Summary
Para purificar de cigotos
Abstract
Los cigotos son intermediarios esenciales entre haploides y diploides estados en el ciclo de vida de muchos organismos, incluyendo la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae cigotos resultado de la fusión de células haploides de tipo de apareamiento diferente (MATa, MATalpha) y dan lugar a las correspondientes diploides estables que, sucesivamente, generar tantos como 20 progenie diploide como resultado de sus divisiones mitóticas sorprendentemente asimétricos 2. Formación de cigoto está orquestada por una compleja secuencia de eventos: En este proceso, los factores solubles de acoplamiento se unen a los receptores cognados, provocando mediadas por el receptor cascadas de señalización que facilitan la interrupción del ciclo celular y culminan en la fusión célula-célula. Los cigotos se puede considerar un modelo para progenitor o función de células madre.
Aunque se ha aprendido mucho acerca de la formación de cigotos y aunque cigotos se han utilizado para investigar las células moleculares preguntas de interés general sigicance, casi todos los estudios han hecho uso de mezclas de apareamiento en el que los cigotos se entremezclan con una mayoría de la población de células haploides 3-8. Muchos aspectos de la bioquímica de la formación del cigoto y la vida continua del cigoto por lo tanto permanecen sin investigar.
Informes de purificación de cigotos levadura describir protocolos basados en sus 9 unidades de sedimentación, sin embargo, este procedimiento sedimentación basada no cedió casi un 90% de pureza en nuestras manos. Además, tiene la desventaja de que las células se exponen a hipertónica sorbitol. Por lo tanto hemos desarrollado un procedimiento de purificación versátil. Para este propósito, pares de células haploides que expresan proteínas fluorescentes rojas o verdes se co-incubaron para permitir la formación de cigoto, se recogieron en diversos momentos, y los zigotos resultantes se purificaron utilizando una citometría de flujo basada en protocolo de clasificación. Esta técnica proporciona una evaluación conveniente visual de la pureza y la maduración. La pureza mediade la fracción es de aproximadamente 90%. De acuerdo con el momento de la cosecha, los cigotos de diferentes grados de madurez se puede recuperar. Las muestras purificadas proporcionar un punto conveniente de partida para "-ómicas" estudios, para la recuperación de la progenie inicial, y para la investigación sistemática de esta célula progenitora.
Protocol
1. Crecimiento célula haploide
- Crecer S. células de Saccharomyces desde el fondo S288C (BY4741) bajo condiciones estándar 10.
- Transformar haploides para expresar cualquiera de los dos marcadores fluorescentes visibles 10. Los marcadores de elección son GFP soluble expresada en el citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado con BglII 11) y una proteína ribosómica único, RPL25, fusionado con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Esperamos que los equivalentes de dos colores protocolos de purificación podría hacer uso de otras proteínas fluorescentes brillantes que son sintetizados por las células parentales haploides. Alternativamente, la pared de la célula podría ser etiquetado con lectinas fluorescentes.
- En la purificación día cigoto anterior, inocular 5 ml de cultivos de cada tipo de células y cultivarlas con agitación durante la noche a 23 ° C para alcanzar A600 no superior a 1,0. Crecer transformantes GFP (ATY4442) en medio sintético completo incluyendo 2% de glucosa (CSM-glucosa) en unand RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) en medio sintético selectivo carente de uracilo 10. Mantener cultivos paralelos de cada tipo celular con agitación a temperatura ambiente.
2. La realización de una Cruz
- Ajuste de la densidad óptica (A600) de cada muestra a 1,0 en medio fresco. [1 Unidad de Densidad Óptica ~ 3 x 10 7 células / ml]
- Mezclar volúmenes iguales de los dos cultivos, vórtice brevemente 3 veces, seguido por un vórtice durante 10 segundos más.
- Preparar glucosa CSM-platos. Las placas son idénticos a los utilizados para el crecimiento de rutina y se han secado 45 min después de verter y solidificación del agar 10.
- Distribuir hasta veinte 40-ml gotitas de la mezcla 1 cm desde el borde de la superficie de placas de glucosa CSM-. Cuando las gotas se aplican primero a la superficie de iniciar el temporizador para medir el tiempo transcurrido. Una vez que el líquido ha sido absorbido (aproximadamente 30 min), cubrir las placas y se dejan en reposo a rootemperatura m.
3. Los preparativos de cosecha
- Muestras de la cosecha después de 1.75-2.5 horas a 23 ° C mediante lavados repetidos individuales gotas secas de la placa usando 150 ml frío CSM-glucosa, manteniendo las placas en hielo. Repetidamente lave el área gotita 10-20 veces con el mismo medio para maximizar la recuperación. Recoge en 15 ml tubos Falcon en hielo.
- Sonda sonicar las muestras 10 veces a 60% de la amplitud con un sonicador de Fisher FB120 (120Watt, 120 voltios, Frecuencia 20 kHz) en hielo.
- Compruebe en el microscopio de fase que pocos agregados o no permanecen. 15-50% de las células se espera que los cigotos se han formado en este punto.
- Deje el tubo de células en una posición vertical sin perturbaciones en hielo durante 10 min, como medida de precaución adicional (para permitir que los agregados de resolver).
- Recuperar la más alta 90% del volumen y filtrarla a través de una malla de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno con tapón tamiz (Ref. 352235)). En un experimento típico, 10 7 célulasse recuperó de una placa eran en este punto se diluyó en 4 ml de CSM-glucosa.
4. Citometría de Flujo
- Organizar las células utilizando el modelo Sony Reflexión iCyt citómetro de flujo, (Sort paralelo altamente automatizado) HAPS1 con una punta de 100 micras. Para excitación GFP, usar el azul de ion argón, 250 milivatios láser a 488 nm. Por excitación mCherry, utilice el láser de 100 mW a 561 nm. A pesar de que no tienen experiencia con otras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson afluencia o Beckman Coulter MoFlo XDP estaría bien cuando está equipado con el láser correctas.
- Base parámetros de clasificación en un gráfico de dispersión hacia adelante frente hacia atrás para puerta de células viables. Establecer una parcela de emisión de 615 + / - 30 nm de paso de banda del filtro (mCherry) frente a 525 + / - 25 nm de paso de banda del filtro (GFP) para dividir los eventos en cuatro cuadrantes, "Red + Green-", "Rojo + Verde +", "Red- Green-"y" Red-Green + "(Figura S2). Utilice las células no fluorescentes como f estándaro la determinación de la "Rojo-Verde-" cuadrante.
- Clasificar las células con una vaina de presión de 21,5 psi, una frecuencia de gota de 43.400 gotas / seg, y una presión de la muestra de 20,5 psi.
- Ordenar inicial ("modo de recuperación"): Recoger las muestras en tubos Eppendorf refrigerada que contienen 250 ml de frío CSM-glucosa. Sedimento 10 segundos a velocidad máxima en una microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) y aspirar la solución de flujo (citometría de flujo de la solución vaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Resuspender en 500 ml frío CSM-glucosa.
- Ordenar Segundo ("Modo de Pureza"): Realizar la especie en cuanto a la clasificación inicial, usando el "modo de pureza" opción. El sedimento. Purificada células y resuspender los gránulos en 500 ml de 1,0-ml CSM-glucosa Agitar durante 15 min en 24-y placas a 23 ° C para permitir la recuperación metabólica.
5. DeltaVision Microscopía
- Preparar pastillas de agarosa como sigue: Llevar una suspensión de 1,5% de agarosa (UltraPureAgarosa, Invitrogen, n º de catálogo 15510-07) en CSM-glucosa a ebullición, agitar brevemente, y después aplicar 0,3 ml de muestras de la solución de agarosa a la superficie del portaobjetos de vidrio horizontales estándar y los cubre a la vez con una segunda corredera (sin la aplicación de presión).
- Después de enfriar durante 10 min, retirar suavemente la corredera superior deslizándolo horizontalmente, teniendo cuidado de dejar una superficie lisa y no perturbar la capa de agarosa. (Cuando la tapa superior se ha eliminado, la muestra de células se debe aplicar dentro de 1-2 min. Cuando se mantienen en una cámara húmeda a temperatura ambiente sin necesidad de retirar la corredera superior, las almohadillas se pueden almacenar durante hasta un día antes de su uso.)
- Las muestras de sedimentos y depósitos alícuotas de 1 ml del sedimento en las almohadillas de agarosa (sin tocar la superficie). Inmediatamente cubrir la muestra con un cuadrado N º 1 cubreobjetos. Recorte el exceso de agarosa con una hoja de afeitar de un solo filo. Sellar las preparaciones con vaselina dispensados desde una jeringa.
- Imagen con DeltaVision (Applied Precision) con un objetivo de aceite de inmersión 100x sin hurgar en la basura (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolucionar z-pilas utilizando el SoftWorx 5.0.0 del programa ( http://www.api.com/softworx.asp ) y procesar mínimamente. Los sucesivos z aviones fueron recogidos generalmente en intervalos de 0.2-0.4 micrones.
6. Los resultados representativos
Los niveles de intensidad de fluorescencia en las células haploides transformadas: El nivel de fluorescencia en los haploides se ilustra en la Figura S1. Antes de la cruz, el examen epifluorescente demostrado que esencialmente todos los transformantes GFP eran verdes y que todos los transformantes mCherry, aunque a menudo débil, eran de color rojo. Para asegurarse de que todas las células utilizadas para la cruz eran de hecho fluorescente, hemos utilizado la subpoblación con la señal fluorescente brillante.
Rendimiento: Unespués de la clasificación inicial, el Rojo + Verde muestra + (Figura S2) incluye típicamente 8-20% del número de entrada de células y un número excesivo de células haploides, tal vez debido a la persistente adhesión célula-célula. Desde alto enriquecimiento no se consigue con un solo género, la muestra parcialmente purificada debe ser sonda se sonicaron dos veces a 60% de la amplitud seguido por re-clasificación. (Clases de recuperación suelen durar entre 1-2 horas, mientras que el segundo tipo requiere sólo 15 min.) De las células sometidas a la segunda clase, los Rojo + Verde + muestras incluyen 23-52% de las células de entrada.
Examen microscópico Fase: El examen al microscopio de contraste de fases mostró que la pureza de la preparación final de cigoto promedio de aproximadamente 90% más de 21 preparaciones (que van desde 86% a 91%). Los contaminantes eran o bien haploides verde o roja, o pares de haploides que estaban en contacto entre sí. Figura 3 tabula el porcentaje de cigotos que tienensin brote, yemas medial (MED), brotes laterales (Lat) o yemas terminales (Plazo), el número de haploides pares del mismo color ("2Same") o color diferente ("2Hap"), así como haploides individuales ( Hap). Cuando las células se recogieron después de 1,75 horas, más de 50% fueron unbudded y las otras subcategorías (con yemas medial, lateral o terminal) son igualmente representados. Después de 2,5 horas había aproximadamente el mismo número de cigotos en cada una de las cuatro categorías (unbudded, con cogollos medial, lateral o terminal).
Observaciones microscópicas (Figura 4):
La estructura de los cigotos parece permanecer sin cambios durante la purificación. De acuerdo a la duración de la cruz, la población tenía diferentes proporciones de cigotos unbudded y reverdeció, como se ha explicado anteriormente. Dado que tanto los haploides verde y rojo mostró una variación considerable en la intensidad de la señal fluorescente, algunos cigotos fueron predominantemente rojo mientras que otros eran predominantemente verde, como se observa por Comparing de las imágenes de un solo color a las imágenes combinadas en la Figura 4. Tenga en cuenta también que la GFP (MW 26kDa) entra en el núcleo y se puede encontrar en el núcleo incluso cuando los núcleos no se han fusionado. Las vacuolas se destacan como negros no fluorescentes esferas.
El producto final de purificación permite obtener una población diversa en varias etapas de desarrollo. Los cigotos etiquetados Una fusión no han sido sometidos. Tipo B son cigotos unbudded. Tipo C tienen un pequeño brote. Tipo D tiene un brote más grande, y cigotos tipo E están a punto de someterse a la citocinesis. Tenga en cuenta también que muchos de los cigotos anteriores todavía exhiben una línea no fluorescente división medial (*), y que la vacuolar "estructura de herencia" (I) 12 puede verse a menudo para extenderse desde el cigoto en la yema. En algunos casos, la señal verde se ha redistribuido en la pareja en un grado mucho mayor que la señal roja. Esto refleja el retardo de transferencia que es característico de polisomas (Tartakoff, en preparación).
6 cigotos, que es suficiente para muchos inmunotransferencias, utilizando procedimientos de detección de quimioluminiscencia. Uso de fenol-cloroformo protocolos de aislamiento que extraer aproximadamente 1,5 mg de ARN a partir de este número de células.
Puesto que los cigotos purificadas han sido enfriado, antes de un análisis más detallado se recomienda la incubación a 23 ° C en medio de crecimiento.
Figura 1. Cronología de la formación del cigoto. Cigotos como un intermedio entre haploides y diploides. Este diagrama muestra la activación clásica (shmooing) de haploides, su fusión, y la formación del brote inicial. Brotes puede ser medial (M), lateral (L) o terminal (T).
Figura 3. Variedades de cigotos en las mezclas de apareamiento fracciones purificadas. Fueron cosechadas después de 1,75 o 2,5 horas para recuperar las fracciones enriquecidas en cigotos relativamente temprana vs relativamente más madura. Ocho experimentos independientes, designados por los distintos colores, se realizaron para cada punto de tiempo. Los gráficos indican el número relativo de cigotos que haVe espacialmente distintos patrones de formación de yemas. Dada la breve duración de la incubación (menos de 2,5 horas a temperatura ambiente) todos los brotes observados son eventos iniciales en ciernes cigóticos.
Figura 4. DeltaVision examen de fracciones enriquecidas. Un campo típico fue examinado por microscopía DeltaVision. Las ilustraciones muestran bien los colores rojo y verde o individual. El rojo corresponde a la etiqueta polysomal (Rpl25p-mCherry) y el verde a las buenas prácticas agrarias citosólica. Tenga en cuenta el alto enriquecimiento de cigotos, y las características designadas subcelulares: las vacuolas (v), brotes (b), el núcleo (N), vacuolar "estructura de herencia" (i), y la partición (*) que aparece para separar el parental dominios en cigotos relativamente temprana. Su color general variable refleja la intensidad relativa de los haploides que fusionaron. En los casos en que los dos dominios parentales retienenun color distinto, el equilibrio de los marcadores (GFP citoplasmática, mCherry etiquetados con polisomas) era incompleta. Time-lapse estudios en curso muestran que redistribuye solubles GFP antes de polisomas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Leyendas complementarias
Figura S1. La fluorescencia de las células haploides Extremo izquierdo:. Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron examinados para detectar una señal verde. La ventana rectangular se creó para evitar que las células negativas. Medio gráfico: Las células que expresan GFP se analizaron citosólica, que muestra la población mayor claridad brillante de positivos. A la derecha: Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron analizados. El rectángulo (idéntica a la que en el extremo izquierdo) incluye las células más brillantes y permite que todos losnegativos que deben evitarse. La designación "R2" indica el porcentaje de células recuperadas dentro del rectángulo indicado.
Figura S2. La distribución de células en la clasificación primero y segundo. Estas parcelas de dos colores indican la proporción de verde + rojo + células en el cuadrante superior derecho (R5). Esta proporción aumenta al 52% en la segunda clase. Eje horizontal: La señal verde. Eje vertical: La señal roja.
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Discussion
La disponibilidad de los cigotos purificados debería facilitar los estudios bioquímicos incluyendo transcriptómica, proteómica y lipidómica, así como la investigación de los mecanismos por los cuales se someten a cigotos ciclo celular de re-entrada, la remodelación de la pared celular, características de florecimiento y la herencia, etc Alternativamente, los cigotos se podría generar a partir con cepas portadoras de mutaciones características en uno o ambos padres. Además, los cigotos purificados, como para células haploides o diploides, se puede congelar en medio que contiene 15% de glicerol y después descongeladas para supervisar aspectos de recurrente en ciernes.
Los experimentos preliminares utilizando otros marcadores fluorescentes adecuados para los propósitos microscópicas (por ejemplo, las histonas o proteínas etiquetadas mitocondriales) no han permitido una recuperación fiable de cigotos, sin embargo, es probable que la purificación comparable podría lograrse a partir de células haploides cuya pared celular ha sido acoplado a rojo o fluoróforos verdes. Hemos evitado sUCH procedimientos, ya que podría imponer un estrés adicional y afectan a las primeras etapas de la formación de cigoto.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. R. Michael Sramkoski ayuda con la citometría de flujo, el Dr. Purnima Jaiswal y el Dr. Wu Di de entrada temprano y Aylyarov Ilya ayuda con las ilustraciones. Apoyado por el NIH Grant R01GM089872 y la Citometría y Microscopia de imágenes facilidad de la base de la sentencia de Centro Integral del Cáncer (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
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