אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

סיכום

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות In vivo פיתוח תסיסנית פטריות הגוף לשעבר vivo מערכת התרבות.

תקציר

אנו מתארים שיטה culturing vivo לשעבר של שלמות המוח תסיסנית. זה יכול לשמש משקל נגד כדי מניפולציות גנטיות כרוניות על חקירת ביולוגיה של התא ופיתוח של מבנים מוחיים מרכזיים בכך שהוא מאפשר התערבויות תרופתיות חריפות הדמיה חיה של תהליכים תאיים. כדוגמה טכניקה, לפני לעבוד במעבדה שלנו ¹ הראה כי תא subcellular מוכרים קודם לכן נמצא בין התאים axonal ו somatodendritic של אקסונים במוח תסיסנית המרכזית. הפיתוח של תא זה, המכונה במגזר האקסון הראשון (AIS) ^2, הוצגה גנטית תלוי קינאז נוירון ספציפי cyclin תלוי, Cdk5. אנחנו מראים כאן כי טיפול vivo לשעבר של wild-type המוח תסיסנית הזחל עם Cdk5 ספציפי מעכבי תרופתי roscovitine ו olomoucine ³ גורמת לשינויים חריפים בארגון אקטין, ובלוקליזציה של חלבונים על פני קרום התא Fasciclin 2, המחקים את השינויים הנראים מוטנטים חסרי Cdk5 פעילות גנטית.

דוגמה 2 של הטכניקה vivo לשעבר התרבות מסופק שיפוץ של קשרים של הגוף פטריות עובריים (MB) נוירונים גמא במהלך המטמורפוזה של הזחל לבוגר. גוף הפטרייה הוא מרכז למידה חוש הריח וזיכרון זבוב ^4, אלה הנוירונים גמא לגזום ענפים axonal ו הדנדריטים שלהם במהלך פיתוח גלמי ואז שוב להאריך סניפים בכל timepoint מאוחר יותר לקבוע את דפוס העצבוב מבוגרים ^5. גיזום של נוירונים אלה של MB הוכח להתרחש באמצעות ניוון המקומי של הענפים neurite ^6, על ידי מנגנון זה מופעלת על ידי ecdysone, הורמונים סטרואידים, הפועל על הקולטן ecdysone B1 ^7, וכי היא תלויה בפעילות של ubiquitin-הפרוטאזום המערכת ^6. השיטה שלנו של culturing vivo לשעבר יכול בדואר רגיל לחקור עוד יותר את המנגנון של שיפוץ התפתחותית. מצאנו כי הגדרת vivo לשעבר התרבות, הנוירונים גמא של MB סיכמו את תהליך גיזום התפתחותית כמובן עם הזמן בדומה in vivo. זה היה חיוני, עם זאת, לחכות עד 1.5 שעות לאחר היווצרות puparium לפני explanting את הרקמה על מנת התאים להתחייב באופן בלתי הפיך על מטמורפוזה, דיסקציה של בעלי חיים עם תחילת pupariation הוביל מטמורפוזה קטנה או לא בתרבות. לכן, עם שינויים מתאימים, גישה לשעבר התרבות vivo ניתן ליישם ללמוד דינמי כמו גם היבטים למצב יציב של הביולוגיה מוח מרכזי.

פרוטוקול

א 'הכנת מדיה

1. הכן התקשורת שלמים על ידי בתוספת פילטר חיטוי תסיסנית שניידר מדיה עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
2. בתקשורת יש להכין טרי בכל פעם. לחלופין, aliquot טרי מראש קפואים התקשורת ניתן להפשיר לפני כל שימוש.
3. לפני culturing, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ecdysone לתקשורת. סמים היו מוכנים כמו מניות מרוכזים ו קפוא aliquots קטנים. Aliquots מופשר לא היו refrozen.

דיון

מניפולציות גנטיות כרוניות של מבנה ותפקוד רקמות, כולל מוטציות וביטוי transgenes, בדרך כלל ליצור שילוב של השפעות מיידיות ותוצאות עקיפות מאוחר זה יכול להיות מאוד קשה להיפרד. משלימים שיטות גנטיות עם פרמקולוגיה יכול להקל על החקירה כמובן זמן מאחורי פנוטיפ. כך, למשל, זה כבר גישה רב עוצמה לנתח את התרומה של מרכיבים שונים במהלך cytoskeletal spermatogenesis ב תסיסנית ^10. בדוגמה הנוכחית, היא אפשרה לנו להראות שיש דרישה עיקשת על Cdk5 לשמור על המבנה של AIS ב תסיסנית.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	ריכוז סופי
שניידר תסיסנית מדיה	Invitrogen	21720-024
בסרום שור עוברית (חום מומת)	Invitrogen	10082-147	10%
פניצילין / סטרפטומיצין	Invitrogen	15140-122	1%
אינסולין	Invitrogen	12585-014	10μg/ml
Ecdysone	Sigma-Aldrich	H5142	2μg/ml
Roscovitine	Sigma-Aldrich	R7772	100μM
Olomoucine	Sigma-Aldrich	O0886	100μM
עיזים רגיל סרום	Invitrogen	50062Z	1%
שור אלבומין בסרום	פישר סיינטיפיק	M9501	1%
פורמלדהיד	Sigma-Aldrich	D4551	4%
טריטון X-100	פישר סיינטיפיק	BP151	0.5%
פוספט שנאגרו מלוחים	Invitrogen	70011-044	1X
Vectashield	וקטור מעבדות	H1000
תרבות Millicell סלולריים הוספת	Millipore	PI8P01250
Multidish, 4 גם	Thermo Scientific	176740
דומון # 5 מלקחיים	מדע כלים עדינים	11251-20
מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק	12-544-7
כיסוי זכוכית	פישר סיינטיפיק	12-548-5M