Summary
Ultrason ve bioluminescent görüntüleme ile intravezikal teslim Sarna ve izleme tümör büyümesinin antitümör etkileri değerlendirmek için ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmak.
Abstract
Biz, ortotopik xenograft fare mesane tümörü modelinde, intravesikal teslim küçük bir aktive edici RNA (Sarna) ile mesane kanseri tedavisi için yeni bir yöntem sunmaktadır. Fare modeli inhale genel anestezi altında üretral kateterizasyon tarafından kurulmuştur. Kimyasal yanık sonra mesane glikozaminoglikan tabakası bozmaya intravezikal gümüş nitrat çözeltisi kullanılarak mesane mukozasına tanıttı ve hücrelere eklemenizi sağlar edilir. Steril su, mesane kanseri, insan KU-7-luc2-GFP hücreleri ile çok yıkamadan sonra 2 saat süreyle durmak kesesi içine kateter ile aşılanan edilir. Mesane tümörlerinin daha sonraki büyüme vivo mesane ultrasonu ve bioluminescent görüntülemede tarafından onaylandıktan ve izlenir. Tümörler daha sonra Sarna lipid nano partiküller (LNPs) formüle ile intravezikal tedavi edilir. Tümör büyüme ultrason ve biyolüminesans ile izlenir. Bu prosedür her adım, ekli video gösterilmiştir.
Protocol
Hayvan denekleri Usul Kaliforniya, San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre Hazırlık
- İnsan mesane kanseri hücre hattı KU-7-luc2-GFP (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA)% 10 fetal sığır serumu ve 50 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI-1640 medya yetiştirilir.
- Kültürler 37 ° C'de muhafaza edilir, medya ile CO 2, her iki üç günde bir değişen 5%.
- Hücreler tripsin sindirimi ile toplandı ve bir hemasitometre ile sayıldı. 50 ul içinde 2 x 10 6 hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu fosfat tamponlu tuz hazırlandı ve buz üzerinde tutuldu.
2. Ortotopik Mesane Tümör Modeli
- 8-10 haftalık kadın çıplak (nu / nu) farelerde (Simonsen Laboratuvarı, Gilory, CA) kullanılmıştır.
- Bir hizmet için bir ısıtma pedi üzerine steril bir drape yerleştirinsa cerrahi platformu. Steril yağlama jöle, stileyi iğneler, gümüş nitrat çözeltisi ve steril su ile 24-dil bilgisi olmalıdır kateterler hazırlanır.
- Genel anestezi inhale izofluran (indüksiyon için% 3, bakım için% 1-2) ve roket ucu konisi ile muhafaza ile farelerde indüklenir. Steril oftalmik merhem hayvanın göze tatbik edilir ve bir ısı pedi vücut ısısını muhafaza etmek için kullanılır.
- Yatar konumda fare yerleştirin.
- Yavaşça stabilizasyonu için forseps ile hayvanın vulva kavramak.
- Kaldırıldı iğne stile sahip 24 dil bilgisi olmalıdır intravenöz kateter kullanarak, fare üretra kateterize edilir. Geniş yağlama kullanılmalıdır. Fare supin ile üretra vulva kıvrımlar ve vajina ön hemen arka yer almaktadır. A 45 derece açı başlangıçta pubis altında üretra kanüle ve geçmek için alınır. Bir daha sığ açı sonra mesane içine üretra geçmesine alınır. Nazik pelvik presüretra genellikle yardımcı olabilir düzeltmek için emin. Bakım Bu üretral veya mesane perforasyonu yol açabilir gibi, dirence karşı çok sert bastırıyor önlemek için alınmalıdır. Kateter içinde görülen idrar kesesi lümeninde konumunu teyit etmektedir.
- Stilenin iğne kullanılarak kateter ve mesane lümeni idrar aspire. Stileyi iğne yerde kateter bırakarak, daha sonraki tüm hedefleri ve enjeksiyon için kullanılır. Bu kateter içinde ölü boşluk ortadan kaldırarak hassas hacimli enjeksiyon için izin verir ve tekrar kateterizasyonlarda gereksiz kılar.
- Mesane ürotelium'un glikozaminoglikan tabakası zarar için 0.5 M gümüş nitrat 10 uL enjekte ve 10 saniye durmak için izin verilir. Bu kalan idrarı ile beyaz bir çökelti meydana gelebilir.
- Aspire ve bir stile iğne ile çökelti ve mesane içeriğini atın.
- 100 uL steril su enjekte edilerek mesanenin yıkayın. Su aspire atın. Repe4 yıkar toplam steril su ile yıkama az 3 kez.
- Kateter hazırlık üretra tıkanmak üzere meatusa etrafında 4-0 ipek kravat yerleştirin.
- Daha önce enjekte stileyi iğne kullanılarak 50 uL içinde 2 x 10 KU 6-7-luc2-GFP hücreleri hazırlandı.
- Aynı anda ipek kravat sıkıştırıldı üretra bırakarak, kateter ve stile iğne çıkarılır.
- Ipek kravat kaldırılır ve hayvan uyanmış önce fare 2 saat için genel anestezi altında muhafaza edilecektir.
3. Ultrason
- Genel anestezi buharlaşmış izofluran ve burun konisi ile muhafaza ile indüklenir.
- Vivo A VisualSonics VEVO 770 Yüksek Çözünürlük Mikro-Görüntüleme Sistemi (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) RMV-704 40 MHz prob kullanıldı.
- Ultrason platform üzerinde yatar pozisyonda fare yerleştirin.
- Hayvanın arka ayakları Güvenlibant ile ultrason probu manipülasyonu sırasında aşırı hareketi önlemek için.
- Fare pelvise ultrason jeli uygulayın.
- Enine ya da boyuna görüntüler elde etmek için fare pelvis üzerine bir RMV-704 (40 MHz) ultrason probu indirin.
- Tümör bulunursa, görüntüler tümör boyutlarının ölçümü için kaydedilebilir.
4. Bioluminescent Görüntüleme
- 200 uL (150 mg / kg) lusiferin substrat intraperitoneal gerçekleştirmek.
- Izofluran buharlaşmış ile genel anestezi indükleyin ve burun konisi ile korumak.
- Biyolüminesans görüntüleyici içinde yatar pozisyonda fareler yerleştirin.
- Beş dakika lusiferin enjeksiyonundan sonra, saniyede fotonlar içinde hayvan biyolüminesans ölçmek.
5.. Sarna Hazırlık
- 50-100 mol ölçeğinde oligonükleotidler RNA sentezi.
- Tamamlayan tek iplikli oligonükleotidler tavlama inGoogle'a dubleks saRNAs.
- [1,3]-dioksolanın (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl kolin, kolesterol, ve PEG-DMG - lipid-nanoparçacık (LNP)-Sarna iyonize olabilen lipid 1,2-dilinoleyl-4-(- dimetilaminoetil 2) ile hazırlanır Daha önce tarif edildiği gibi bir spontan vesikül oluşumu formülasyon prosedürü kullanarak. 1
6. Formüle Sarna intravezikal İdaresi
- Ortotopik mesane tümör modeli oluşturulduktan sonra, farelerin lipid nano partiküller (LNPs) (Tablo 1) formüle intravezikal küçük aktive RNA (Sarna) ile tedavi edilir.
- Genel anestezi kurulmuş ve muhafaza izofluran buharlaştırılmış, ve Steril oftalmik Yağlayıcı maddenin tatbik edilir.
- Yatar konumda hayvan yerleştirin.
- Daha önce açıklandığı gibi üretral kateterizasyon gerçekleştirin.
- Üretra ve kateter etrafında 4-0 ipek kravat yerleştirin.
- Kateter tüm idrar aspire veboş bir şırınga ve iğne kullanılarak stileyi mesane.
- 50 uL (3 mg / kg) toplam dozu için intravesikal LNP-Sarna enjekte edilir. Aynı anda ipek kravat sıkıştırıldı üretra bırakarak, kateter ve stile iğne çıkarılır.
- Fare 2 saat boyunca tıkanmadığı üretra ile anestetize kalacaktır.
- Intravezikal LNP-Sarna ile tedavi tümör implantasyonu sonrası 4. Gün başlanmıştır. Fareler 14 tedaviler olmak üzere toplam, her 3 günde bir, seri tedavi edildi.
7. Temsilcisi Sonuçlar
KU-7-luc2-GFP hücrelerinden kaynaklanan mesane tümörleri lusiferaz bioluminescent görüntüleme (Şekil 1A ve C) ve mesane ultrasonu (Şekil 1B ve D) ile izlenebilir. Tümörler Hücre inokülasyonundan sonra 3-5 gün içinde sık sık saptanabilir. Biz farelerin% 90'ında başarılı mesane tümörü implantasyon bulundu. Intravezikal dsRNA ile muamele ensues olarak, tümör ilerlemesi Wi izlenebilirbu yöntemlerin th. Hayvan kurban sonra, tümör büyümesi, aynı zamanda GFP flöresanı kullanılarak teyit edilebilir. Genel olarak, biyolüminesans olarak Şekil 1C ve 1D görsel olarak görülen, mesane tümörleri için ortalama ultrason boyutları ile ilişkili demek. Hayvanlar kurban edildi ve tümör GFP tarafından onaylandıktan sonra Ancak, biz bu biyolüminesans ultrason ölçümleri mi daha canlı tümör varlığı ile daha yakından ilişkili bulundu. Tedavi edilen farelerde rezidüel skar dokusu genellikle ultrason ile görüntülendi ama canlı tümör ayırt edilemedi çünkü bu Sarna (as kontrolleri aksine) ile tedavi edilen farelerde arasında özellikle belirgin oldu.
Şekil 1. Mesane tümörlerinin tümör büyüme kinetiği. (A) Bio-ışıldama, görüntüleme konumlarına ve büyüme teyit etmek için mesane tümörleri içinde lüsiferaz faaliyeti ölçülür. (B) 'in vivo olarak mesane ultrasond 40 MHz prob ile olan boyutları ölçülebilir tümör görüntüleri üretir. (C) Grafikler biyolüminesans ve ultrason boyutlarda tümörün sürekli artış gösteren. 6 hayvanlardan ölçümleri - Değerler (standart sapma + /) anlamına temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz transkripsiyon aktivasyonu için p21 CIP1/WAF1 (p21) yükseltici hedefler LNP formüle Sarna ile tümörlerinin intravezikal tedavisi ardından bir fare ortotopik xenograft mesane tümörü modelinin kurulması için bir protokol mevcut. 2, 3 çıkan tümörler olabilir bioluminescent görüntüleme ve mesane ultrason ile doğrulandı ve izlenmelidir. Ortotopik modelleri idrar ve daha yakından endojen mesane kanseri yakın olduğunu ürotelium'un bir ortam sağlayarak periton, subkutan veya intravenöz modelleri üstün olabilir. Ortotopik fare mesane tümörlerinin çeşitli hem doğrudan hem de mesane duvar enjeksiyon gibi instillasyon kullanılarak kurulmuştur. Tümörün 4-8 intravezikal instilasyon, burada gösterdiği gibi, daha yakından mukozal epitelinde yüzeysel başlar ve derin büyümeye insan mesane tümörleri taklit Onlar ilerleme gibi. Blad karşılamak için gümüş nitrat kullanılarak Bizim yöntemiTümör alımı için Photoshop'ta ucuz ve teknik basittir.
Hadaschik ve ark. Farelerde mesane tümörlerinin instillasyon açıklanan ve güvenilir bioluminescent tümör değerlendirmesi. 5 Biz benzer kateterizasyon ve hücre damlatılması ile başarılı tümör implantasyonu yüksek oranlarda bulundu bildirdi. Bizim tümörler sadece tümör progresyonu ölçülmesi için ek bir yöntem sağlayan, aynı zamanda in vivo mesane ultrason ile biyolüminesans teyit edilmedi.
Bu protokol, biz başkalarının tekniği bazı değişiklikler unutmayın. Biz yerine elektrokoter tümör hücre implantasyonu için mesane ekstraselüler glikozaminoglikan tabakası, bozmaya gümüş nitrat solüsyonu damlatılması istihdam. Bu kullanıcı hatası potansiyeli minimize ucuz, basit ve güvenilir bir yöntem olarak bulundu. Mesane ultrason değerlendirilmesi sırasında, gereksiz üretral kateterizasyon gerçekleştirmek bulunduönceden. Hayvanın anestezi öncesi idrara çıkma neden önemli sıkıntıya maruz olmasaydı sürece, fare mesane güvenilir mükemmel bir tümör görüntüleme için izin görüntüleme sırasında şişmiş edildi. Hiç şüphesiz, üretral kateterizasyon protokolünün en güvenilir adımdı. Deneyimlerimize atimik çıplak farelerin kateterizasyon C57 farelerde daha zordur. Ancak, bu protokol ve video açıklanan tekniği ile, hayvanların% 90 üzerinde tekrar tekrar tümör damlatılması ve tedavi amacıyla başarıyla kateterize edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL California San Francisco Üniversitesi tarafından açılan ve Alnylam İlaç için lisans almış Sarna ile ilgili patent başvurularının bekleyen bir adlandırılmış mucididir.
Acknowledgments
Bu araştırma AACR Henry Shepard Mesane Kanseri Araştırma Bursu (09-60-30-LI) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
