Summary
Dopamin tydeligt reguleres i midthjernen kerner, der indeholder cellelegemer og dendritter af dopamin neuroner. Her beskriver vi en dissektion og håndtering af prøver for at maksimere resultater, og således konklusioner og indsigt på dopamin regulering i midthjernen kerner i substantia nigra (SN) og ventrale tegmentale område (VTA) hos gnavere.
Abstract
Dopamin er en kraftigt undersøgt neurotransmitter i CNS. Faktisk har sit engagement i bevægelsesaktivitet og belønning-adfærd fremmes fem årtier af undersøgelse af de molekylære mangler forbundet med dopamin regulering. De fleste af disse undersøgelser af dopamin regulering i hjernen fokus på det molekylære grundlag for sin regulering i de terminale felt regionerne i de nigrostriatale og mesoaccumbens veje, striatum og nucleus accumbens. Desuden har sådanne undersøgelser koncentreret på en analyse af dopamin væv indhold med normalisering til kun vådt væv vægt. Undersøgelse af proteiner, der regulerer dopamin, såsom tyrosinhydroxylase (TH)-protein, TH phosphorylering, dopamin-transporteren (DAT), og vesikulært monoamintransporterfunktion 2 (VMAT2) protein ofte ikke omfatter analyse af dopamin væv indhold i den samme prøve. Evnen til at analysere både dopamin væv indhold og regulerer proteiner (herunder post-translational ændringer) giver ikke kun iboende magt til at fortolke forholdet mellem dopamin med protein niveau og funktion af TH, DAT eller VMAT2, men udvider også prøve økonomi. Dette udmønter sig i lavere omkostninger, og alligevel giver indsigt i den molekylære regulering af dopamin i stort set alle paradigme af efterforskerne valg.
Vi fokuserer analyserne i midthjernen. Selv om SN og VTA typisk er forsømt i de fleste studier af dopamin forordning, er disse kerner let dissekeret med praksis. En omfattende udlæsning af dopamin væv indhold og TH, DAT eller VMAT2 kan udføres. Der er spirende litteratur om virkningen af dopamin funktion i SN og VTA på adfærd, og impingements af eksogene stoffer eller sygdomsprocesser deri 1-5. Endvidere er forbindelser, såsom vækstfaktorer har en dybtgående virkning på dopamin og dopamin-regulerende proteiner, at en forholdsvis større udstrækning i SN eller VTA Vi vil illustrere dissektion teknikken for at adskille de to kerner, og prøven behandling af dissekerede væv, der producerer en profil afslørede molekylære mekanismer af dopamin regulering in vivo og er specifikke for hver kerner (figur 1).
Protocol
1. Dissection
- På et leje af våd is, køle en gnaverhjerne matrix (koronale sektioner adskilt 1 mm fra hinanden), en petriskål indeholdende 5 barbermaskiner, og en # 11 skalpel. I en separat beholder mærket anbringes 2 ml størrelse mikrocentrifugeglas i tøris.
- Investigator vil vælge den metode eutanasi. Vi har reproducerbare resultater foretager en meget kort anæstesi med isofluran, Ideelt set, bør anvendes en fordamper der. Men, hvis sådanne ikke foreligger, bruger vi et stort batteri krukke indeholder en platform. Med batteriet krukken er placeret i en godkendt ventilations hætte, placere en isofluran-mættet stykke gaze under platformen og vent 3-5 minutter for at lade isofluran at mætte batteriet krukken. Anbring rotte indersiden og fjerne for halshugning, så snart rotte har mistet bevidsthed. Hurtigt fjerne hjernen (ideelt på under to minutter), skylles under koldt vand, og placer straks i kølet gnaverhjerne matrix.
- Et minut efter positionning hjernen i matrixen ved at indsætte kolde barberblade i den afkølede hjernen, der begynder omkring 2 mm rostralt for optikken chiasm hvis striatum og nucleus accumbens ønskes til analyse foruden midthjernen kerner. Fortsat indsætning kolde barberblade med hver 1 mm sektion, indtil ankomsten midtvejs gennem pons, vaklende placeringen af hver efterfølgende barberblad for at lette nemmere fjernelse af enkelte blad.
- Da trækker ud barbermaskiner, kigge efter starten af hippocampus. Når den er helt svøbt omkring midterhjernen, begynder at tage dele med # 11 skalpelblad, som illustreret i figur 2.
- Anbringes straks dissekeret væv i forvejen afkølet mikrofugerør på tøris. Hos rotter, forventer at kunne dissekere SN og VTA fra et minimum af to koronale skiver og højst tre. Store væv ved -80 ° C indtil den er klar til forarbejdning.
2. Væv Analyse: HPLC feller Dopamin og metabolitter
For fuldstændige oplysninger om HPLC-udstyr og vedligeholdelse, henvises til HPLC-analyse ved afslutningen af manuskriptet.
- Forsigtigt homogenisere vævet umiddelbart efter fjernelse fra tør-is med iskoldt 0,1 M HClO4-EDTA-opløsning (0,1 M HClO4 & 0,1 mM EDTA) 9, som indeholder N-methyl dopamin i en koncentration på 20 ng / mL, der tjener som en intern standard til genvinding af prøven under HPLC-analyse. Den Homogenisatoren vi bruger er en Branson Sonifier 150, med indstillingen på 10% af fuld effekt (1 af 10). De følgende lydbehandling mængder anbefales:
I rotte, SN = 250 pi (ensidig dissektion), 400 pi (bilateral dissektion), VTA = 200 pi (ensidig dissektion), 400 pi (bilateral dissektion).
I mus (bilaterale dissektioner kun), SN = 200 ul, VTA = 200 ul. - Efter homogenisering, hold prøver på tøris. Prøver bliver derefter centrifuged (DuPont Sorvall MicroSpin 24S) ved 12.000 RPM for at sedimentere proteinet pellet skal anvendes til western blot-bestemmelse. Supernatanterne injiceres direkte i HPLC. De følgende injektionsvolumener anbefales til præcis analyse i rotter eller mus: (. Fra enten Prep) SN = 150 (. Fra enten Prep), VTA = 160 gl
- Standardstamopløsningen fremstilles ved 1 mg / ml ved tilsætning af den passende mængde af monoaminer og metabolitter * af dopamin komponent til 0,1 M perchlorsyre 0,1 mM EDTA. Koncentrationen af hver forbindelse er 1 mg / ml undtagen tryptophan, som er 5 mg / ml. Standardstamopløsningen er opdelt i 10 pi alikvoter og opbevaret i ultralav indtil brug.
* Alle vægte er korrigeret for saltformen af forbindelsen eventuelt.
Forberede arbejdsstandarden ved fortynding af en 10 ul aliquot af standardstamopløsning til 100 ml af perchlorsyreopløsning. Koncentrationen af arbejdsstandarden er 0,1 ug / ml undtagen tryptophan, som er 0,5 ug / ml. 50 piDette arbejdsstandard injiceres i HPLC til en on-søjle mængde på 5 ng af hver komponent, undtagen tryptophan, som er 25 ng. - Bestemmelse af dopamin genopretning i prøvealikvot:
Der er flere trin til at bestemme dopamin genvinding fra en prøvealikvoten. - Første dele dopamin tophøjde af prøven af dopamin tophøjde af standarden og multipliceres forhold af den totale mængde (ng) af dopamin i standard. Vores standard dopaminkoncentration er 0,1 ng / ul og 50 pi af standard analyseres. Således er mængden af dopamin i standarden er 5 ng. Således kan følgende ligning kan anvendes til at bestemme dopamin genopretning i en given prøve:
(Dopamin tophøjde i prøve / dopamin tophøjde i standard) * 5 ng - Korrigere for tab af prøve ved anvendelse af den interne standard N-methyl dopamin:
Den faktiske udvinding af N-methyl dopamin beregnes på samme måde som dopamin ved at dividere den N-methyl DOPamin tophøjde i prøven ved N-methyl dopamin tophøjde af standarden og multiplicere dette forhold med den samlede mængde (ng) N-methyl dopamin i standard. Ligesom dopamin, er vores standard N-methyl dopamin koncentration på 0,1 ng / pi. 50 pi af standard analyseres. Således er mængden af N-methyl dopamin i standarden er 5 ng. Således kan følgende ligning anvendes til at bestemme N-methyl dopamin genopretning i en given prøve:
(N-methyl dopamin tophøjde i prøve / N-methyl dopamin tophøjde i standard) * 5 ng
Men fordi N-methyl dopamin i hver prøve stammer ikke fra selve prøven, men fra HPLC bufferen er mængden af N-methyl dopamin forventes i hver prøve beregnes. N-methyl dopaminkoncentration i HPLC bufferen er 20 ng / ml eller 0,02 ng / ul, således at det forventede mængde af N-methyl dopamin i hver prøve er fundet ved at multiplicere N-methyl-dopaminkoncentrationen i HPLC-puffer ved aliquot mængde af hver prøve, der anvendes til HPLC-analyse. Dette påvises i nedenstående ligning:
(0,02 ng / ul) * (alikvot prøvevolumen, der anvendes til HPLC-analyse) - Forskellen mellem den forventede og udvindes N-methyl dopamin kan derefter anvendes til at korrigere for mængden af dopamin genvindes ved at justere for en prøve tab. Du skal bare tage forholdet mellem forventede N-methyl dopamin / genvundet N-methyl dopamin, og multipliceres med den genvundne mængden af dopamin. Således er den samlede ligningen for mængden af dopamin i en prøvealikvoten nedenfor:
(Dopamin tophøjde i prøve / dopamin tophøjde i standard) * (N-methyl dopamin tophøjde i standard / N-methyl dopamin tophøjde i prøven) * (0,02 ng / ul) * (alikvot prøvevolumen, der anvendes til HPLC-analyse ) - Samlet dopamin genvundet fra en prøve:
Værdien af dopamin udvundet fra en prøve aliquot anvendes derefter til at ekstrapolere den totale mængde af dopamin i en given prøve. Dette gøres ved at dividere den genvundne mængde (ng) of DA af aliquot mængde og multiplicere denne værdi med det samlede volumen af HPLC-puffer, at prøven blev lydbehandlet i. Dette er givet ved ligningen nedenfor:
(Mængde (ng) af dopamin i prøvealikvoten / volumen prøvealikvot) * (samlet volumen af HPLC-puffer i hvilket prøven blev lydbehandlet).
Læseren henvises til følgende undersøgelser 2,4,10 for en omfattende præsentation af vurderingen af dopamin og metabolitter i forbindelse med aflæsning fra dopamin-regulerende proteiner i ikke kun SN og VTA, men striatum og nucleus accumbens så godt.
3. Væv Analyse: Total Protein og Final Normalisering af TH og DAT resultater
- Anbring det udfældede protein pellets (afledt fra HPLC bufferen behandling) i våd is for at opretholde 4 ° C. Sikre, at hele puffer er blevet fjernet, og arkiveret (hvis bekræftende analyse er påkrævet). Hvis Sn eller VTA skal behandles bilateralt (rotte kun), tilsættes 300 pi (SN) eller 200 pi (VTA) af 1% SDS indeholdende 5 mM Tris (pH 8,3) og 1 mM EDTA til pelleten og sonikat. Tilsæt 150 ul af SDS løsning SN piller eller 100 ul til VTA piller, hvis behandlingen af væv fra ensidige dissektioner.
- Placere prøver i næsten kogende vand i ~ 5 minutter for at færdiggøre proteindenaturering og afkøles til stuetemperatur. Sikre hætter holdes sikkert på dette trin.
- Bestemme proteinkoncentrationen i prøverne ved anvendelse af BCA-assayet, herunder et protein standardkurve (albumin standard) område af 2 - 40 ug protein. Assayet 5 ul volumen af prøven i tre eksemplarer og anvende medianværdien for at bestemme protein mængde af standardkurven. Dividere med assayvolumen for proteinkoncentration. Bemærk dette er den første af to skridt til at normalisere total TH, DAT, og VMAT2 resultater til total protein opsving.
- Forberede prøverne med prøvepuffer (indeholdende dithiothreitol) til reduktion af SDS-elektroforese på 10% acrylamid gELS. Ideelt bør den endelige totale proteinkoncentration er ~ 2 ug / ul. Grunden til denne koncentration udvælgelse er at reducere prøvevolumenet er nødvendig for den endelige bestemmelse af TH-phosphorylering, som ~ 100 ug af total protein vil være nødvendigt til fyldning til nøjagtigt kvantificere ser31 og ser40 TH phosphorylering. Hvis gul farve ses i prøven efter tilsætning prøvebuffer, er prøven for sur. Tilsættes 1 M Tris (pH 8,2) i 10 pi trin, indtil blå farve er genoprettet.
- Forberede prøverne som følger for de følgende bestemmelser af dopamin-regulerende proteiner:
- TH: I en kalibreret standard for TH-protein (som ng), koncentrationen af TH (jævnfør ng TH pr totalt ug protein) i SN forventes at variere fra ~ 0,05-0,27 ng TH pr ug totalt protein 2,4, 7,10,11. Mod en lineær TH standardkurve, der spænder fra 0,5 til 5,0 ng TH og anvendelse primære antistof til TH (Millipore Cat # AB152, 1:1000 fortynding i PVP T-20 Blokeringsopløsning), som frembringer en lineær standardkurve, bør den optimale belastningen af totalt protein fra SN være ~ 10 ug. Koncentrationen af TH i VTA området fra -0,4 til 1,0 ng TH pr ug protein 4,11. Derfor skal total protein belastning for VTA være ~ 5 mg.
- DAT: De relative mængder af DAT i SN eller VTA er væsentligt mindre end de beslægtede terminalfelt regioner striatum og nucleus accumbens 4. Den relative ekspression af DAT som normaliseret til genvundet TH-proteinet er også betydeligt lavere i SN og VTA. Følgelig protein belastninger for kvantificering DAT protein i SN eller VTA skal være meget større end prøve belastninger på de terminale felt regioner. Et minimum på 30 ug af total protein er nødvendigt for præcision i DAT vurdering i VTA og en nominel belastning på 50 pg total protein er behov for vurdering i SN. Den anvendte primære antistof er Santa Cruz, cat # sc-1433.
- VMAT2: Ekspressionen af VMAT2Som normaliseret til totalt protein, er større i de mesoaccumbens end nigrostriatale regioner. Men i forhold til TH udtryk, VMAT2 udtryk er størst i SN og mindst i striatum 4. Anvendelse Santa Cruz cat # sc-15.314, en nominel samlet protein belastning på ~ 40 ug til at være bedst for kvantificering af VMAT2.
- Køre passende mængde af totalt protein ved hjælp af SDS-PAGE på 10% acrylamidgeler. Bio-Rad Protean II elektroforese enhed anvendes til bestemmelser, der er et stort gel format. Overføre proteiner på 0,45 um porestørrelse nitrocellulose. For overførslen indstille en Hoeffer beholder til mindst 27 volt muliggør overførsel kan finde sted i løbet af natten.
- Tillade blots tørre i mindst 30 minutter og derefter farvet med Ponceau S-opløsning (1% Ponceau S i 5% iseddikesyre) for ~ 5 minutter. De-pletten kraftigt med 0,2% HCl-opløsning, indtil de enkelte proteinbindinger klart løse og baggrundsfarvning fjernes. Få et billede af Ponceau S plettenning under anvendelse billede J yderligere kvantificere relative proteinkoncentration belastninger i hver bane og normalisere TH, DAT eller VMAT2 Resultaterne (figur 3).
4. Væv Analyse: Site-specifik TH Fosforylering
Phosphorylering af TH ved ser31 eller ser40 kan øge L-DOPA-biosyntese i catecholaminerge celler 12. Selvom mængden af phosphorylering på hver lokalitet er nødvendigt at øge L-DOPA biosyntese i dopaminerge hjerneregioner som SN og VTA ikke er etableret, er der tegn på, at ser31 phosphoryleringen spiller en væsentlig rolle i reguleringen af L-DOPA biosyntese 10 og samvarierer med DA væv indhold blandt striatum, nucleus accumbens, SN, og VTA 2, 10. Ikke desto mindre inddragelse af ser40 bestemmelser er nødvendige, da mange undersøgelser viser det kan påvirke TH aktivitet, især hvis en tærskel på fosforylering er nået 12.
Mens ser19 phosphorylatipå ikke påvirker TH-aktivitet alene 13,14, kan det betragtes som et kontroldyr for Ca2 +-afhængig signalering på DA neuroner, eftersom ekstracellulær Ca2 + er nødvendig for at øge ser19 phosphorylering under depolariserende betingelser 12. Endvidere er der en signifikant positiv korrelation mellem ser19 phosphorylering med ser31 phosphorylering kun i SN og VTA 10, hvilket betyder, at ser19 phosphorylering status kunne påvirke ser31 phosphorylering, og således indirekte L-DOPA-biosyntese.
Eksempler belastning overvejelser for optimal kvantificering af site-specifikke TH fosforylering støkiometri: Nedenfor er de overvejelser, der kræves for nøjagtige og præcise bestemmelser af site-specifikke TH fosforylering i dissekerede væv præsenteret. Når det er muligt, bør en kalibreret TH fosforylering standard indgå i vurderingen af prøven TH fosforylering. Prøven belastning skal tage account iboende støkiometri på hvert phosphoryleringssted, således at assayet kvantificerer phosphorylering i det dynamiske arbejdsområde af antistoffet, der anvendes. Som en sidste bemærkning, bør den iboende totale protein kommer ind i analysen for hver prøve, der også fyldt på standardkurven baner. Dette opnås let med et bærerprotein (fx rottelever), som ikke udtrykker TH.
- . ser19 Af de tre phosphoryleringssteder er ser19 phosphorylering støkiometrien niveauer højest i SN og VTA, der spænder fra 0,15 til 0,25 2,10,11. Den anden overvejelse er, at vores påvisningsmetode ser19 ps kvantificeret i lineære interval mellem 0,5 og 5,0 ng fosfor ser19 10. På baggrund af disse overvejelser i alt TH protein belastning mellem 5 og 10 ng (hvilket giver en anslået 0,75-2,5 ng phospho-ser19 fra prøven) vil tilvejebringe en pålidelig måling af ser19 TH phosphorylering. Vi anvender Phosphosolutions primære (kat. # P1580-19) ved 1:1000 fortynding.
- . ser31 ser31 phosphorylering støkiometrien niveauer er relativt mindre i SN og VTA sammenlignet med deres beslægtede terminalfelt regioner, der spænder fra ~ 0,04-0,10 2,4,10,11. Ved vores påvisningsmetode ser31 ps påvises i lineære interval mellem 0,5 og 7,0 ng fosfor ser31 10. På baggrund af disse overvejelser i alt TH protein belastning mellem 10 og 30 ng (hvilket giver en anslået 0,50-3,0 ng phospho-ser31 fra prøven) vil tilvejebringe en pålidelig måling af ser31TH phosphorylering. Se figur 4A for et eksempel på ser31 kvantificering. Vores primære antistof er en in-house affinitetsrenset antistof, som blev fremstillet af 21 århundredes Biochemicals (Boston, MA), og godkendt til specificitet phospho-epitop hjælp af vores in-house standarder 2.
- ser40 ser40 phosphorylering støkiometrien niveauer i SN og VTA intervallet fra ~ 0,02. - 0,06 2,4,10,11. Af vores påvisningsmetode, ser40 ps detekteres i lineære område mellem 0,2 og 2,0 ng phospho-ser40 10. På baggrund af disse overvejelser i alt TH protein belastning mellem 10 og 30 ng (hvilket giver en anslået 0,20-1,8 ng phospho-ser40 fra prøven) vil tilvejebringe en pålidelig måling af ser40TH phosphorylering. Se figur 4B for et eksempel på ser40 kvantificering. Vi anvender Phosphosolutions primære (kat. # P1580-40) ved 1:1000 fortynding.
5. Repræsentative resultater
- Dopamin i SN vs VTA Der er tre udlæsninger af dopamin (eller metabolitter), der kan træffes i kvantitativ analyse;. Pr alt genvundet fra dissektion, pr protein, og pr TH protein (påvist i striatum, SN, nucleus accumbens, og VTA i tabel 1 nedenfor). Samlet dopamin inddrivelse mellem SN og VTA er nogenlunde sammenlignelig på mellem 6-9 ng i to til tre koronale slice dissektioner 2. Normalisering dopamin opsving til total protein vil vise that, baseret på dissektion anvendte metode, at VTA vil have større dopamin pr totalt protein i gennemsnit 6-8 ng / mg protein i SN og 9-10 ng / mg protein i VTA 2, 4. Endelig bør normalisering af dopamin og totalt genvundet TH viser også en forskel mellem SN og VTA, er større i VTA 10, og området mellem 0,2 og 0,8 ng dopamin pr ng TH protein mellem de to regioner 2,10.
DA region Samlet DA inddrevet DA per mg protein DA pr ng TH striatum 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Nucleus accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Total proteiner: TH, DAT, VMAT2 Brug den kalibrerede TH protein standard for kvantificering, er mere TH genfindes i SN end VTA fra dissektion (60 ng i SN og 26 ng i VTA 2). Imidlertid, når der normaliseres til protein, dette forhold reverserer med TH pr totalt protein i VTA er ~ 3 - til 5-fold større end i SN (~ 0,32 ng / ug protein i VTA og ~ 0,09 i SN) 4, 10.
Det forventede opsving i DAT i SN og VTA er ens, med lidt mere opsving i VTA pr total protein eller som pr total TH genvundet 4. Især DAT protein er meget mindre rigeligt i disse regioner sammenlignet med de beslægtede terminalfelt regioner 4 VMAT2 nyttiggørelse som pr total protein er større i VTA versus SN 4. Imidlertid, når der normaliseres til TH-protein, der er lidt større indvinding i SN 4. - Site-specifik TH phosphoryleringen Fra en række undersøgelser, har der været konsistente resultater i ser19, ser31, og ser40 fosforylering mængde i den SN og VTA, og også i forhold til de beslægtede terminale felt regioner. Ser19 fosforylering er især større i SN og VTA (~ 0,2-0,3) i forhold til striatum og nucleus accumbens (~ 0,05-0,15) 2,4,7,10,11. Ser31 phosphorylering er signifikant mindre i SN og VTA sammenlignet med deres beslægtede terminalfelt regioner, idet ~ 0,06 til 0,10 mellem disse somatodendritiske regioner 2,4,7,10,11. Under inhibering af aromatisk syre med NSD 1015, er der en 2-fold stigning i ser31 phosphorylering i VTA kun 10. Ser40 phosphorylering ligger mellem 0,02 og 0,05 i SN ogVTA og generelt denne støkiometri ikke væsentligt afviger fra de beslægtede terminalfelt regioner 2,4,7,10,11.
Figur 1. Dopaminerge udlæsninger fra et væv dissektion.
Figur 2. Dissection teknik til isolering af midthjerne-dopaminerge neuropil. Teknikker til dissekering substantia nigra (SN) fra ventrale tegmentale område (VTA). 1. Fjerne overliggende cortex og hippocampus (disse strukturer allerede er blevet fjernet i ovenstående billede). 2. Foretag en lodret snit adskiller pigmenterede område af SN fra VTA. 3. Foretag en vandret snit ved eller nær midterlinien lige over den dorsale og laterale størstedelen af SN. 4. Drille SN væk fra resten af hjernestammen. Når SN er fjernet, ligeledes drille VTA væk fraResten af midterhjernen. Bemærk: dette afsnit er typisk observeret ved koordinater i forhold til bregma, hos AP 5,7.
Figur 3. Anden (og afsluttende) normalisering af totalprotein bærende Ponceau S-farvning for Image J analyse. Ponceau S proteinfarvning af samlet TH bestemmelse i rotte-substantia nigra prøver. De første fem baner danne venstre er standard totale TH kurve, som 28 ug protein fra rottelever homogenat blev tilsat for at svare til proteinet belastningen fra substantia nigra prøver. Den næste bane indeholder molekylvægt (MW) markører. De resterende baner indeholder ~ 28μg protein fra rotte-substantia nigra prøver. Protein belastninger er baseret på proteinkoncentrationen af hver prøve som bestemt ved BCA-metoden. På trods af hvad der skal være lige store belastninger, er der variationer i mørke Ponceau S farvning mellem prøverne indikerer et svagtvariation i proteinkoncentrationer, som er korrigeret ved normalisering hjælp ImageJ analyse til at analysere mængden af Ponceau S-farvning for hver prøve.
Figur 4. Repræsentative TH phosphoryleringssites resultater fra kontroller og behandlinger. Repræsentative ser31 phosphoryleret tyrosin hydroxylase (PTH), og ser40 PTH Western blots fra saltvand og methamphetamin behandlede Wistar-rotter fra en tidligere undersøgelse 4. A. Ser 31 PTH i rotte-substantia nigra prøver. de kalibrerede Ser 31 PTH standardkurveprøver varierer fra 0,3 ng til 2,0 ng og ligger inden for det lineære område for påvisning. Baseret på tidligere Western blot-analyse af totale TH-niveauer, blev 6 ng total TH indlæses for hver prøve. B. ser40 PTH i rotte ventrale tegmentale prøver. de kalibrerede ser40 PTH standardkurveprøver varierer fra 0,2 ng til 1,5 ng og ligger inden for det lineære område for påvisning. Baseret på tidligere Western blot-analyse af totale TH-niveauer, blev 9 ng total TH indlæses for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som skitseret i figur 1, bør fremgangsmåderne beskrevet ovenfor giver flere udlæsninger af dopamin og dens regulering proteiner TH, DAT og VMAT2 fra en prøve af SN eller VTA opnået fra enten rotte eller mus. Igen, fordelene ved at gennemføre denne protokol er, at investigator kan få operativt matchede udlæsninger af, hvordan dopamin reguleres in vivo under stort set alle eksperimentel paradigme, og derved betydelige eksperimentelle ressourcer spare ved at reducere antallet af dyr, der kræves i enhver eksperiment.
Det er absolut nødvendigt, at undersøgeren observerer temperaturen krav under dissektion (4 ° C), opbevaring af væv (mindst -70 ° C), væv sonikering (øjeblikkelig sonikering efter udlagringen temperatur) i is-kold HPLC buffer og efterfølgende pellet dannelse og behandling. Når pelleten er sonikeret og kogt i SDS-opløsning, kan prøverne fortsat Furthis behandlet ved stuetemperatur. Lagring af arkiverede HPLC analyserede prøve og prøvebufferen fremstillede prøver til proteinanalyse være ved -80 ° C.
Igen, den største fordel af protokollen er den medfødte tilgang til operationelt-match resultater vedrørende dopamin regulering in vivo. Desuden normaliserer dopamin væv udlæsninger til markører for dopaminerg neuropil (TH, DAT), giver en høj grad af sikkerhed for, at investigator er dissekere SN eller VTA med konsistens og nøjagtighed. Da inddragelse af dopamin i afhængighed, psykiatrisk lidelse, og lokomotoriske arenaer, kan denne protokol anvendes i mange eksperimenter. Et bemærkelsesværdigt begrænsning er, at fortolkningen af TH phosphorylering resultater bør være konservativ, idet det ikke er kendt på nuværende tidspunkt, i hvilket omfang en stigning i phosphorylering ved ser31 eller ser40 kræves in vivo for at øge L-DOPA-biosyntese. Som nævnt er der evidence at ser31 phosphorylering synes at regulere L-DOPA-biosyntese og har en rolle i reguleringen af det samlede dopamin væv indhold i CNS 2,10. På dette tidspunkt, er standarder for TH protein og TH fosforylering ikke kommercielt tilgængelige. Imidlertid har dette laboratorium fastholdes og udbygges sådanne standarder er baseret på dem, der anvendes, når det første papir på TH fosforylering regulering in vivo blev offentliggjort 11. Alligevel er det muligt at normalisere dopamin væv indhold inddrives TH protein i disse diskrete regioner ved hjælp af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Finansieringen af dette arbejde, og som citeret 2,10, blev givet, dels ved en forskningsbevilling priser til MF Salvatore fra American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund og Biomedical Research Foundation of Northwest Louisiana, og BS Pruett fra Ike Muslow Predoctoral Fellowship, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
|||
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
|||
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
|||
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
|||
Pump: Shimadzu LC-10AD |
|||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
|||
| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
|||
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
|||
References
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
