Summary
इस लेख के प्रशासन का वर्णन
Abstract
यह वीडियो और कैंसर के लिए सेल थेरेपी जीन में बैक्टीरिया का उपयोग पर एक जोर के साथ जीवित चूहों में बैक्टीरिया तस्करी के अध्ययन के लिए पूरे शरीर bioluminesce इमेजिंग (BLI) के उपयोग का वर्णन करता है. बैक्टीरिया को कैंसर के उपचार के लिए एक वेक्टर के आकर्षक वर्ग मौजूद है, एक प्राकृतिक प्रणालीगत प्रशासन के बाद ट्यूमर के भीतर रियायत के तौर पर विकसित करने की क्षमता रखने. जीवाणु लक्स जीन बैक्टीरिया और समवर्ती ट्यूमर साइटों के कैसेट परमिट BLI पता लगाने व्यक्त इंजीनियर. स्थान और समय पर बैक्टीरिया का स्तर ट्यूमर के भीतर आसानी से जांच की जा सकती है, दो या तीन आयामों में visualized. विधि बैक्टीरियल प्रजातियों और ट्यूमर xenograft प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है. इस लेख में चमड़े के नीचे ट्यूमर असर चूहों के भीतर bioluminescent बैक्टीरिया के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. (GIT) BLI पथ में खानेवाला बैक्टीरिया के दृश्य भी वर्णित है. यह शक्तिशाली है, और सस्ते, इमेजिंग वास्तविक समय रणनीति प्रतिनिधिvivo में जीवाणुओं की विशेष रूप से जीन थेरेपी में कैंसर अनुसंधान, और संक्रामक रोग के संदर्भ में अध्ययन के लिए एक आदर्श तरीका टीएस. इस वीडियो लक्स टैग ई. का अध्ययन करने के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा जीवित चूहों में कोलाई, स्थानिक और लौकिक readout प्राप्त का उपयोग BLI IVIS प्रणाली के साथ प्रदर्शन.
Protocol
1. ट्यूमर प्रेरण
- नियमित ट्यूमर शामिल होने के लिए, सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम के 200 μl में निलंबित कोशिकाओं के न्यूनतम tumorigenic खुराक subcutaneously इंजेक्ट किया गया था में संक्रमण की पार्श्व 6-8 सप्ताह पुराने महिला Balb / सी या athymic MF1-nu/nu चूहों (सुप्रीम कोर्ट) n = (Harlan, Oxfordshire, ब्रिटेन) 6 (1 x 6 10 4T1 कोशिकाओं) एक 21 गेज सुई सिरिंज का उपयोग. टीका के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की व्यवहार्यता के रूप में 95% से अधिक था दृश्य गिनती का उपयोग कर एक रुधिरकोशिकामापी और Trypan ब्लू डाई बहिष्करण (Gibco) द्वारा निर्धारित.
- ट्यूमर स्थापना के बाद, ट्यूमर विकसित करने के लिए और विकास की अनुमति दी गई और दो बार साप्ताहिक पर नजर रखी. ट्यूमर मात्रा सूत्र = वी (2 अब) / 6 Π, जहां एक ट्यूमर का सबसे लंबे समय तक व्यास है और ख के सबसे लंबे समय तक व्यास व्यास को सीधा है के अनुसार गणना की गई.
2. बैक्टीरियल तैयारी
- जीवाणु इस protoco में इस्तेमाल तनावएल ई. था कोलाई K-12 MG1655, एक गैर प्रोटीन विष व्यक्त तनाव, एक luxABCDE एन्कोडिंग प्लाज्मिड कि जीवाणुओं द्वारा पता लगाया जा करने के लिए सक्षम बनाता है को शरण देने BLI. ई. MG1655 कोलाई एकीकृत luxABCDE युक्त aerobically 37 में हो गया था ° सी पौंड मध्यम में (सिग्मा Aldrich, आयरलैंड) 300 छ / मिलीलीटर इरिथ्रोमाइसिन (एम) के साथ पूरक. MG1655 के bioluminescent व्युत्पन्न प्लाज्मिड p16S लक्स है जो विधान पी मदद luxABCDE operon 1 का उपयोग कर बनाया गया था.
- चूहों के लिए प्रशासन के लिए तैयार करने के लिए, संस्कृतियों लेग माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन में मध्य लॉग चरण (600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व). जीवाणु centrifugation द्वारा काटा गया (6,000 × 5 मिनट के लिए छ), पीबीएस (सिग्मा) के साथ धोया, और 1 पीबीएस में पतला × 10 7 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) / मिलीलीटर चतुर्थ प्रशासन के लिए, या नलिका - पोषण के लिए 10 x 10 1.
3. बैक्टीरियल प्रशासनtion
- चूहे अनियमित प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया गया जब ट्यूमर मात्रा में लगभग 100 मिमी 3 पर पहुंच गया. नसों में प्रशासन के लिए, 100 μl में स्र्द्ध प्रत्येक चूहों 10 6 कोशिकाओं प्राप्त, पार्श्व पूंछ एक 28G सिरिंज सुई का उपयोग नस में सीधे इंजेक्शन. प्रत्येक inoculum का व्यवहार्य गिनती पूर्वव्यापी चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया गया था.
- GIT उपनिवेश की स्थापना के अध्ययन के लिए, 10 9 बैक्टीरियल कोशिकाओं को मौखिक रूप से नलिका - पोषण द्वारा माउस प्रति 100 μl में लगातार तीन दिनों पर दिलाई. पूर्व मौजूदा खानेवाला बैक्टीरिया स्तर से पहले 7 दिनों के लिए माउस पीने के पानी में 5 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के अलावा मौखिक 1 नलिका - पोषण के प्रारंभ से पहले खिलाने के लिए कम थे.
4. Bioluminescence इमेजिंग
- Vivo BLI इमेजिंग में 2D IVIS100 (कैलिपर) का उपयोग किया गया था. निर्धारित समय अंक पोस्ट बैक्टीरियल प्रशासन, चूहों anesthetized कैलिपर XGI 8 गैस संज्ञाहरण का उपयोग कर रहे थे3% Isofluorane, और पूरे शरीर की छवि विश्लेषण के साथ सिस्टम IVIS प्रणाली 100 में उच्च संवेदनशीलता पर 2-5 मिनट के लिए किया गया था.
- 3 डी इमेजिंग, anesthetized चूहों पृष्ठीय इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली (IVIS स्पेक्ट्रम, कैलिपर) के अंदर एक माउस इमेजिंग शटल में रखा गया. 3 डी ऑप्टिकल पुनर्निर्माण के लिए बैक्टीरिया luciferase संकेत की छवियों को प्राप्त करने के लिए, उत्सर्जन फिल्टर से लेकर 500-580 एनएम तरंगदैर्य बिन 16 फिल्टर प्रति 3-4 मिनट के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत को अधिकतम के अधिग्रहण के समय के साथ इस्तेमाल किया गया. इस छवि अधिग्रहण अनुक्रम के भाग के रूप में, एक संरचित प्रकाश छवि ऊंचाई नक्शे को परिभाषित करने के लिए प्राप्त हुई थी. इस नक्शे इनपुट प्रकाश फैलाना इमेजिंग (DLIT) टोमोग्राफी पुनर्निर्माण एल्गोरिदम कि एक 3 डी ऑप्टिकल छवि के रूप में एक गैर नकारात्मक कम से कम वर्ग 2 अनुकूलन का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- छवि विश्लेषण: हित के क्षेत्र की पहचान की गई और जीवित प्रतिमा और सॉफ्टवेयर (कैलिपर) का उपयोग मात्रा निर्धारित है.
5. प्रतिनिधिपरिणाम
इस अध्ययन में, गैर रोगजनक खानेवाला बैक्टीरिया ई. कोलाई कश्मीर 12-MG1655 luxABCDE operon व्यक्त चतुर्थ सुप्रीम कोर्ट 4T1 xenograft ट्यूमर असर चूहों को दिलाई. बैक्टीरियल लक्स संकेत विशेष रूप से चूहों के ट्यूमर में पाया गया था चतुर्थ प्रशासन पोस्ट (2 चित्रा). जीवाणुओं की संस्कृति नमूना चूहों से वसूली व्यवहार्य बैक्टीरियल नंबर और पता लगाया प्रकाश की मात्रा (3 चित्रा) के बीच एक रैखिक संबंध के अस्तित्व की पुष्टि GIT में मौखिक रूप से प्रशासित खानेवाला बैक्टीरिया के vivo इमेजिंग में भी 3 डी BLI का उपयोग करते हुए हासिल की है.
चित्रा 1. समयरेखा प्रोटोकॉल. चमड़े के नीचे ट्यूमर चूहों में प्रेरित कर रहे हैं, और बैक्टीरिया ट्यूमर के विकास (100 मिमी 3) पर दिलाई. लाइव चूहों BLI imविभिन्न पद समय अंक बैक्टीरियल व्यवस्थापन (तीर ठेठ बार प्रदर्शित करने के लिए) पर वृद्ध.
चित्रा 2. ई. के प्रशासन कोलाई MG1655 ट्यूमर असर चूहों luxABCDE उपचर्म 4T1 ट्यूमर. MF1 / परमाणु परमाणु चूहों और ई. में प्रेरित किया गया कोलाई MG1655 luxABCDE ट्यूमर के विकास पर दिलाई. प्रत्येक जानवर 10 6 कोशिकाओं पार्श्व पूंछ नस में सीधे इंजेक्शन प्राप्त किया. चूहे अध्ययन के दौरान चार बार अंक (काले डॉट्स z-अक्ष और छवियों) (बार ग्राफ) में नमूना का बलिदान चूहों के ट्यूमर से व्यवहार्य बैक्टीरिया के बाद (CFU) वसूली के साथ imaged थे. बैक्टीरियल संख्या और प्लाज्मिड जीन विशेष रूप से ट्यूमर के में समय (प्रतिनिधि माउस समय बिंदु प्रति सचित्र) पर मनाया गया अभिव्यक्ति में बढ़ाएँ. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. Intratumoral बैक्टीरियल और bioluminescence बीच ट्यूमर में व्यवहार्य बैक्टीरिया रिश्ता. पूर्व vivo जीवाणु संस्कृति द्वारा विभिन्न समय अंक के बाद चतुर्थ प्रशासन में BLI के लिए बाद में ट्यूमर से enumerated थे. बैक्टीरियल संख्या के मूल्यों (CFU) vivo bioluminesce इकाइयों में सापेक्ष प्रवेश करें रेखांकन कर रहे हैं. बैक्टीरियल मायने रखता है और बैक्टीरियल bioluminescence संकेतों के बीच एक मजबूत संबंध मनाया जाता है 1 2 आर 0.९,७१७ =.
चित्रा 4. 3D murine जठरांत्र संबंधी मार्ग के IVIS छवि ई. द्वारा colonized MG1655 कोलाई चूहों के GIT 10 ई. के 9 CFU की मौखिक प्रशासन द्वारा colonized था लगातार तीन दिनों के लिए कोलाई. उपनिवेश माउस के 3D टोमोग्राफी से एक नमूना अलग छवि को दिखाया गया है.3 डी छवियों कंकाल की एक डिजिटल माउस एटलस दिखाने के लिए संरचनात्मक पंजीकरण प्रदान ई.. कोलाई MG1655 bioluminescence कम पर हरे रंग में दिखाई है, और बैंगनी उच्च स्तर पर है.
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Discussion
जीन थेरेपी के संदर्भ में, रोगियों को चिकित्सीय जीन की डिलीवरी के लिए जैविक एजेंटों के उपयोग महान 3-5 वादा दिखाया है. वायरस की तरह, जीवाणुओं की जन्मजात जैविक गुणों कोशिकाओं या ऊतकों को कैंसर के संदर्भ में विशेष रूप से कुशल डीएनए वितरण की अनुमति देते हैं. यह दिखाया गया है कि बैक्टीरिया स्वाभाविक रूप से सक्षम हैं ट्यूमर जब प्रणालीबद्ध प्रतिकृति की स्थानीय रूप से उच्च स्तर, या तो बाहरी (गैर इनवेसिव प्रजातियों) में या ट्यूमर कोशिकाओं (रोगज़नक़ों) के भीतर परिणामस्वरूप प्रशासित करने के लिए घर वापस आना. कैंसर विशिष्ट जीवाणु प्रतिकृति शुरू में ठोस ट्यूमर के hypoxic प्रकृति (कम हे 2 स्तर) को जिम्मेदार ठहराया था, anaerobic और facultatively anaerobic बैक्टीरिया की वृद्धि को बढ़ावा देने के ट्यूमर के भीतर hypoxic / परिगलित क्षेत्रों के anaerobic प्रकृति के साथ. हाल ही में, अनियमित, टपका हुआ रक्त की आपूर्ति और ट्यूमर में स्थानीय प्रतिरक्षा दमन के रूप में इस तरह के कारकों एक भूमिका निभाने के लिए प्रस्तावित किया गया है. सबसे preclinical अध्ययन xenogr का उपयोग किया हैपिछाड़ी ट्यूमर मॉडल बैक्टीरियल वेक्टर ट्यूमर उपनिवेश की स्थापना की जांच करने के लिए. अनायास उत्पन्न होने वाले ट्यूमर के murine मॉडल vasculature (ट्यूमर के बैक्टीरिया आबाद में एक संभावित चर) के मामले में और अधिक बारीकी से नैदानिक वास्तविकता के समान है, और बैक्टीरिया को भी इस तरह के मॉडल 6 उपनिवेश स्थापित दिखाया गया है. अलग जीवाणु उपभेदों की क्षमता के लिए परिवहन और prodrug परिवर्तित एंजाइमों, विषाक्त पदार्थों, angiogenesis inhibitors, और 4,7 ट्यूमर के भीतर विशेष रूप से साइटोकिन्स के रूप में जीन एन्कोडिंग कारकों बढ़ाना विभिन्न preclinical और नैदानिक परीक्षणों से पता चला है. जबकि बैक्टीरिया ट्यूमर उपनिवेशवाद बैक्टीरियल तनाव और ट्यूमर छह प्रकार के स्वतंत्र होना दिखाया गया है, एक विशेष मॉडल के लिए इष्टतम तनाव का चुनाव भिन्न हो सकते हैं - जैसे सख्त anaerobes अधिक बड़े परिगलित ट्यूमर के लिए उपयुक्त हो सकता है.
हम उपभेदों के एक नंबर इंजीनियर है luxABCDE कैसेट 1,8-11 व्यक्त. वीडियो में उल्लिखित प्रोटोकॉलएनीमेशन लक्स टैग ई. का उपयोग करता है एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई. कोली मानव GIT की वनस्पति का हिस्सा है. कई अध्ययनों से गैर रोगजनक ई. के चतुर्थ प्रशासन की सुरक्षा को रेखांकित किया है चूहों को कोलाई उपभेदों, और ई. उनके 4,12 ट्यूमर के भीतर विशेष रूप से विकसित करने की क्षमता है. MG1655 कोलाई (के रूप में इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है) को भी उच्च स्तर 13 के लिए माउस GIT colonizes.
छोटे पशु मॉडल में बैक्टीरिया का अध्ययन चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्रों की एक श्रृंखला के लिए उच्च महत्व का है, संक्रामक रोगों, पेट स्वास्थ्य और जीन थेरेपी सहित. उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों बैक्टीरियल संक्रमण पर नज़र रखने के अध्ययन के लिए लागू हो सकता है, biofilm गठन आदि अन्य जीन आधारित रिपोर्टर सिस्टम भी पोजीट्रान उत्सर्जन (पीईटी) स्थलाकृति thymidine kinase के जीवाणु अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में स्कैनिंग (tk सहित जांच की गई है, ), ई. में अंतर्जात अभिव्यक्ति कोलाई या एस typhimurium engineereहरपीज सिंप्लेक्स वायरस (HSVtk) 14 से tk जीन व्यक्त करने के लिए. दोनों फ्लोरोसेंट (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और इसके वेरिएंट) और luminescent (लूक्रस) जीन बैक्टीरिया के लिए उपलब्ध हैं. बैक्टीरियल luciferase का उपयोग करने का एक फायदा यह है कि लक्स कैसेट सब्सट्रेट biosynthesis के लिए आवश्यक एंजाइमों encodes, एक सीधे imagable एजेंट 15 में जिसके परिणामस्वरूप. BLI एक ठंडा के प्रयोग के माध्यम से विषय से bioluminescent प्रकाश का पता लगाने पर आधारित है युग्मित डिवाइस कैमरा (सीसीडी) का आरोप लगाया. अपेक्षाकृत सरल उपकरण और रेडियोधर्मिता के लिए आवश्यकता की कमी औसत प्रयोगशाला की पहुंच के भीतर अच्छी तरह से प्रौद्योगिकी डालता है. BLI कई लाभ प्रदर्शित करता है जब vivo रूपरेखा में अन्य के साथ तुलना. यह प्रयोग करने में आसान, सस्ता, तेजी से और एक साथ कई जानवरों की इमेजिंग की सुविधा, उच्च संवेदनशीलता के साथ छोटी सी पृष्ठभूमि का निर्माण.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए यूरोपीय आयोग के सातवें फ्रेमवर्क (PIOF-GA-2009-२,५५,४६६) कार्यक्रम और आयरिश स्वास्थ्य अनुसंधान बोर्ड (HRA_POR/2010/138) से इस पांडुलिपि के लिए प्रासंगिक समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं ई. लक्स टैग. कोलाई डॉ. Cormac Gahan, यूनिवर्सिटी कॉलेज कॉर्क से एक तरह का उपहार था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
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