Summary
Cultivo de explantes neuronales de disección
Abstract
El complejo proceso de orientación axón está impulsado principalmente por el cono de crecimiento, que es la estructura dinámica móviles en la punta del axón en crecimiento. Durante axón resultado, el cono de crecimiento debe integrar múltiples fuentes de información de guía señal para modular su citoesqueleto con el fin de propulsar el cono de crecimiento hacia adelante y precisa navegar a encontrar sus objetivos específicos 1. Cómo esta integración se produce a nivel del citoesqueleto todavía está emergiendo, y el examen de proteína del citoesqueleto y la dinámica efectoras dentro del cono de crecimiento puede permitir la elucidación de estos mecanismos. Xenopus laevis conos de crecimiento son lo suficientemente grandes (10-30 micras de diámetro) para realizar alta resolución de imagen en directo de la dinámica del citoesqueleto (por ejemplo, 2-4) y son fáciles de aislar y manipular en un ambiente de laboratorio en comparación con otros vertebrados. La rana es un sistema modelo clásico de desarrollo de los estudios de neurobiología e importantes reflexiones tempranas en mic cono de crecimientodinámica rotubule se encontraron inicialmente utilizando este sistema de 5-7. En este método 8, se recogen los huevos y fertilizados in vitro, inyectados con ARN que codifica las proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente citoesqueleto o de otras construcciones para manipular la expresión génica, y luego se dejó desarrollar a la etapa del tubo neural. Tubos neurales están aislados por la disección y luego cultivadas son, y los conos de crecimiento de neuritas outgrowing fotografiado está. En este artículo, se describe cómo llevar a cabo este método, el objetivo de las cuales es para los conos de crecimiento de cultivo de Xenopus laevis para su posterior análisis de imágenes de alta resolución. Si bien damos el ejemplo de proteína de fusión + TIP EB1-GFP, este método se puede aplicar a cualquier número de proteínas para dilucidar sus comportamientos en el cono de crecimiento.
Protocol
Nota: Se describen los pasos en las dos primeras secciones sólo en pocas palabras, como los protocolos excelentes con información detallada de haber sido publicada antes que se centran más concretamente en los siguientes pasos (por ejemplo, 8-12). Además, el protocolo general de colaboración con las neuronas espinales en Xenopus cultivo de células en vivo ha sido publicado previamente en un artículo de métodos detallados 8. Le recomendamos revisar ese artículo como complemento de este video, aunque aquí no proporcionan suficiente información para llevar a cabo con éxito y solucionar problemas de la disección del tubo neural y el protocolo de siembra en el paso 3.
1. Fertilización In Vitro de Xenopus huevos
- Obtener huevos de ranas hembra que fueron inyectados con gonadotropina coriónica (400 unidades / rana) 12-18 horas antes de la recolección de huevos. Recoger los huevos en 1X solución de Marc Ringer modificado (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM CaCl 2, 5,0 mM de HEPES, pH 7,4 9).
- Fertilizar los óvulos in vitro con testículos picada, como se describe anteriormente 9.
- Después de al menos 20 min, eliminar embrión capa gelatinosa por incubación de embriones en 2% de cisteína en 1X MMR (se llevó a pH 7,8 con NaOH) durante 3-5 min. Lavar con 0,1 X MMR (o 0,1 X. MBS (Modificado salina de Barth, receta 1X: 88 mM NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM de HEPES, pH 7,8)) 3 embriones -5 horas y mantienen a temperatura ambiente hasta que las inyecciones, o si se desea, los embriones lugar a 14-18 ° C para retardar el desarrollo.
2. La microinyección de ARN
Nota: mientras que nosotros utilizamos inyección de ARN aquí, estas técnicas no se limitan al ARN, y ADN, las proteínas o ácidos nucleicos modificados para la manipulación de genes también se pueden usar y se han descrito previamente 12.
- Antes del experimento, los ARN de etiquetado de las estructuras del citoesqueleto u otro are transcribe a partir de moldes de ADN linealizados utilizando el kit mMessage mMachine (Ambion). mRNAs requiere un 5 'tapa y un 3' cola de poliadenilación para promover la traducción y prevenir la degradación en los embriones. pCS2 + es un vector comúnmente usado para este propósito, y el kit de transcripción incluye un análogo de la tapa durante la reacción de síntesis. Se volvieron a suspender ARNm transcrito en nucleasa libre de ddH 2 0, a una concentración de valores entre 500 y 2.000 ng / l, seguido de almacenamiento del sistema a -80 ° C. Antes de la inyección, diluir ARN en ddH 2 0 a la concentración apropiada para inyección. Como sólo un pequeño volumen se inyectan en embriones, resuspendiendo en tampón no es necesario. Nuestra concentración final de inyección es típicamente 50-200 pg / nl, dependiendo de la construcción, y nosotros generalmente se inyecte hasta 4 nl por embrión, aunque muchos laboratorios tradicionalmente inyectar hasta 10 nl, es decir, aproximadamente 1% del volumen total de un embrión. ARN puede ser tóxico en altas dosis, y la dosis por géneros embrionesLLY varía de 10 pg a 1 ng, aunque hasta 5 ng puede ser tolerada en función del gen particular y pureza. Sin embargo, para la localización de imágenes de proteínas, el nivel más bajo posible se debe inyectar para evitar la sobre-expresión de artefactos. ARN para EB1-GFP en este protocolo se utiliza en cantidad final de 250 pg por embrión.
- Preparar agujas de inyección tirando capilar con un extractor de aguja 9, a un diámetro de la punta de ~ 0,2 micras. Con una Sutter P-87 extractor, utilizamos los siguientes parámetros: calor 644, 125 tracción, velocidad 70, hora 250, pero estos parámetros varían dependiendo de la máquina y debe ser reajustado después de cambiar el filamento (que usamos actualmente de 2,5 mm filamento caja cuadrada que es de 2,5 mm de ancho). Bajo el microscopio, romper punta de la aguja con una pinza en ángulo para generar una forma de pluma-como. Hay otros métodos para romper el llenado y agujas de inyección (por ejemplo 11,12), pero llenar la aguja con el ARN mediante la colocación de una gota pequeña (0,5 - 1 l) a la parte final de laaguja. Para la microinyección en embriones, hay un número de sistemas de inyección disponibles comercialmente, dos de las más comunes son el Pico-inyector (Medical Systems), y la Nanoject (Drummond Scientific) (ver 11 para más información). Usamos el Medical Systems PLI-100 Pico-inyector, que utiliza gas comprimido durante un período determinado de tiempo digitalmente con el fin de entregar volúmenes consistentes nanolitros. Volumen de inyección debe ser calibrado para cada micropipeta nueva usando un micrómetro, y el tiempo de inyección debe ser ajustada para alcanzar la cantidad deseada de ARN inyectado.
- Place embriones fertilizados en la 1 - a etapa 4-células en un plato de plástico que contiene 5% de Ficoll en 0,1 X MMR. Sosteniendo el embrión en su lugar con pinzas, o colocar en una plataforma de soporte (una malla de plástico, con una rejilla de 1 mm ~, adherida a la parte inferior del plato con plastilina o cera dental), inyectar volumen deseado en blastómeros animales (ver paso 2,1 para más detalles sobre el volumen de inyección). Distribuir en varios locciones de todo embrión, al menos una inyección en cada uno de los blastómeros animales, para obtener una distribución más uniforme (por ejemplo, para un embrión en la fase 4-células, que normalmente inyectan 1-2 veces en cada blastómero, mientras que en una etapa de 2-células embrión, inyectamos 2-4 veces en cada uno de blastómeros). Una ventaja de esperar hasta la etapa de célula 2-4 es que se asegure de que el embrión haya comenzado a escindir normalmente. Sin embargo, si el tiempo es la esencia, se puede iniciar en la etapa 1-célula, con poca diferencia en el resultado final no sea más embriones que necesitan ser inyectados. Mayores embriones en la etapa se puede utilizar también, y esto es particularmente útil si los tipos específicos de células son objeto de inyección, pero como generalmente prefieren la expresión más amplia, se inyecta en los embriones más jóvenes para reducir la necesidad de inyecciones más numerosos.
- Transferencia de embriones inyectados a un plato de plástico con MMR 0,1 X y les permiten desarrollar hasta la etapa 20-23 13. Incubar los embriones a los 14 a 22 ° C, dependiendo de SPE deseadaed de desarrollo. (Para la disección de los tubos neurales al día siguiente, utilice ~ 22 ° C. Para el día siguiente, utilice ~ 14 ° C)
3. Disección del tubo neural y Revestimiento
- Antes de realizar las disecciones, preparar las 14 placas de cultivo. En primer lugar, los cubreobjetos capa con suficiente solución de 200 mg / ml de poli-lisina en PBS para piscina sobre la superficie del cubreobjetos, de cualquiera de Mattek o Lab-Tek placas de cultivo, y se incuba durante una hora (alternativamente, se podría usar cubreobjetos de vidrio que se sientan suelta en una placa de Petri, para posterior colocación en portaobjetos de vidrio para la formación de imágenes y la inmunocitoquímica). Aspirar y lavar con un exceso de PBS 3 veces, y dejar secar. Entonces platos capa con 10 ug / ml de laminina en PBS (que suelen utilizar 500 l por cubreobjetos, suficiente para piscina sobre la superficie) durante una hora a 37 grados. Aspirar solución de laminina y lavar 3 veces con un exceso de PBS, teniendo cuidado de no dejar que las superficies recubiertas de laminina se exponen a la interfaz de aire. Sustitucie PBS con medios de cultivo (50% de Ringer, 49% 15 L-media, 1% de suero bovino fetal, más 50 g / ml de penicilina / estreptomicina y gentamicina, pH 7,4 y se esterilizó filtro). (Media de Ringer, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM de HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Mientras que nuestro protocolo utiliza este medio, cabe señalar que se trata de un medio enriquecido común para cultivos más viejos ganglionares de la retina de Xenopus, donde las neuronas han reducido de energía reservados. Jóvenes culturas de la médula espinal va a sobrevivir y crecer durante más de 24 horas en los medios de comunicación Timbres puros, sin factores de crecimiento adicionales, y esto es de hecho una de las ventajas de utilizar este sistema. Opcional: añadir NT3 y el BDNF (a concentraciones finales de 25 ng / l cada uno) a los medios de cultivo para aumentar axón.
- Debido a la variabilidad en la expresión de ARNm inyectado, los embriones pueden exhibir un mosaico de fluorescencia. Antes de realizar disecciones, embriones de pantalla para la presencia de fluorescencia, para identificar aquellos embriones que expulse la proteína de fusión de fluorescencia en el tubo neural. Colocar los embriones en la fase de 20-23 fluorescentes en un plato de plástico de agarosa recubierta lleno de medios de Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM de Tris, pH 7,8 a continuación tratado en autoclave) 5. Para hacer el plato de agarosa recubiertas, cubrir el fondo del plato con plástico derretida 1% de agarosa en 0,1 X MMR y endurecer let. Esto proporciona una superficie suave para que no se produce daño a las pinzas finas y agujas de tungsteno utilizados durante las etapas posteriores de disección. La disección de los embriones más allá de la etapa 23 es posible, pero es más difícil ya que los tejidos se adhieren más estrechamente entre sí y por lo tanto requieren un tratamiento más largo con colagenasa.
- Bajo un microscopio de disección, retirar la membrana vitelina con unas pinzas finas, y luego aislar toda la parte dorsal del embrión, haciendo una serie de incisiones. Mientras que un fórceps mantener el embrión en su lugar, utilizar la segunda para hacer una incisión en ellado del embrión para exponer el interior hueco. A continuación, utilice ambas pinzas para apretar a lo largo del tejido entre las mitades dorsal y ventral del embrión, cortando así el embrión en un medio para aislar la porción dorsal que contiene el tubo neural.
- Coloque el explante dorsal en un tubo Eppendorf con 2 mg / ml de colagenasa en los medios de Steinberg durante 15-20 min en un agitador rotatorio, para aflojar los tejidos y, a continuación explante pipeta dorsal en un plástico recubierto con agarosa plato con solución fresca de Steinberg. Alternativamente, el explante se puede colocar en una placa de Petri que contiene la solución de colagenasa durante 15 min, donde la disección completa a continuación, podría llevarse a cabo.
- El uso de un par de fórceps, suavemente diseccionar el tubo neural a partir de la epidermis dorsal y ventral de la notocorda. Deslice la punta de las pinzas entre la epidermis y el tejido subyacente y tire lentamente la epidermis, revelando el tubo neural debajo. A continuación, utilizar una pinza para sujetar el tejido y otro para deslizar la punta entre latubo neural y la notocorda. Por último, utilizar fórceps para extraer los somitas a cada lado del tubo.
- Transferir el tubo neural a un plato de agarosa recubierta llena con medios de cultivo, tal como se describe en el paso 3,1.
- Después de la recogida de varios tubos neurales, las corte en numerosas piezas (aproximadamente 20, si todo el tubo está aislado) utilizando agujas de tungsteno afiladas o fórceps, y después las piezas de la placa en placas de cultivo lleno de medio (preparado en el paso 3,1), extendiéndose los explantes uniformemente en filas.
- Después de la siembra, no te muevas los platos porque esto perturbaría las células de fijación. Incubar los explantes bañados del tubo neural en torno a 20-22 º C. Por lo general dejan la placa de células en el banquillo a temperatura ambiente durante la noche. Uno de los beneficios de Xenopus laevis neuronas es que una incubadora especial para el cultivo celular que regula los niveles de CO 2 o la temperatura no es necesario. Neuritas y conos de crecimiento pueden ser observadas y fotografiadas a temperatura ambiente 12-24 Horas después de la siembra, aunque excrecencia puede acelerarse con la adición de factores de crecimiento. En general, la expresión de un ARN o producto de plásmido tendrá como resultado la expresión variable entre las células, y por lo tanto puede haber una gama de niveles de expresión de fluorescencia entre los conos de crecimiento. Hemos observado la expresión de ARN de proteínas fluorescentes para persisten más allá de 48 h después de la siembra, aunque esto depende de la construcción particular.
4. Los resultados representativos
Después de seguir el protocolo, que se resume en la Figura 1A, sano, correctamente, disecados y se cultivaron explantes neuronales enviará numerosos axones o neuritas en todas direcciones sobre sustrato de laminina / poli-lisina sustrato, que se muestra en la Figura 1B. Los conos de crecimiento en las puntas de los axones pueden ser reflejados por cualquiera de óptica DIC, como se ve en la Figura 1C, a la dinámica de la imagen motilidad general, o alta resolución de la microscopía de fluorescencia para examinar la LOcalization de fluorescentemente etiquetado proteínas del citoesqueleto, por ejemplo, EB1-GFP se muestra en la Figura 1D.
Figura 1. Resumen del protocolo experimental y los resultados esperados. A) Protocolo de diagrama de flujo. Ver película para detalles con respecto a la disección en el día 3. El tubo neural entera debe ser cortado en piezas de 20 del mismo tamaño y distribuyen de manera uniforme en hileras sobre el cubreobjetos. En esta caricatura, tijeras se representan para representar a cortar el tejido con unas pinzas finas. CG gonadotropina coriónica B) Imagen DIC de los axones o neuritas que crecen fuera de explante (explante en la esquina superior izquierda). C) Ampliación de imagen superior del cono de crecimiento en el extremo de un axón en crecimiento. D) Imagen de microscopía de fluorescencia de EB1-GFP en cono de crecimiento. Barra de nivel 10 micras. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
Xenopus laevis explantes neuronales enviar neuritas de una manera muy robusta por 24 hr después de la siembra en la laminina / poli-lisina sustrato, si las condiciones son apropiadas. Con este sustrato, los conos de crecimiento son muy móviles y pueden alcanzar longitudes de los axones de hasta 1 mm, que se extiende en todas las direcciones hacia el exterior a partir del explante, aunque longitudes típicas son 100 micras o más. Si neuritas no crecen hacia fuera, hay un número limitado de razones para que esto sea el caso. Una posibilidad es que los explantes neuronales no se adhieren adecuadamente al plato. Asegúrese de no alterar los archivos adjuntos por mover accidentalmente el plato después de la siembra. Además, asegúrese de que los platos de laminina-y poli-lisina recubierto se hicieron correctamente con todos los reactivos recién preparados. Otra posibilidad para la falta de la excrecencia es que las condiciones de los medios de cultivo de células puede no ser óptima. Compruebe protocolo y los cálculos para asegurarse de que todas las soluciones de comunicación han sido correctamente formulada. Por último, es posible que losembriones de los cuales los explantes fueron obtenidos pueden ser poco saludable, aunque si embriones pueden desarrollarse a la etapa del tubo neural, esto es menos probable que sea el tema. Sin embargo, lo mejor es mantener intactos algunos embriones enteros cultivadas en 0,1 X MMR junto con disecciones para asegurar que el desarrollo continuo se produce.
El paso más crítico de este protocolo es la disección del tubo neural. En comparación con muchos embrión sistema modelo de micro-disecciones, esta es una técnica relativamente simple y de Xenopus laevis embriones son uno de los organismos más grandes y más indulgente para de disección. Sin embargo, si el experimentador es completamente nuevo para la realización de disecciones embrionarias, este paso puede tardar varias horas para perfeccionar (en el mejor repartidos en 2-3 sesiones). Después del tratamiento con colagenasa, algunos prefieren para eliminar la siguiente mesodermo, notocordio, y somitas, seguido por la epidermis, lo que resulta en el tubo neural aislado, mientras que otros prefieren comenzar con retirar la epidermis y luegoseparación de los otros tejidos del tubo neural. Se recomienda probar ambos métodos para determinar qué funciona mejor para cada investigador. Además, tenga cuidado de no poner demasiada tensión en el tubo neural durante su aislamiento. Es mejor para eliminar los otros tejidos del tubo neural, en lugar de retirar el tubo neural de los otros tejidos, con el fin de reducir la tensión en el tubo y evitar que se fragmenta prematuramente. Por último, si los tejidos circundantes son demasiado adherente al tubo neural, a continuación, volver a colocar el explante en la solución de colagenasa durante varios minutos más. Esto hará que la separación del tubo neural de los tejidos circundantes, en especial la epidermis, mucho más fácil. La duración del tratamiento depende de la colagenasa etapa del embrión, como embriones mayores requieren tratamientos más prolongados, de hasta 45 min o más para la etapa 28 embriones.
Además de explantes de cultivo del tubo neural, tubos neurales también podría ser disociado antes de la galvanoplastia, en order a las células de imagen. Los protocolos para este método se describen en 8, 15. Una ventaja de este método es que la morfología neuronal y la longitud de las neuritas puede ser examinado, como el cuerpo de la célula no está oculto en el interior del explante. Además, los explantes neuronales también pueden ser cultivadas en diversos sustratos estampados. Por ejemplo, la señal de orientación "ensayo raya" se ha utilizado para evaluar los cambios en la dinámica del cono de crecimiento en respuesta al encuentro de las fronteras de sustrato en la cultura 16, 17. Un protocolo detallado para la preparación de patrones de franjas de señales se ha descrito 18. Esto puede permitir el análisis de la dinámica del citoesqueleto, mientras que el cono de crecimiento se somete a orientación decisiones de dirección de referencia.
Hay un número de ventajas a usar Xenopus laevis para neurales experimentos de cultivo de explantes. En comparación con otros sistemas, el cultivo de estas neuronas primarias son relativamente fáciles de obtener y requieren bajo costo. Como se pueden cultivar y fotografiado a temperatura ambiente,incubadoras caros no son necesarios. embriones de Xenopus son fácilmente accesibles y se pueden obtener en grandes cantidades, que se desarrollan rápidamente y son lo suficientemente grandes para diseccionar con una formación mínima. Así, este sistema es particularmente adecuado para laboratorios de enseñanza.
Otra ventaja de utilizar embriones de rana es que son susceptibles a las manipulaciones de los niveles de expresión de genes, ARNm o proteína, dependiendo de las necesidades de un experimento particular. Por ejemplo, un beneficio del uso de ARNm es que la concentración y el volumen de inyección puede ajustarse con precisión para controlar el nivel de expresión resultante, mientras que la inyección de ADN, por otra parte, permite la creación de embriones transgénicos en los que puede ser la expresión de genes controlados por promotor específico espacial o temporal (por ejemplo, 19). Por lo tanto, este método de explante neural se puede aplicar a múltiples situaciones para comprender el comportamiento y la función de las proteínas de interés durante el crecimiento axonaly la dinámica del crecimiento del cono.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Bob Freeman para la formación y el laboratorio de Kirschner para la utilización de las instalaciones de rana, y los miembros del laboratorio Van Vactor para el apoyo. Damos las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School de asistencia con microscopía de luz para las imágenes de la figura 1. Este trabajo fue financiado por el texto siguiente: NRSA NIH NIH K99 comunión y compañerismo con LAL, Ciencias Básicas Asociación financiación ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) a AEF, y NIH RO1 NS035909 para DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
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