Summary
Fremgangsmåte for sporing synaptically tilkoblede nevroner er beskrevet. Vi bruker TVA spesifisitet av en oppstrøms cellen å sondere hvorvidt en cellepopulasjon av interesse får synaptiske innspill fra genetisk definerte celletyper.
Abstract
Klassiske metoder for å studere nevrale kretser er ganske lav gjennomstrømming. Transsynaptic virus, spesielt pseudorabies (PRV) og rabies virus (RABV), og mer nylig vesikulær stomatitt virus (VSV), for å studere kretser, blir stadig mer populært. Disse høyere gjennomstrømning metoder bruker virus som smitter mellom nerveceller i enten anterograd eller retrograd retning.
Nylig ble en modifisert RABV for monosynaptisk retrograd tracing utviklet. (Figur 1A). I denne metoden blir glykoprotein (G) genet slettet fra det virale genomet, og resupplied bare i målrettede nevroner. Infeksjon spesifisitet oppnås ved å substituere et kimært G, bestående av det ekstracellulære domenet til ASLV-A glykoprotein og den cytoplasmiske domenet av RABV-G (A / RG), for normal RABV-G 1. Dette chimeriske G infiserer spesifikt celler som uttrykker TVA reseptor 1. Genet som koder TVA kan vært delivered av ulike metoder 2-8. Etter RABV-G infeksjon i en TVA-uttrykke nervecellen, kan RABV overføre til andre, synaptically koblet nevroner i en retrograd retning av natur av sin egen G som var co-leveres med TVA reseptoren. Denne teknikken etiketter et relativt stort antall innganger (5-10%) 2 på en definert celletype, som gir en sampling av alle inngangene bort på en definert startbilde celletype.
Vi har nylig endret denne teknikken til å bruke VSV som transsynaptic tracer 9. VSV har flere fordeler, blant annet hurtighet av genuttrykk. Her har vi detalj en ny viral sporing ved hjelp VSV nyttig for sondering microcircuitry med økt oppløsning. Mens den opprinnelige publiserte strategier ved Wickersham et al. 4 og Beier et al. 9 tillatelse merking av eventuelle nevroner som prosjekt på først-smittet TVA-uttrykke-celler, her VSV ble utviklet for å overføre bare til TVA-uttrykke celler (figur 1b). Viruset er første pseudotyped med RABV-G for å tillate infeksjon av nevroner nedstrøms TVA-uttrykker nerveceller. Etter å infisere denne første populasjon av celler, utgitt viruset kan bare infisere TVA-uttrykke celler. Fordi transsynaptic viral spredning er begrenset til TVA-uttrykke celler, tilstedeværelse av fravær av tilkobling fra definerte celletyper kan utforskes med høy oppløsning. En eksperimentell flytdiagram av disse eksperimentene er vist i figur 2. Her viser vi en modell krets, at av retning-selektivitet i musen netthinnen. Vi undersøker tilkobling av stjerneglanseffekter amacrine celler (SACS) til retinal ganglion celler (RGCs).
Protocol
1. Making Virus fra cDNA: Gjenvinning av VSV fra cDNA ved hjelp Vaccinia-T7 System 10
- En dag før eksperimentet, delt BsrT7 celler til 60 mm tallerken med DMEM + 10% FBS. Seed 2E6 celler per fat. BsrT7 celler er hentet fra BHK21, eller hamsterunge nyre, celler.
- Varm PBS med 1 mM magnesium og 1 mM kalsium til 37 ° C.
- Få en liten delmengde vTF7-3, en vaccinia virus som uttrykte T7 polymerase og tine til romtemperatur. vTF7-3 er en smittsom vacciniavirus uttrykker T7 polymerase 11, og bør bare brukes i biosikkerhet nivå 2 containment. Dette uttrykket systemet brukes til å generere maksimal nivåer av de ønskede transkripsjoner fra plasmider transfektert i trinn 1,9. Vortex virus i 30 sek på maks hastighet. Sonicate i en tabletop sonikator i 2 min i vannbad ved romtemperatur. Vortex igjen for 30 sek for å bryte opp virale klumper.
- Ta ut mediet fra BSRT7 celler.
- Legg 11.7 ul vTF7-3til 600 pl PBS med magnesium og kalsium og legge blanding på cellene.
- Flytt platene inn i en 34 ° C inkubator med 5% CO2. Rock plater forsiktig en gang hvert 10 min.
- Etter 45 minutter har gått, begynner transfeksjon. Tilsett 20 pl lipofectamine 2000 til 1 ml DMEM og bland. Vent 5 min.
- Legg 5,25 mikrogram PN, 2,3 mikrogram pp, 1,2 mikrogram pl, 1 pg pCAG RABV-G og 6 mikrogram VSV genomisk cDNA til 500 ul DMEM. pN, PP og pl er plasmider kjører ekspresjon av VSV virale gener under T7 promotoren 10, med de beløp bestemmes empirisk for optimal redning av viruset.
- Kombinere begge rør og bland. Vent 15 min ved romtemperatur.
- Fjern PBS og vask platene gang med 1,5 ml DMEM.
- Aspirer skyll media. Legg transfeksjon mix til plate. Flytt plater i 34 ° C inkubator.
- Vent fem time, deretter ta ut medier.
- Endre media til 4 ml DMEM + 2% FBS + 1x Penicillin-Streptomycin + 10 mM HEPES pH 7,4. Tilsetningen av Penicillin-Streptomycin, for å hindre forurensning, og HEPES, for å opprettholde pH i media, er svært viktig. FBS innholdet kan være falt til 2%, som cellene blir ødelagt i løpet av noen dager ved viruset og dermed ikke trenger 10% FBS.
- Sted platene i 34 ° C inkubator i 48-72 timer.
- Samle media på 3 og 6 dager etter transfeksjon, og umiddelbart sprøyte filter gjennom en 0,20 mikrometer filter. Denne størrelsen filteret fjerner vacciniavirus, men ikke VSV.
- Siden vi ønsker å levere RABV-G til viral konvolutten, og genomet ikke koder den RABV-G-genet, må det være kontinuerlig leveres i trans. For å gjøre dette, lage en egen plate av 293T TVA800 (TVA800) celler. Dette er celler som konstitutivt uttrykker TVA reseptoren, som tillater ENVA-mediert virusinfeksjon 12. Ved 80% konfluens, endre medier til DMEM bare, så transfektere cellene med 5 ug av plasmid som koder G protein (dvs. pCAG RABV-G) per plate. Vi bruker PEJeg transfeksjon reagens, en polykationisk polymer som er mye billigere enn sammenlignbare lipid-baserte metoder. Imidlertid kan lipofectamine også brukes effektivt for dette formål. Den optimale PEI: DNA ratio må bestemmes empirisk. Gjør dette i en egen eksperimentere med et fluorescerende reporter, dvs. pCAG GFP. Vi bruker 10 ul PEI: 4 mikrogram DNA.
- Påfør supernatanten fra trinn 16 på transfekterte tallerken TVA800 celler.
- Observere denne platen dagen etter bevis for fluorescens virally uttrykt fluorophore. Viral fluorescens er først observert som en enkelt celle, og gradvis sprer seg over tid (dvs. figur 3). Viruset skal spre seg i et par timer.
2. Passasjen og Konsentrasjon av VSV
- Split TVA800 celler i media inneholder DMEM + 10% FBS slik at du vil ha fire 10-cm plater på ~ 80% sammenflyting neste dag. 293T-baserte celler fungerer godt på grunn av sin høye transfectability, og bruk av TVA-uttrykkende celler forbedrer hastigheten som cellene i parabolen smittes. Andre svært transfectable cellelinjer kan tjene formålet også.
- Ved 80% sammenflyting, endre medier til DMEM bare, så transfektere cellene med 5 ug plasmid som koder G protein som du vil bruke (dvs. pCAG RABV-G) per plate. Vi bruker PEI, men FUGENE / Lipofectamine fungerer like godt.
- Vent en dag etter transfeksjon for glykoprotein uttrykk / overflate akkumulering. Endre mediet (5 ml / plate) som DMEM + 10% FBS, deretter infisere med rVSV (A / RG) virus ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 0,01 <x <0,1.
- Kontrollere mengden infeksjon 24 hr senere. Du skal se infiserte celler (identifisert av GFP fluorescens), noen med omkringliggende flekker av infiserte celler (dvs. figur 3). Vanligvis er det bare verdt å samle supernatanten hvis du ser> 50% av cellene smittet, ellers viral titere obtained fra konsentrasjon vil være suboptimal.
- Hvis> 50%, samle 5 ml media / plate, og erstatte med 5 ml nytt medium. Hvis det er for få celler er infisert, vente på en annen 12-24 timer, og sjekk igjen. Fryse innsamlede supernatantene ved -80 ° C.
- Samle hver 24 hr deretter i 3 dager, for totalt 4 dager.
- Helt, hvis du startet med 4 plater, bør du ha 20 ml medier fra hver dag - så 80 ml totalt, eller 2 Ultrasentrifuger rør verdt supernatant. Tine supernatantene ved 37 ° C og filter over 0,45 mikrometer filtre på is. Aliquot 36 ml virus inn Beckman sentrifugerør.
- Konsentrere supernatanten (21000 K i en SW28 rotor (= 80.000 xg) i 90 minutter) ved 4 ° C. Dekanter supernatanten i et begerglass inneholdende 10% blekemiddel, og mens røret er invertert, bruke en aspirator for å fjerne så mye materiale fra den siden av røret som mulig.
- Mens dekket. rist virale rørene ved 4 ° C i 1 time. En standard shaker på about 120 rpm er tilstrekkelig.
- Forsiktig triturate pellet i de resterende media ved å forsiktig pipettering opp og ned 30 ganger. Vær forsiktig så du ikke å innføre luftbobler. De resterende medievolumet bør være ca 30 ul. Aliquot dette volumet i flere rør slik som å hindre flere fryse-tine sykluser for noen bestemt lager, da dette kan føre til en reduksjon i viral titer. Disse alikvoter kan fryses ved -80 ° C.
- Titer viruset. Titering på ca 2 dager etter infeksjon er optimal. Initial infeksjon kan være observert i løpet av noen timer, men du får en underrepresentasjon av titer hvis du venter bare 1 dag. For å oppnå den virale titer, utfør en begrensende fortynning eksperiment av den konsentrerte virus på riktig cellelinje (293T celler fungere godt) i en 24-brønners plate, fortynne viruset 10 ganger 1-1: 1.000.000. De titere vi får er typisk i området av 10 8 -10 10 fokus dannende enheter (FFU) / ml.
3. Viross Injection
- Vi bruker mus, vanligvis mellom 6-10 ukers alder, for disse eksperimentene. Enhver alder hvoretter kretser er etablert ville nok. Vi vil velge overføring fra retinal ganglion celler (RGCs) til stjerneglanseffekter amacrine celler (SACS) som et eksempel. Dette eksperimentet, som diagramed i figur 2, trenger en trippel transgene dyr og bare en enkelt injeksjon av virus. (Alle prosedyrer vist ble godkjent av IACUC ved Harvard Medical School, og var i samsvar med institusjonelle retningslinjer).
- Først de riktige dyrene må genereres. Målet er å ha TVA uttrykt i celletypen som man ønsker å kartlegge i, ved hjelp av et virus (dvs. adeno-assosiert virus, AAV), eller av en transgen allelet. Celletypen spesifisitet oppnås vanligvis av Cre uttrykk. Her har vi også krysset i en betinget uttrykk TVA allel 7 til en Choline acetyltransferase (chat)-Cre allel 13, slik at TVA er uttrykti alle celler med en Cre uttrykk historie (m fl). Vi har også krysset en betinget uttrykk tdTomato allelet (R26TdT) for visualisering av TVA-uttrykke celler.
- Koordinatene for injeksjon plassering må identifiseres. Disse koordinatene av interesse kan bli funnet i en hjerne atlas, dvs. Franklin og Paxinos mus hjernen atlas 14. Disse koordinatene må bemerkes i forhold til en gitt landemerke på musen skallen. Vi bruker bregma, men noen koordinatsystem er tilstrekkelig.
- Forbered stereotaksiske apparatet. Slå på microinjector kontrolleren, og flytte stempelet og elektrodeholderen på plass. Deretter tilbake-fill injeksjonsnålen med mineralolje for å gi et grensesnitt med viruset. Sett nålen deretter på stempelet, og pass på at ingen luftbobler igjen i nålen.
- Tine viruset, og legg den på isen for å hindre et fall i viral titer. Still microinjector å "trekke" og flytte røret virus slik at det er contacting kapillæret på microinjector. Ta ut den nødvendige mengden av rVSV (A / RG) pseudotyped med RABV-G for forsøket.
- Dyr blir gitt en preoperativ dose av buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg) før operasjonen begynner. For bedøvende dyret, enten isofluran innånding, eller en intraperitoneal injeksjon av en ketamin (40-80 mg / kg) og xylazin (5-10 mg / kg) blanding er tilstrekkelig. Valg av bedøvelse er avhengig av brukeren. En tå klype blir så utført for å sikre at dyr er fullt bedøvet, hvis dyret ikke reagerer, kan du fortsette med prosedyren. Sørg for å få reell lisenser før du bruker disse stoffene.
- Dyr blir plassert på en oppvarmet pad, som er støttet på en bevegelig stativ for posisjonering musen. Dyret forblir der hele varigheten av den kirurgiske prosedyren. Påfør øyesalve å forhindre uttørking av hornhinnen mens dyret er bedøvet.
- Musen hode må da være stabilisert på stereotaksiske enpparatus. Bruke øret stolper på stereotaksiske apparat for å sikre at hodet er grundig sikret, slik at hodet er parallelt med bakken, og roterer ikke sideveis. Når dette er fullført, juster bite bar å bidra til å stabilisere hodet.
- Dyrets pels er barbert i regionen av snitt på toppen av hodet. Dette området blir deretter vasket tre ganger med etanol, etterfulgt av tre ganger med jod. Et snitt er deretter gjort i huden med en skalpell, avslører skallen.
- Når musen og injeksjon oppsett er forberedt, må bregma skal ligge. Dette er det område i sentrum av hodet som i sagittal og to koronale suturer møtes. Når dette området er plassert, kan stille hjulene på stereotaksiske anordningen brukes til å justere den microinjector til riktig koordinater. Her injisere vi den laterale geniculate kjernen (LGN), ved hjelp av koordinater A / P -2,46 fra bregma, L / 2 M, D / V 2,75.
- Når koordinatene har blitt slått på, må boret monteres.Plasser boret inn i drillen, og slå på drillen. Et lite hull skal bores inn i området identifisert som injeksjonsstedet. Vær svært forsiktig med drill for å ikke forårsake skade på hjernen parenchyma. Når benet er svært tynn, blodkar på dura bli klar. På dette punktet, nøye perforere kantene av kraniotomi med en liten (30 gauge) nål og en fin (# 5) tang for å fjerne gjenværende ben.
- Juster kapillær til en posisjon like dorsal av hjernen overflaten, hvor hullet var bare boret. Nålen skal være skarp nok til å trenge inn i dura mater med letthet. Deretter senke nålen til den ønskede dybde, og begynne injeksjon. Vi injiserer virus med en hastighet på 100 nl / min.
- Injeksjonsprosedyren til dette punktet tar omtrent ti minutter. Etter injeksjon, forblir nålen i hjernen i omtrent sju minutter. Dette er viktig, da det tillater diffusjon av virus fra injeksjonsstedet. Raskt fjerne nålen form injeDette skjer område fører til et redusert infeksjon effektivitet på injeksjonsstedet, og infeksjon langs nålen tarmkanalen.
- Nålen er veldig langsomt hevet fra injeksjonsstedet, over en periode på ca to minutter. Dette er igjen beregnet på å redusere infeksjon langs nålen tarmkanalen.
- Gang fjernet, blir huden da sutureres. Dyr overvåkes kontinuerlig til de komme seg etter narkose. Buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg) gis hver 12. time i 2 dager.
4. Høsting Tissue / vevspreparat
- For høsting av vev av interesse, avhenger det optimale tidspunktet på målene i forsøket. Vanligvis kan VSV transsynaptic spredningen første bli observert med mindre enn 24 timers post-injeksjon. Imidlertid vil vente lengre tider resultere i mer spredt.
- Å høste netthinnen, er dyr første avlives ved hjelp av karbondioksid innånding og cervical forvridning er utført. Øyeeplet fjernes deretter, og plassert i et rør coninneholdende 4% formaldehyd i PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Øyeeplet blir deretter plassert i en petriskål med PBS. Netthinnen deretter dissekert bort fra andre vev.
- For hele mount analyse, er retinae kuttet slik som å ligge flatt, som er lagt inn på en glass-slide, deretter montert med forlenge gull montering media og dekket med en null-tykkelse dekkglass. Silikon avstandsstykker er plassert mellom lysbilde og dekkglass å minimere kompresjonskrefter på netthinnen. For del analyse blir netthinnen plassert i 30% sukrose i PBS inntil netthinnen submerges. Det blir deretter plassert i en blanding av 50% oktober og 50% 30% sukrose-løsning i 3 timer. Det er flash deretter frosset og holdt ved -80 ° C inntil den er klar til å kutte.
5. Representant Resultater
Viruset som blir reddet fra cDNA skal kunne infisere TVA800 celler, men ikke 293T celler (Figur 3). Forsyne RABV-G tillater smitte av flere celle types, inkludert 293T. Men siden A / RG genomet er kodet i genomet, spredt blant celler oppstår ved en mye høyere hastighet i TVA-uttrykkende celler.
Når viruset er konsentrert, typisk titere mellom 10 8 FFU / ml og 10 10 FFU / ml. Disse titere er tilstrekkelig for bruk in vivo.
Under LGN injeksjon i mus, trenger vi ikke skille dorsal LGN (dLGN) fra ventral LGN (vLGN), som begge vanligvis blir smittet. Derfor blir flere RGC typer merket (figur 4), inkludert de som prosjektet til vLGN, som melanopsin RGCs (figur 4D) og ON-DSGCs (figur 4E), og de som prosjektet til dLGN, som små- arbor RGCs (Figur 4C) og ON-OFF-DSGCs (figur 4F). Selv om mer enn én type RGC overført viruset til sacs, som rapportert andre steder (Beier et al., I anmeldelsen), her har vi bare fokusererpå godt studert tilkoblinger av on-off-DSGCs til sekker.
Når vi injiserer mus av genotypen cTVA (+) / chat-Cre (-), der ingen TVA skal formuleres, er bare RGCs merket (dvs. figur 4). Disse skyldes innledende opptak av det RABV-G pseudotyped viruset ved RGCs, og ingen spredning oppstår. Ingen RGCs er smittet fra en LGN infeksjon rVSV (A / RG) viruset ikke pseudotyped med RABV-G på grunn av en manglende evne til disse virioner til tverrgående de lange axons av disse RGCs. Imidlertid, ved injisering cTVA (+) / ChATCre (+) (og R26TdT (+)) mus inn i LGN, ikke forekommer viral spredning, bare til røde celler, som uttrykker Cre reporteren (dvs. figur 5). Disse cellene har også co-etikett med anti-Chat antistoff og stratify bare i to chat lamellene, som bekrefter deres identitet som SACS (Tall 5B ', C'). Antallet virally merkede sacs per DSGC varierte 1-9.
Figur 1. Vår retrograd transsynaptic sporing system i forhold til opprinnelig utviklet metoden. (A) (i) I en metode utviklet av Wickersham og kolleger, "starter celler" er transfektert med tre gener: TVA reseptor, som brukes til å tillate infeksjon spesielt av transfekterte celler, den RABV-G, som brukes til å utfylle RABV, som selv hadde G-genet slettet, og en rød fluorescerende protein å identifisere transfekterte celler. (Ii) En RABV pseudotyped med A / RG protein infiserer TVA-uttrykke celler, noe som gjør dem gule. (Iii) Retrograde transsynaptic overføringen skjer til oppstrøms nerveceller. (B) (i) I vår metode er TVA-uttrykke celler definert genetisk, og er merket med en betinget rød fluorescerende protei. (ii) "startpakke celler" er de som blir smittet av en VSV koding av A / RG-genet i viral genomet. Disse starter cellene ikke uttrykke TVA reseptoren. (Iii) Retrograde transsynaptic overføringen skjer til TVA-uttrykker nevroner bare hvis disse cellene gir synaptiske innspill på starteren nerveceller. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Skjematisk av eksperimentelle prosedyre. (A) første, viruset reddet fra cDNA. Det er da passaged og pseudotyped med RABV-G, og konsentrert og titered. Dette viruset er så injisert inn i hjernen, hvor det er tillatt å inkubere i ønsket tidsrom. Etter dettetid, er øyet høstet, og netthinnen dissekert og analysert. (B) Skjematisk av pseudotyping viruset med RABV-G. Dette er nødvendig for infeksjon av retinal ganglion celler fra en hjerne injeksjon. Den RABV-G-genet først transfekteres i vevskultur celler uttrykker TVA reseptoren. Disse cellene blir deretter infisert med rVSV (A / RG) virus. De virioner utgitt får RABV-G i viruskapselen, men vil ikke ha genet for RABV-G i det virale genomet. (C) En skjematisk av musen krysser nødvendig for trippel transgene dyr. Betingede TVA og tdTomato alleler er krysset til en Cre driver av valget, slik at både TVA og tdTomato er uttrykt bare i celler med en Cre uttrykk historie. I dette eksemplet har vi brukt chat-Cre. (D) En skjematisk av retinal infeksjon for å spore DSGC-SAC kretser. The Chat cellene er laget for å uttrykke TVA og tdTomato, som vist i (C). RGCs er smittet fra en LGN isjon av viruset produsert i (B). Som viruset uttrykker GFP, vil disse RGCs være grønn. Viruset vil da spre seg bare til TVA-uttrykke chat amacrine celler hvis de er koblet til den merkede RGC. Disse cellene vil være både rød og grønn eller gul. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Behavior av rVSV (A / RG) virus på 293T og TVA800 celler. Disse cellene ble infisert med en lav titer rVSV (A / RG) pseudotyped med RABV-G. Viruset sprer mellom TVA-uttrykke celler i løpet av noen timer, som vist på 6 timer etter infeksjon (HPI), 1 og 2 dager etter smitte (DPI). Imidlertid er spredningen av 293T celler, som ikke uttrykker TVA reseptoren, skjønt jegt ikke forekomme, skjer mye saktere. Skala bar = 100 mikrometer.
Figur 4. Representative infeksjoner RGCs av ikke-TVA uttrykkende mus. Dyr ble injisert i LGN med rVSV (A / RG) viruset pseudotyped med RABV-G, og vev høstet 2 dpi. (A) sparsom (RGCs indikert av gule pilspisser) eller (B) tette infeksjoner kan oppnås, avhengig av titer av viruset og kvalitet av injeksjon. Mange forskjellige typer RGCs kan identifiseres basert på morfologi, inkludert (C) liten arbor RGCs, (D) type 1 melanopsin RGCs, (E) på-DSGCs, og (F) ON-OFF-DSGCs, blant andre. Skala barer = 50 mikrometer.
Figur 5. RVSV (A / RG) overføring fra on-off-DSGCs til sekker følger den forventede mønsteret. (A) ON-OFF-DSGCs (hvit pilspiss med grønn fyll) overføre virus til flere sekker (gule pilspisser). (A '). Alle grønne celler som ikke er DSGC co-etikett med Cre reporter, som indikerer at de er TVA-uttrykke sekker. (BC) Den DSGC (hvit pilspiss med grønn fyll) og sekker (gule pilspisser) stratify i de aktuelle Chat lag av retinal indre plexiform lag (IPL). Cellene som viruset sender inkluderer både på og utenfor sekker. Tall i paneler B 'og C' angir IPL lameller. Plasseringen av DSGC soma er kun indisert ved pilspissen, men ikke vist i panel C for å fremheve sekker. Skala barer = 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjelp av virus å studere nevrale kretser er en relativt høy gjennomstrømning metode for å analysere tilkoblede nerveceller. Men, genererer både VSV og RABV virioner er ikke trivielt. Selv om protokollen ovenfor for å redde virus fra cDNA er gitt, er det fortsatt en lav sannsynlighet arrangementet. Nivåene av hver av N, P, og L plasmider må finjusteres, og mange forsøk og replikerer må gjøres for å sikre viral redning. Dannelsen av ribonukleotid partikkel omfatter en full VSV genom RNA er en lav-sannsynlighet hendelse, og derfor kan ta flere forsøk. Denne teknikken kan kreve tid for optimalisering, men når det er optimalisert, redde virus er mye enklere.
Analyse av viral smitte fra individuelle RGCs gjøres best når RGC dendrittiske arbors ikke overlapper (dvs. Figur 4A). Mengden av virus injisert og injeksjon koordinater kan justeres for optimal infeksjon. Også, tHan plasseringen av injeksjon vil påvirke antall og typer av RGCs merket (dvs. overlegen colliculus eller superchiasmatic nucleus vil merke forskjellige tall og typer RGCs enn en LGN injeksjon).
VSV har en rekke fordeler i forhold til PRV og RABV. Uttrykket nivået av VSV er veldig rask, blir synlig i løpet av timer 9,15. Dette tillater kortere inkubasjonstider. I dette eksperimentet, ble A / RG glykoprotein kodet innenfor den virale genom, noe som gjør virusreplikasjon-kompetent. Mens du gjør replikering-kompetent rabies virus gjør en BL3 inneslutningsnivå nødvendig for VSV, er det bare BL2. Glykoprotein kunne ha blitt gitt i trans i RGCs, dvs. ved tidligere infeksjon av en AAV koding av A / RG fusion protein. Imidlertid, avhengig denne strategien på dobbel infeksjon, og nivåene av glykoprotein uttrykk kan ikke være optimal. Når uttrykt fra det virale genomet, blir glykoprotein nivåene finstemt som itilfelle av villtype VSV. Uten behov for koinfeksjon alle RGCs merket har potensial for viral transmisjon. Den største ulempen av VSV er dens relativt rask celle toksisitet. Vi har undersøkt VSV-infiserte celler ved fysiologi, og bemerket at de var fysiologisk normal med 18 timers post-infeksjon, men var for syk til å skaffe fysiologiske målinger ved 48 hr post-infeksjon. Vanligvis nevroner ser morfologisk normalt for 2-3 dager etter smitte, men begynner å vise tegn på sykdom (blebbing) kort tid etterpå. Dette er etter den tid som transsynaptic overføring kan observeres (24 timer). Men alle transsynaptic virus, inkludert RABV og PRV, er giftige for cellene. Derfor er VSV foreløpig best brukt for en anatomisk merking verktøyet, selv om vi er i ferd med å gjøre det bedre egnet for fysiologiske manipulasjoner.
VSV er en spesielt kraftig transsynaptic neuronal tracer. Av natur av dens evne til å akseptere forskjellige glycoproteins, kan det spore nevroner i de anterograd eller retrograd retninger 9. Her viser vi at det også kan brukes til å undersøke et annet spørsmål - Hvorvidt en genetisk definerte celletype innganger bort på en startpakke cellepopulasjon. Her har vi demonstrere sin nytte i netthinnen, men vi har også brukt det til å merke genetisk definert interneuronal populasjoner hjernen, med like stor suksess. Det kan også bli modifisert til å inneholde en annen glykoprotein, å tillate transsynaptic anterograd overføring til TVA-uttrykkende celler. Muligheten for ytterligere manipulasjoner blir det mulig å ytterligere å analysere mikrokretser og dekode de komplekse beregninger av nerveforbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne Sean Whelan for å få hjelp med å redde rekombinante VSV varianter, og Didem Goz og Ryan Chrenek for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av HHMI (CLC), og # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Micr–lectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
|
|||
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
