Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

Summary

Se describe un método para medir directamente la fuerza muscular, la fuerza muscular, la cinética de contracción y fatigabilidad de los músculos esqueléticos aislados en un

Abstract

A continuación se describe un método para medir la contractilidad de los músculos esqueléticos aisladas. Parámetros como la fuerza muscular, la fuerza muscular, la cinética de contracción, fatigabilidad y la recuperación después de la fatiga puede ser obtenida para evaluar aspectos específicos del acoplamiento excitación-contracción (ECC) de proceso, tales como excitabilidad, maquinaria contráctil y Ca ^{2 +} capacidad de manipulación. Este método elimina la inervación y de la sangre y se centra en el músculo esquelético aislado en sí. En forma rutinaria utilizar este método para identificar los componentes genéticos que alteran la propiedad contráctil del músculo esquelético, aunque la modulación de Ca ^{2 +} vías de señalización. A continuación, describimos un fenotipo recién identificado el músculo esquelético, es decir, alternans mecánico, como un ejemplo de las diversas informaciones y rica que se puede obtener utilizando el ensayo in vitro de la contractilidad del músculo. Combinación de este ensayo con ensayos de células individuales, los enfoques genéticos y bioquímicosstrY ensayos pueden proporcionar importantes conocimientos sobre los mecanismos de la ECC en el músculo esquelético.

Introduction

Los músculos del esqueleto unen a los huesos del esqueleto y generar fuerzas contráctiles bajo el control del sistema nervioso central. Acoplamiento excitación-contracción (ECC) se refiere al proceso de convertir un estímulo eléctrico a una respuesta mecánica. Ca ^{2 +} de señalización es un componente esencial de la función contráctil en el músculo esquelético. Efectiva movilización de Ca ^{2 +} del retículo sarcoplásmico (SR) es un componente importante para la ECC en células musculares ^{1, 2,} y los cambios en la concentración intracelular de Ca ^{2 +} señalización subyacen a la disfunción contráctil correspondiente en un número de ^3-5 enfermedades musculares. La adecuada valoración de la contractilidad del músculo es esencial y complementaria a Ca ^{2 +} de imágenes y otros ensayos para obtener información sobre la función del músculo esquelético, no sólo a nivel contráctil, sino también a nivel cinética. Fuerza y ​​la velocidad también se puede obtener a informar a la importante propiedad de losla fuerza muscular y el estado del proceso de ECC bajo diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

Este campo fecundo de investigación tiene una historia muy rica y muchas teorías de la contracción muscular apareció más de dos milenios ^6. Investigación músculo moderno probablemente se inicia en 1674-1682 con la observación microscópica de estrías cruzadas y miofibrillas en las fibras musculares por Leeuwenhoek ^6. Casi un siglo más tarde, Luigi Galvani observó que los contratos de rana musculares vigorosamente cuando el nervio se toca con bisturí durante una descarga de chispa de una máquina distante eléctrico ^7-9. Contracción también se podría producir mediante la conexión del nervio pierna en el músculo a través de un conductor de metal. Los detalles del mecanismo de señalización eléctrica complejo preconizadas por Galvani se formularon eventualmente por Hodgkin, Huxley y Katz en su famosa ecuación ^{10, 11} que se convirtió en la base de la electrofisiología. Las observaciones notables del Ringer a los efectos de la Ca ^{2 +} extracelular sobre la contractilidad del corazón y los músculos esqueléticos rana ^12-15 representan el primer paso importante en el reconocimiento de Ca ^{2 +} como un regulador clave de la contractilidad del músculo ^{16, 17.} Desde la década de 1980 hasta la actualidad una explosión de descubrimientos en el campo de la contractilidad muscular se realizó debido a la introducción de la contractilidad del músculo y protocolos de fatiga del músculo esquelético murino ^18. Jones y Edwards fueron los primeros en sugerir que la fatiga de baja frecuencia intermitente (inducida por el ejercicio en la reducción de fuerza) ¹⁹ se asoció con cambios en la maquinaria ECC y no el aparato contráctil. A finales de la década de 1980 y principios de 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck y Nosek ^21, y Reid ²² estaban usando los músculos del diafragma de modelos de roedores para estudiar los efectos de las teofilinas, cortiosterone y radicales libres sobre la contractilidad del músculo esquelético, mientras que Brooks y Faulkner fueron los primeros en informar sobre las medidas de fuerza de repetirse y las mediciones de consumo en rápido y lento-los músculos de los ratones ^22. Además, Lannegren, Westerblad, Cordero y Westerblad fueron los primeros en vincular directamente la contractilidad ex vivo con la concentración de Ca ^{2 +} regulación y comenzó a cuestionar el papel de la acidosis en la fatiga muscular ^{23, 24.}

Nuestros laboratorios han contribuido de manera significativa desde la década de 2000 hacia la comprensión de nuevos genes con modulador y funciones de regulación en el músculo ECC con papeles críticos en la contractilidad muscular, la fatiga y el envejecimiento mediante el uso de una combinación de estudios intactos de ratón contractilidad del músculo, la concentración de Ca ^{2 Control +} en intactos y sin piel las fibras musculares y las manipulaciones genéticas moleculares ^{3-5, 25-29.}

Aquí se detalla el protocolo experimental para la medición de la contractilidad murino soleus aisladas y longus extensor común de los dedos (EDL) músculos, que corresponden a una mayoría de lento oxidativo (tipo I y IIa fibras musculares) y un músculo en su mayoría rápido glyocolytic (tipo IIb y fibras musculares IIx) con diferentes propiedades contráctiles. En este protocolo, intactos músculo-tendón complejos se aislaron y se bañó en una IDA sistema PowerLab Radnotti cámara suministrada con oxígeno puro o una mezcla de oxígeno (95%) y CO ₂ (5%). Fuerzas contráctiles fueron generados por estímulos eléctricos de un estimulador Grass y detectado usando un transductor de fuerza que se ha integrado con un sistema de ADI PowerLab/400, permitiendo la personalización de las rutinas de macro para controlar la adquisición, la recogida, la digitalización y el almacenamiento de datos. Esta configuración puede medir la fuerza muscular, fuerza muscular, así como la relación de la fuerza frente a la frecuencia, la fatiga muscular, la recuperación de la fatiga muscular, la velocidad y en general las propiedades cinéticas de la contracción muscular. Además, los efectos de los fármacos sobre la contracción muscular puede controlarse a través de estos experimentos. Las ventajas de este método reside en la eliminación de los componentes neuronales y vasculares lejos del músculo esquelético, lo que permite la evaluación directa de las propiedades intrínsecas de contraer el músculo. Además, los ensayos de contractilidad ex vivo permiten la manipulación del medio extracelular que rodea a los músculos aislados, que permite el uso de manipulaciones farmacológicas de diversos canales iónicos y transportadores de permeación a fin de definir sus papeles fisiológicos para la función del músculo esquelético.

Este sistema ex vivo que nos ha permitido descubrir recientemente un comportamiento distinto alternan en ciertas preparaciones de músculo mutantes, que estaban vinculados con alteración intracelular de Ca ^{2 + 4} propiedades de manejo. Alternancia se definen como episodios de ráfaga fluctuantes de la fuerza contráctil durante la fase de declive del perfil de fatiga. Durante estos eventos fuerzas contráctiles aumentar momentáneamente por encima de su nivel anterior de la fuerza durante la estimulación fatiga, tal vez porque sea más Ca ^{2 +} se publica o la maquinaria contráctil se ha vuelto más sensible a Ca ^{2 + 30.} Tratamiento de ácido ciclopiazónico (CPA), un bloqueador reversible de retículo sarcoplásmico calcio ATPasa (SERCA), la cafeína, un agonista de rianodina canal (RyR) y se repitió fatigoso estímulos pueden inducir alternans mecánicos ^4, lo que sugiere que alternans están directamente relacionados con modulación del proceso de acoplamiento CE. Demostración del método para inducir y registrar en alternancia mecánica en la configuración de la contractilidad vitro sirve como ejemplo para mostrar los parámetros experimentales diversificados que se podrían obtener con este sistema o similares, en base a los intereses individuales de investigación.

Este método puede ser de interés para los investigadores que estudian la fisiología muscular. Configuración similar también se puede utilizar para aisladas complejos muscle-tendon/ligament esqueléticos de otroubicaciones anatómicas, así como para las fibras individuales y las tiras musculares.

Protocol

Solución composición:

2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode solución: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl _2, 2 mM de MgCl ₂ y 10 mM de glucosa

0 mM Ca ^{2 +} Tyrode solución: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM de MgCl _2, 0,1 mM de etileno glicol tetraacético (EGTA) y 10 mM de glucosa

Nota: La solución de baño debe ser saturado con 100% de O ₂ si se utiliza la solución anterior, pero con 95% de O ₂ con 5% de CO ₂ si se utiliza basadas en bicarbonato tampones para mantener el pH constante. 2,5 mM Ca ^{2 +} se añade al tampón de baño para recapitular el nivel de Ca ^{2 +} se encuentra en el espacio extracelular y 10 mM de glucosa es importante ya que la mitocondria todavía están funcionando en estos músculos para producir continuamente ATP en presencia de glucosa.

1. Creación de la ex vivo Experimento contractilidad Usola IDA PowerLab Sistema

1. Un dibujo esquemático de un sistema de 4-canal ex contractilidad in vivo se muestra en la figura 1. Un ordenador controla un estimulador para generar pulsos de onda cuadrada, que son filtrados por la unidad de aislamiento para llegar a un par de hilo de platino que rodea cada aislado músculo-tendón complejo. Esto también se llama estimulación de campo. La contracción del músculo en respuesta a la estimulación fue detectada por un transductor de fuerza, la señal generada de la cual se amplifica, se filtra y se transfiere de nuevo al ordenador por un convertidor A / D (acondicionamiento de la señal). La señal es entonces digitalizados y pueden guardarse para su posterior análisis.
2. Para prepararse para un experimento in vivo ex contractilidad, a su vez primera en el estimulador de campo, el convertidor A / D (en este caso ADI Power Lab) o un software similar (por ejemplo, LabView), seguido por el ordenador.
3. Abrir Chart4 software (o versión de otro software que es compatible con el sistema) y iniciatea 4-canales tarea, la comunicación adecuada del software y el hardware se indica a partir de la configuración de hardware y el botón START en el software en funcionamiento (en vivo), la función de 4 canales permite la medición simultánea de un par de músculos un tipo salvaje y un ratón mutante, o 2 EDL y sóleo 2 del mismo ratón, y que puede ser utilizado para otros músculos como el diafragma (diafragma conjunto, hemi-diafragma, o tiras de músculo diafragma) y el tibial anterior; también puede ser utilizado para las preparaciones del músculo cardiaco y para paquetes de músculos, en particular si se está utilizando músculos de rata. En este caso el tamaño de los músculos puede limitar la difusión de oxígeno tan haces musculares son por lo tanto una mejor elección. Sin embargo, las técnicas de disección expertos son necesarios para preparaciones haz muscular.
4. La calibración del transductor de fuerza: se trata de asegurar la comparabilidad de los datos generados en los diferentes canales y en diferentes momentos. De inicio de grabación En primer lugar, Sequentially colgar un 1-g, 2 g, y pesas de 5 g de la muestra en la arboleda del transductor de fuerza, detenga la grabación, calcular los cambios correspondientes en mV se muestra en cada canal de Chart4 software, trazar la ΔmV y el peso para comprobar la linealidad y determinar el factor de conversión entre mV y los gramos de fuerza. Se recomienda realizar estas calibraciones ya sea al principio o al final de cada experimento para garantizar que una calibración específica se obtiene para cada experimento específico.
5. Compruebe la correcta conexión del tubo de teflón, drenar cualquier líquido presente en el tubo de baño de tejido, lavarse las cámaras de tres veces o más con ddH ₂ O y se llenan de 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca ^{2 +} solución Tyrode. Ca ^{2 +} y glucosa se ​​proporcionan en la solución de baño para ayudar a mantener la integridad de la membrana, óptima Ca ^{2 +} carga de la SR, y una fuente fácilmente disponible de energía para la generación de ATP por el propio músculo, ya que las mitocondrias permanecen completamente funcionales en estas preparaciones.
6. Verificar que la conexión de la fuente de oxígeno, abrir el tanque de oxígeno, y ajustar el flujo de oxígeno para proporcionar burbujeo difusivo y homogénea de la cámara. Los niveles de oxígeno se puede determinar fácilmente como una función de la fuerza contráctil en función del tiempo. Un medidor de flujo también se puede instalar, en particular si los investigadores están interesados ​​en el estudio de los efectos de la hipoxia o hiperoxia. Si los músculos se hipóxica, la fuerza disminuye naturalmente. Mientras que la hiperoxia también puede dañar los músculos, pero sus efectos pueden ser más difíciles de detectar porque la mayoría de los experimentos se llevan a cabo bajo condiciones artificiales hyperoxic para compensar la ausencia de un suministro normal de sangre a los músculos. En la mayoría de los sistemas, es posible burbuja de las diferentes cámaras con la misma cantidad de oxígeno simplemente controlando el flujo de oxígeno a cada cámara constante.
7. Ajuste la sensibilidad de todos los canales para asegurar la resolución máxima fuerza sin saturar el canal. Sensibilidad de canales puede variar considerablemente a medida que la función de und edad del animal, la temperatura experimental, las manipulaciones genéticas, el tamaño del músculo, la cepa de ratón, y la capacidad de experimentador para disecar los músculos adecuadamente libres de daños. En nuestra experiencia, cuando se mide la fuerza contráctil del músculo sóleo, la sensibilidad varía de 0,5 a 10 mV / cm, mientras que en el caso de EDL, la sensibilidad podría variar desde 1 hasta 20 mV / cm.
8. Un protocolo para la estimulación fatigoso necesita ser establecido. En el software Chart4 una macro se puede utilizar. Para programar una macro nueva en el software Chart4, haga clic en iniciar la medición, a continuación, haga clic en Macro, comando Macro, iniciar la grabación, repetir empezar, seleccione la frecuencia deseada estímulo, y luego repetir final. Para un protocolo de equilibración, el estímulo se repite cada minuto durante 30 minutos y fatigoso para el protocolo, el estímulo se repite cada 2 s durante 5 min. Estos cambios en la periodicidad de la estimulación, afectan directamente al ciclo de trabajo, que es también una función de la duración de la estimulación. Estos parámetros se pueden variar para probar aspe diferentects de la contractilidad y la fatiga.

2. Preparación de paquetes intactos Muscle

1. Disección EDL: ratón se sacrifica siguiendo las directrices de NIH y IACUC animales protocolos institucionales. Ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Ratón se coloca entonces en la posición lateral. Músculo EDL es un músculo rápido glicolítica con rosa pálido de color blanco. Está a unos 10-13 mm de largo y pesa 11.8 mg en el medio silvestre de tipo ratón C57BL / 6. La EDL tiene las funciones de extender los dedos 2-5, y dorso-flexión del pie en el tobillo. Está inervado por el nervio peroneo. Para diseccionar la EDL, hacer una incisión en la piel superficial y cortar y abrir la fascia entre el tibial anterior y el grupo muscular posterior, y localizar el origen (proximal) donde ligamento está conectado a la cóndilo lateral de la tibia y superior 3/4 de la anterior superficie del peroné (margen interóseo). Cortar el ligamento con tijeras oftálmicas delicados como distalmente como sea posible en el músculo, lo que procedure libera el origen proximal del músculo EDL. Sostenga el ligamento con un fórceps romos y tire con suavidad para liberar el EDL. Puede que sea necesario cortar algunos de los perimisio que rodea los músculos EDL y otro alrededor de la EDL, un paso que es crítico, ya que se puede dañar el músculo EDL durante esta etapa delicada. A continuación, pasar a la zona de inserción donde los cuatro tendones distales insertar en las falanges media y distal de 2-5 dígitos. Cortar los tendones en la medida de lo posible de los músculos.
2. Transferir el músculo EDL aislados en una placa de disección que contiene solución de Tyrode isotónica. Algunos modelos animales mutantes, transgénicos y knockout tienen músculos muy frágiles y la utilización de Ca ^{2 +-libre} solución Tyrode es necesario para evitar Ca ^{2 +-inducida} por daño muscular antes de las mediciones de la contractilidad. A continuación, utilice un nudo quirúrgico para amarrar firmemente en ambos extremos del músculo EDL como distalmente desde el músculo como sea posible. Una buena medida es atar ligeramente por encima de la mitad de pØint longitudinal del ligamento o tendón. Usar 6-0 sutura tamaño para este procedimiento, y transferir el músculo EDL para el O _2-saturada cámara de baño de tejido, montar el músculo en la ranura de la muestra del transductor de fuerza y el gancho de escritorio en la parte inferior de la cámara de baño, repetir el proceso para la otra pierna. También estamos comenzando a utilizar un nuevo método que mantiene los músculos con pinzas en lugar de suturas. Si el principal objetivo es estudiar las propiedades cinéticas y / o para obtener la potencia muscular, se recomienda que la sutura ser tan corto como sea posible o la sutura se sustituye con una varilla de metal.
3. Disección Soleus: el sóleo es principalmente una lenta oxidativo muscular de color rojo intenso. Se trata de aproximadamente 1 mm más corto que el EDL pero pesa un poco más que el EDL. Está inervado por el nervio tibial y se realiza la acción de flexión plantar del pie. Para diseccionar el sóleo, acceder a la parte lateral posterior de la pierna, separe el músculo gastrocnemio que normalmente cubre la soleus, e identificar el músculo con el rojo oscuro. En el origen (proximal), cortar los ligamentos que conectan a la mitad proximal de la tibia posterior a lo largo de la línea del músculo soleo y proximal 1/3 de la tibia posterior; siguiente, en la inserción (distal), cortar el tendón calcáneo que se inserta en el posterior calcáneo. Con cuidado libere el sóleo y montar correctamente el músculo sóleo en la cámara de baño como para la EDL.

3. Medición de la contractilidad de los músculos esqueléticos aislados

1. Una vez que los músculos están montados en cámaras individuales de tejidos de baño, iniciar la grabación. La mayoría de sistemas similares permiten a la reducción a cero de la línea de base de grabación de fuerza. Esta función se asocia generalmente con el amplificador, en el caso específico del sistema PowerLab, como función del amplificador de puente. Se facilita la observación de los cambios de línea de base y proporciona una manera conveniente para todas las contracciones musculares a analizar desde cero. Músculos aislados luego se estimularon con pulsos de onda cuadradaque pueden variar ampliamente en función del tamaño de la cámara, el espesor de los alambres de platino, la distancia entre los alambres, e incluso la composición de la solución experimental. Hemos empleado corriente de 60 mA (hemos observado que las corrientes superiores a 350 mA parecen ser perjudiciales para preparaciones de músculo) y los trenes de estimulación de 350, 500 y 1000 m, en función de los objetivos de un protocolo específico. Los pulsos de ondas cuadradas individuales deben tener una duración que oscila desde 0,3 hasta 1 ms.
2. El siguiente paso es seleccionar una frecuencia de estimulación capaz de producir una estimulación tetánica fundida (ex: ~ 100 Hz para permitir la producción de la fuerza máxima en el músculo EDL y ~ 60 Hz en el músculo sóleo) mientras lenta y cuidadosamente el estiramiento de los músculos para identificar la longitud óptima de estos músculos. Cuando los músculos están cuidadosamente estirada, espere 30 s y estimular a 100 Hz, espere 30 s y estirar de nuevo y repita la estimulación, hasta el punto en que la fuerza no se incrementa más.
3. Estos músculos tienen undergone importantes cambios en el medio ambiente. Se recomienda que los músculos poder adaptarse al nuevo entorno, un paso en nuestros protocolos denominado "equilibrio". Equilibrar estos músculos a la misma frecuencia de estimulación utilizado durante la fase de estiramiento, 100 Hz durante 20-30 min, hasta que al menos 5 contracciones tetánicas consecutivas son completamente estables (no reductor, no aumentar, línea de base estable). Periodicidad de los trenes de estimulación (100 Hz, 500 ms de duración, 1 ms individuo pulso) durante el equilibrado es 1 min, lo que equivale a un ciclo de servicio de 1,66%, una estimulación no fatigante. En este contexto, un ciclo de servicio de 1,66% significa que más de un total de 100%, los músculos están trabajando 1,66% del tiempo, mediante el aumento de los músculos del ciclo de trabajo con el tiempo se puede inducir a la fatiga. Si de lo contrario músculos de ratón sano, de tipo salvaje muestran un perfil de fatiga durante este período de equilibrio, es posible que se dañaron durante la disección, la hipoxia se está produciendo en las cámaras / músculos, o elementos excesivactrolysis a través de los electrodos de estimulación se genera radicales libres. Westerblad ha sugerido anteriormente que corrientes de más de 400 mA inducir la formación de radicales libres ^23. Obviamente, el platino se sugiere más alta calidad, ya que otros metales sin duda dará lugar a la formación de radicales libres y toxicidad muscular.
4. Obtener la relación de la fuerza frente a la frecuencia (FF) mediante la estimulación de los músculos con las frecuencias de estimulación siguientes: 1-140 Hz (en incrementos de Hz 5-10), con una periodicidad de 30-60 s cuando se realizan experimentos a 25 º C. Al realizar experimentos a 37 ° C, extender la FF a mayores frecuencias de hasta 300 Hz para el músculo diafragma, 180-200 Hz para sóleo y 220-250 Hz para EDL. A continuación, identificar la frecuencia de estimulación que genera la fuerza tetánica máxima (T _max) y aproximadamente ½ máxima fuerza tetánica (1/2 T _max), a veces es difícil obtener la exacta ½ T _max tanto para EDL y úniconosotros los músculos si sólo una fuente estimulador está siendo utilizado, debido a las diferencias intrínsecas entre estos músculos. Una solución viable es identificar una frecuencia que produce un 30-70% de la T _max. La justificación de estas frecuencias de estimulación es que _Tmax proporciona información importante de los acontecimientos maquinaria contráctil / modulación, mientras que la media _Tmax proporciona información más pertinente a la regulación de Ca ^{2 +} y el proceso de ECC. Para estar seguro de que la fuerza máxima que se ha logrado, 10-20 mM de cafeína se puede añadir a la solución de baño mientras que la estimulación del músculo. Si la fuerza máxima se ha alcanzado, la fuerza no aumentará en la presencia de cafeína. El FF se desplaza a la derecha y las fuerzas tienden a ser ligeramente superior a temperaturas más altas experimentales. Utilizando este sistema, las frecuencias de estimulación se pueden realizar otras si es deseable. El perfil distintivo de contracción de un músculo EDL rápida glicolítica y un músculo sóleo lento oxidativo esse muestra en la Figura 2.
5. Después del equilibrio, la fatiga de los músculos en ½ T _max de 5 min, con un intervalo de estimulación de 2 s y 25% del ciclo de trabajo (Figura 3). Este protocolo de fatiga específica se cree que reflejan mejor la contribución del retículo sarcoplásmico Ca ^{2 + en} libertad para que la contractilidad muscular ^31.
6. Recuperar el músculo en ½ T _max durante 30 min o hasta que la fuerza es estable, en el intervalo de 1 min. Un protocolo de fatiga adicional se puede realizar ahora mediante la estimulación T _max, que se cree que refleja el estado de la maquinaria contráctil ^31. Otra opción es la de extender el protocolo fatigante para intercalar trenes estimulantes que generar T _max y _max ½ T durante la fatiga y para recuperar los músculos con el mismo tipo de estimulación.
7. Repita el FF como se describe en el paso 3.4, la razón es que las diferencias fenotípicas entre diffcepas erent, modelos de enfermedades, o tratamientos de drogas puede ser observado por el análisis de la FF antes y después de la fatiga. Hemos por ejemplo informado anteriormente de que después de la fatiga del FF de pequeños músculos de tipo salvaje se desplaza a la izquierda, mientras que en los músculos de los músculos de edad, se desplaza a la derecha, lo que sugiere efectos diferenciales moduladores de la fatiga del músculo esquelético como una función del envejecimiento.
8. Para investigar la contribución de la Ca ^{2 +} extracelular entrada en la contractilidad del músculo, solución de baño se puede cambiar en una solución que no contiene Ca ^{2 +,} pero 0,1 mM EGTA (0 mM Ca ^{2 +} solución de Tyrode) ^32. Alternativamente, los bloqueadores diferentes de tienda de accionamiento canal puede aplicarse en la solución de baño. Unos pocos ejemplos son: 2-aminoetil diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5 bis-(trifluorometil) pirazol 2 (BTP-2) y azumolene, etc ^{33, 34.} La cafeína puede ser utilizada para explorar la función del receptor de rianodina, y KCl se puede utilizar para evaluar el conjuntopropiedades de despolarización de estas preparaciones. Otros fármacos también pueden utilizarse para investigar la modulación importante de la fuerza durante la fatiga por la Na ^+, K ^+, y el Na ^{+-K +} bombas ^35. La mayoría de estos medicamentos tienen tamaños relativamente pequeños y parecen difundirse rápidamente en estas preparaciones de músculo como lo demuestran sus efectos inmediatos. La falta de un efecto por cualquier medicamento administrado no significa necesariamente que el medicamento no es eficaz y pruebas adicionales usando dosis mucho más alta que la utilizada en los experimentos individuales de fibras musculares son a veces necesarios.
9. Una aplicación única de este sistema ex vivo condujo al descubrimiento reciente de alternancia mecánica en tric-a ^{- / -} músculos ^{4, 30.} Alternancia se definen como episodios de ráfaga fluctuantes de la fuerza contráctil durante la fase de declive del perfil de fatiga. Durante estos eventos, la fuerza contráctil puede aumentar momentáneamente por encima de su nivel anterior de la fuerza durantefatigoso porque la estimulación sea más que Ca ^{2 +} se publica o la maquinaria contráctil se ha vuelto más sensible a Ca ^{2 +.} El brote de la fuerza contráctil tiene que ser 50% mayor que su fuerza anterior y los brotes debe ser visto por lo menos 10 veces durante el proceso de estimulación de 5-min fatiga. Alternans mecánico no son comunes en el músculo esquelético de los ratones de tipo salvaje, pero se puede ver en algunos músculos mutantes con perturbación de la concentración intracelular de Ca ^{2 +} proceso de señalización, tales como el tipo trimérico intracelular canal catiónico A (tric-a) ^{- / -} músculo ^4. Alternans mecánico puede ser inducida a través de estimulaciones fatigantes, el tratamiento con cafeína y ácido ciclopiazónico (CPA), véase la figura 3 para un registro representativo de estos alternans mecánicas. La naturaleza de este fenómeno es bastante intrigante, mientras que un músculo que se fatiga parece capaz de producir momentáneamente más fuerza. En nuestra publicación anterior, Combinación única célula con Ca ^{2 +} análisis revela que la apariencia de alternans es un resultado de la SR Ca ^{2 +} sobrecarga e inestable SR. Creemos que una comprensión más profunda de la alternancia podría conducir a una mejor comprensión del proceso de ECC.
10. Al final del experimento, se mide la longitud y el peso de los músculos individuales utilizando calibre calibrado y balanza analítica, flash congelado el músculo en nitrógeno líquido y guardar a -80 º C, ya que los análisis bioquímicos se pueden realizar en estos músculos. Estos músculos también puede ser mecánicamente-pelado para sondear detallada del proceso de ECC, o ser químicamente piel esenciales para la determinación de las propiedades contráctiles en la ausencia de mecanismos reguladores ECC.
11. Grabado fuerza muscular (mV) se convierte primero a la fuerza gramo sobre la base de los resultados de calibración y normaliza a la fisiológica área de sección transversal (PCSA) utilizando la siguiente fórmula: fuerza muscular (N / cm ²⁾ = (fuerza (g) x músculo length (cm) x 1,06) / (peso muscular (g) x 0,00981) ^5,36. Por otra parte, la fuerza muscular puede ser normalizado a la proteína total o el contenido total de la actina del músculo individual mediante ensayo de Bradford proteína / Commossie cuantificación coloración azul. Bajo ciertas condiciones, mientras que la masa muscular podría verse gravemente afectada debido a las enfermedades, la senescencia, tratamientos farmacológicos, la normalización de la fuerza sobre la base de la masa muscular, la proteína y / o contenido de actina puede proporcionar una lectura más estable.

4. Los resultados representativos

Típicas fuerzas temperatura ambiente contráctiles de EDL y sóleo que responden a estímulos de frecuencia baja, media y alta se muestran en la Figura 2. La contracción inducida por el estímulo EDL Hz 5 permanece como temblores individuales debido a la acción rápida de la SERCA Ca ^{2 +} ATPasa y la intrínseca Ca ^{2 +} propiedades de sensibilidad de maquinaria contráctil, mientras que la contracción sóleo por 5 Hz empieza a fundir (más lento ATPasa unad mayor sensibilidad al Ca ^{2 +} de la maquinaria contráctil), pero los picos de fuerza son todavía separada. En Hz estimulación 20, contracciones EDL están parcialmente fundido, mientras que el sóleo de forma una fuerza completamente fundido tetánica. En la frecuencia de estimulación que produce la estimulación T _max, que puede variar a temperatura ambiente, 80 a 110 Hz para EDL y 60-90 Hz para sóleo, carrera ascendente rápida y rápida relajación de la fuerza tetánica en EDL se observó, lo que es contrario a la las características lentas del músculo sóleo. Figura 2B demuestra que la curva de fuerza-frecuencia del músculo EDL se desplaza a la derecha en comparación con el músculo sóleo, lo que indica que los músculos sóleo son más sensibles a la liberación de Ca ^{2 +} en cualquier frecuencia dada de estimulación debido a la presencia de la miosina lenta y las isoformas de troponina. Además, la maquinaria contráctil responde con más fuerza relativa en el músculo sóleo en frecuencias más bajas. Figura 3 muestransa perfil de actividad de la fatiga del músculo EDL (panel superior) y sóleo (panel medio). Tenga en cuenta la disminución más rápida de la fuerza contráctil bajo estimulación fatiga en el músculo EDL y la mayor disminución en vigor a finales de la fatiga de protocolo 5 min. Finalmente, un perfil típico alternan mecánica de un músculo mutante se muestra en la Figura 3 (panel inferior), que se definió como brotes de fuerza momentáneo durante la fase de disminución de perfil de la fatiga muscular. El brote de la fuerza contráctil tiene que ser 50% mayor que su fuerza anterior y los brotes debe ser visto por lo menos 10 veces durante el proceso de estimulación de 5-min fatiga.

Figura 1. Dibujo esquemático de un sistema de 4-canal contractilidad ex vivo. Pulsos de onda cuadrada son generados por un ordenador que controla un estimulador Grass. Dos unidades de aislamiento de estimulación filtrar el estímulo procedente de la elecestimulador unidad eléctrica para eliminar las fluctuaciones en la señal eléctrica y para establecer una señal estable de onda cuadrada. Esta señal filtrada eléctrica es enviada a las 4 cámaras de baño que contienen los electrodos de alambre de platino que rodean a cada músculo aislado. En última instancia, es la corriente a través de los dos electrodos (llamados estimulación de campo) que generan un potencial de acción, la inducción de la contracción del músculo. Esta contracción es detectada por un transductores de fuerza específicas, transmitidas a los amplificadores de puente, se filtró, promediado (acondicionamiento de la señal) y grabado por software de ordenador a través de un convertidor A / D.

Figura 2. . Representativos fuerzas contráctiles de EDL y sóleo (A) fuerzas de contracción inducida por 5 Hz (panel superior), 20 Hz (panel central) y la fuerza máxima tetánica (T _max) (panel inferior); indica una línea de entrada de la fuerza contráctil de una musculares dañadas, (B) unconjunto representativo que muestra las contracciones individuales de una fuerza vs frecuencia en relación EDL (FF, panel superior) y la curva trazada resultante de la FF (panel inferior). Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. Representante fatigoso perfil y alternans mecánicas. Un perfil típico disminución rápida fatiga del músculo EDL (panel superior) y la lenta disminución de fatiga perfil del músculo sóleo (panel central). Fatiga estimulación conduce a la aparición de alternancia mecánica en un tric-a ^{- / -} músculos alterados con Ca ^{2 +} (propiedades de manejo panel inferior).

Discussion

Medición de la fuerza contráctil y la tendencia a la fatiga es importante para la evaluación global de la función del músculo esquelético. El objetivo principal de este ensayo es determinar los cambios en la fuerza muscular y las propiedades fatigantes bajo ciertas condiciones patológicas, como la sarcopenia y la fatiga muscular, y para evaluar el efecto de las drogas / reactivos sobre la contractilidad muscular. Puesto que la fuerza muscular está muy relacionada con la concentración de Ca ^{2 +} liberación extracelular de Ca ^{2 +} entrada y la diafonía entre estos dos, también podemos recopilar información sobre Ca ^{2 +} señalización de estado en el músculo esquelético mediante este método. Aquí mostramos un fenotipo único denominado "alternancia" mecánico cuando los episodios fluctuantes ráfaga de fuerza contráctil durante la fase de declive del perfil de fatiga fueron vistos bajo un SR sobrecargado e inestable. Se podría esperar que una variedad de fenotipos del músculo esquelético incluyendo la fuerza alterada, FF, fatigabilidad, la cinética contráctiles y ab recuperaciónility después de la fatiga puede ser detectado mediante el ensayo de la contractilidad in vitro bajo diferentes condiciones patológicas.

La etapa más crítica para este ensayo es aislar conjunto de los músculos intactos (o haces musculares y las tiras de músculo) que están libres de daños. Tal objetivo es más fácil de lograr en preparaciones de músculo entero. Aquí demostramos que salir de ligamentos y tendones suficientes para atar los músculos enteros es muy importante para evitar la vinculación del músculo mismo, lo que conduce a daño muscular y, finalmente, la muerte del músculo. Además, burbujeo constante de soluciones, ya sea con 100% de O ₂ en el caso de soluciones basadas en HEPES o una mezcla de O ₂ y CO ₂ para las soluciones basadas en bicarbonato es crítica. Hipoxia y la prevención de la hiperoxia es importante mientras que un medidor de flujo puede ser utilizado. También se utilizó en ciertas situaciones un dispositivo específico que mide el oxígeno disuelto en los líquidos que bañan el tejido. Bajo ciertas condiciones donde los músculos son more propensos a los daños, la manipulación del músculo aislado en una Ca ^{2 +-libre} en solución antes de montar el transductor de fuerza le ayudará a relajar los músculos y reducir al mínimo el daño muscular antes del experimento. Las drogas tales como 2,3 - butanodiona monoxima (BDM) o N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) también se pueden añadir durante la disección para minimizar el daño, particularmente si haces musculares o tiras musculares se preparan, que es común para el estudio contractilidad del diafragma ^{37, 38.} Durante la grabación, preparaciones dañadas normalmente se producen menos fuerza y han aumentado ruido de línea base y las fluctuaciones (véase la entrada de la figura 2), y los resultados de estos músculos pueden ser excluidos de análisis del conjunto de datos, a menos que sea parte del experimento para analizar las respuestas de dañado músculos. Otro punto que puede ser fácilmente ignorado u olvidado es que la estimulación eléctrica en sí mismo puede ser una fuente de toxicidad para los músculos. Se recomienda limpiar periódicamente los electrodos y la chamber con una solución de hipoclorito al 1% para eliminar los contaminantes, residuos de proteínas, precauciones oxidación acumulación etc especial también son necesarios cuando se ajusta la longitud del músculo montado. Es importante estirar en pequeños pasos para evitar el exceso de estiramiento como la alineación óptima de los filamentos finos y gruesos es crítico para una eficiente puente cruzado funcionamiento ^39. Además, se recomienda que la posición relativa de los haces musculares montados a los electrodos de estimulación de campo se mantiene constante y alineados entre todos los canales para asegurar que la misma cantidad de corriente eléctrica se aplica a los músculos aislados. Bajo nuestras condiciones experimentales, los músculos de ratones de tipo salvaje jóvenes permanecen estables durante más de 12 horas y aún más si los antibióticos, FBS 0,2%, y los aminoácidos se añaden a la solución de baño.

Con un cuidado y un control adecuado, este sistema ex vivo podrían proporcionar información sobre la correlación entre Ca ^{2 +} señalización de unad contracción muscular sin la complejidad de la vasculatura, endocrino y el sistema nervioso. Por ejemplo, la pérdida de la dependencia de Ca ^{2 +} extracelular es una firma de músculo esquelético de edad, mientras que SR Ca ^{2 +} liberación disfunción suele producir menos fuerza contráctil y el perfil de rápido fatiga. Como ejemplificado aquí, el aspecto de alternans mecánicas indica SR inestable, que creemos que no se limita a tric-A ^{- / -} músculos, sino también en otros músculos esqueléticos en condiciones patológicas generadoras SR Ca ^{2 +} sobrecarga y la inestabilidad. Esta configuración permite el acceso directo del músculo para varias manipulaciones fisiológicas y farmacológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5