Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Resumo

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

Resumo

Distribuição igual dos cromossomas entre duas células filhas durante a divisão celular é um pré-requisito para garantir a estabilidade genética ^1. Imprecisões durante a separação de cromossomos são uma marca registrada de malignidade e associada com doença progressiva ^2-4. O posto de controle conjunto do eixo (SAC) é um mecanismo de vigilância mitótico que traz de volta as células em metáfase até que cada único cromossomo estabeleceu uma ligação bipolar estável ao fuso mitótico ^1. O SAC exerce a sua função através da interferência com a activação da APC / C subunidade CDC20 para bloquear a proteólise de ciclina securin e B e, assim, a separação dos cromossomas e de saída mitótico. Penhora incorreta de cromossomos impede o silenciamento de SAC sinalização e provoca a inibição continuou da APC / C ^CDC20 até o problema ser resolvido para evitar missegregation cromossômica, a aneuploidia e tumores malignos ^1.

A maioria dos estudos que tratam da influence cromossômica de apego indevido sobre a APC / C-dependente proteólise aproveitou a interrupção eixo usando despolimerizando ou microtúbulos drogas estabilizadoras de interferir com apego cromossômica aos microtúbulos. Uma vez que a interferência com a cinética de microtúbulos pode afectar o transporte e localização de reguladores críticos, estes procedimentos de suportar o risco de induzir efeitos artificiais ^5.

Para estudar como o SAC interfere com a APC / C-dependente proteólise da ciclina B durante a mitose em imperturbável populações de células, foi estabelecido um sistema de histona H2-GFP-base que permitiu o monitoramento simultâneo de alinhamento metáfase de cromossomos mitóticos e proteólise da ciclina B ⁶ .

Para descrever os perfis proteolíticos, geramos um quimérico ciclina B molécula repórter com uma porção C-terminal de SNAP ⁶ (Figura 1). Em uma reacção de auto-rotulagem, o SNAP-porção é capaz de formar ligações covalentes comalquilguanina-transportadores (substrato SNAP) ^7,8 (Figura 1). Moléculas de substrato SNAP estão prontamente disponíveis e realizar um amplo espectro de diferentes fluorocromos. Quiméricos ciclina B SNAP-moléculas tornam-se rotuladas por adição do substrato de SNAP-membrana permeável ao meio de crescimento de ⁷ (Figura 1). Seguindo a reacção de marcação, a intensidade de ciclina B-SNAP fluorescência cai numa reacção do tipo de pulso-caça forma e intensidades de fluorescência reflectem os níveis de degradação da ciclina B ⁶ (Figura 1). O nosso sistema facilita o controlo da proteólise mitótico APC / C-dependente em grande número de células (ou várias populações de células) em paralelo. Desse modo, o sistema pode ser uma ferramenta valiosa para a identificação de agentes / moléculas pequenas que são capazes de interferir com a actividade proteolítica na metafase para a anafase transição. Além disso, como a síntese de ciclina B durante a mitose foi recentemente sugerida como uma mechanis importantesm na promoção de um bloco mitótica em camundongos e humanos, mantendo os níveis de ciclina expressão B estáveis ^​​9,10, este sistema permitiu-nos analisar ciclina proteólise B como um elemento de um equilíbrio harmonioso ^6.

Protocolo

1. Semeadura de U2OS baseados em células ciclina B SNAP-Repórter (Clone 11 Células ⁶⁾ em lâminas de microscopia Câmara

1. Tripsinizar as células subconfluentes SNAP repórter que foram deixadas a crescer de forma assíncrona em fase log durante pelo menos 48 h.
2. Trabalhando com 8 poços (câmaras de microscópio distribuição constante de células).

Para propagação de células em câmaras de 8 poços a microscópio uma distribuição constante por toda a superfície da câmara de microscópio, de centrifugação 10.000 células e ressuspender em 350 ul de fenol de meio de crescimento isento de vermelho de normal (suplementa....

Discussão

Apresentamos aqui uma abordagem live-célula de imagem baseada em facilitar o monitoramento simultâneo de ciclina B proteólise e alinhamento de cromossomas. Esta abordagem permite o estudo de controlo mitótico em populações de células não perturbados ao nível da célula individual. As curvas de degradação de ciclina B facilitar percepções directas para a actividade do APC / C e assim, indirectamente, reflectem o estado do SAC ^6.

Esta abordagem, apesar de estabelecidos com base na ve.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do produto	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Linha de células repórter	gerado em casa, como descrito 6	clone 11 células repórter (U2OS baseados ciclina B-SNAP células que expressam)
Retroviral ciclina vetor de expressão B SNAP-	gerado em casa, como descrito 6	pLNCX2-ciclina B mut5 SNAP-
Fenol livre de DMEM	Gibco	21063-029	A suplementação com FCS, piruvato de sódio, penicilina / estrepto-mycin exigido
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Solução estoque 400 mM em DMSO
Placa Opstics especial, de 96 poços	Costar	3720
μ Slide-8 bem, ibiTreat	Ibidi	80826
Unidade de Microscopia	Olimpo	IX-81 microscópio invertido com câmara climática
Objetivo	Olimpo	UPLSAPO objetiva de 20x (NA 0,75)
Software de aquisição	Olimpo	Digitalização ^ Aquisição R software (v.2.2.09)
Software de análise de	Olimpo	Digitalização ^ Análise R software (v.1.2.0.6)