAS）TL12双玻璃碳电极，两台BAS LC4B电化学检测器，以及Waters Empower 2数据采集与积分系统。 | |||
色谱柱温度保持在 30-45 °C（BAS LC22A色谱柱加热器）。流动相为0.1 M磷酸钠（pH 3.0）、0.1 mM EDTA、0.2–0.4 mM辛烷磺酸钠（Eastman-Kodak）和0.35%乙腈（v/v），经0.45微米滤膜过滤。流速为1.2 ml/min。通过调节pH、辛烷磺酸钠浓度和色谱柱温度，优化四升批次的流动相以实现最佳分离效果。流动相循环使用，并持续用氦气吹扫以去除溶解氧。为在较长时间内保持良好的分离分辨率，流动相的循环使用几乎是必需的。通过使用流路切换阀（由积分仪控制），将每次运行最初2–7分钟的流动相排入废液，从而延长流动相的使用期限。 | |||
电极相对于Ag/AgCl参比电极维持在约0.78 V和0.95 V的电位。较高电位的电极仅用于色氨酸（以及NMDA内标）的测定。0.78 V电位在检测单胺类物质及其他非色氨酸化合物时可提供更优的信噪比。色谱图存储于Empower工作站的硬盘中，随后进行处理，并将数据直接导入Excel电子表格，用于计算代谢物含量及汇总分组数据。 | |||
泵：Shimadzu LC-10AD | |||
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| 甘油 | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| 甘氨酸 | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B8026-5G | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | D-9163 | |
| 蛋白标准品 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA 蛋白质检测试剂 A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein 标准品 | 伯乐（Bio Rad） | 161-0373 | |
| [125I]-蛋白A，比活性 | Perkin-Elmer | ||
表2. 特异性试剂。 | |||
| 10% SDS | 10 g SDS，100 mL 去离子水20 | ||
| 1% SDS（pH 调至 8.2） | 10 mL 10% SDS，60.5 mg Trizma Base，37.22 mg EDTA，90 mL 去离子水20 | ||
| 硫酸铜 II 溶液 | 1 g 硫酸铜（II） 25 mL 去离子水20 | ||
| 3X 样品缓冲液 | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g 二硫苏糖醇 0.463 g 甘油 30 g 溴酚蓝 10 mg 去离子水20（最初将上述试剂加入40 mL H20，在量筒中；然后加入 H20，直至总体积达到100 mL）HCl（根据需要添加，调节pH至6.85）将溶液分装至50个2.0 mL离心管中并冷冻。（配制总量为100 mL）：所需3X上样缓冲液体积 = ½ 样品中使用的SDS体积 | ||
| 1X 样品缓冲液 | 使用去离子水将3倍浓度的上样缓冲液稀释至1倍浓度的上样缓冲液20 | ||
| 10倍跑胶缓冲液（配制4 L） | Trizma 碱 121.1 g 甘氨酸 577 g SDS 40 g | ||
| 10倍转移缓冲液：（配制4 L） | 甘氨酸 360 g Trizma Base 96 g | ||
| 猩红染色 | Ponceau S 0.5 g，乙酸 5 mL，去离子水20.95 mL | ||
| 0.2% HCl 溶液 | 5.2 mL 盐酸加入 500 mL 去离子水中20 | ||
| PVP-T20 封闭液（配制 4 L） | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g 硫柳汞 0.4 g 1M Tris pH 7.6（500 mL 去离子水中含 60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base）20）- 50 mL | ||
| 10倍印迹缓冲液（配制4 L） | Tween 20 20 g Tris 碱 14 g Tris HCl 61 g | ||
表3. 蛋白质测定与蛋白质印迹实验方案 | |||
酪氨酸羟化酶标准品： 本实验室所使用的经校准的TH蛋白及磷酸化标准品源自PC12细胞提取物，其TH蛋白含量和磷酸化化学计量比已通过先前校准的TH标准品进行分析，而该标准品最初来源于John Haycock博士的实验室。 11. |
参考文献
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C.
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