Summary
Breve descripción visual de la técnica quirúrgica y el dispositivo utilizado para la entrega de genes (y célula) terapias en la médula espinal. La técnica se muestra en el animal, pero es totalmente trasladable y actualmente se utiliza para la aplicación humana.
Abstract
Esta es una descripción visual compacta de una combinación de la técnica quirúrgica y dispositivo para el suministro de gen (y célula) terapias en la médula espinal. Mientras que la técnica se muestra en el animal, el procedimiento es aprobado por la FDA y se utiliza actualmente para el trasplante de células madre en la médula espinal de pacientes con ELA. Aunque la FDA ha reconocido la prueba de principio de los datos sobre la eficacia terapéutica en modelos de roedores altamente caracterizados, el uso de animales de gran tamaño se considera crítico para la validación de la combinación de un procedimiento quirúrgico, un dispositivo, y la seguridad de una terapia definitiva para el uso humano . El tamaño, la anatomía, y la vulnerabilidad general de la columna vertebral y la médula espinal de los cerdos se reconocen mejor modelo para el humano. Además, el proceso quirúrgico de exponer y de la manipulación de la médula espinal, así como el cierre de la herida en el cerdo es virtualmente indistinguible de la humana. Creemos que el modelo de cerdo sano representa un críticocal primera etapa en el estudio de seguridad de procedimiento.
Protocol
1. Uso Animal
Procedimientos demostrado en este documento han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional de la Universidad Emory y el empleo Comisión (IACUC). Mujer minipigs Göttingen kg de peso aproximadamente 15-20 se utilizan.
2. Anestesia
Los animales se mantienen en ayunas aproximadamente 12 h antes de la cirugía. Animal sedación y la inducción de la anestesia constan de un cóctel de ketamina intramuscular (35 mg / kg), acepromazina (1,1 mg / kg), y atropina (0,04 mg / kg). Los animales son luego intubados y mantenido en oxígeno y 1-3% isoflurano anestesia general. En este punto, la espalda y la cabeza de cada animal se afeita. Profundidad de la anestesia se monitoriza por el personal veterinario. Ausencia de reflejos interdigitales, córnea y los párpados, así como la frecuencia cardíaca y respiratoria, la oximetría de pulso, directa / indirecta la presión arterial, final de la espiración mediciones de dióxido de carbono y el tono muscular / respuesta a los estímulos nocivos se utilizan para controlar la profundidad de la anestesia.
3. Posicionamiento
Los animales son llevados a la sala de operaciones y se coloca en una posición boca abajo sobre un marco personalizado diseñado para imitar la posición pacientes en una tabla espinal Jackson quirúrgico. El marco utiliza eslingas ajustables que se colocan bajo el tórax y la pelvis del animal, permitiendo que el abdomen para colgar libre y, por lo tanto, minimizar la presión sobre el abdomen y el pecho y sangrado consecuente venoso epidural (Figura 1). El marco también proporciona la inmovilización externa de la columna vertebral para el procedimiento 1.
Además, los animales se colocan en una climatizada recirculación almohadilla para mantener la temperatura corporal y una vena marginal de la oreja cateterizó para la administración de fluidos y cualquier suministro de fármaco necesario durante la cirugía. Finalmente, el campo quirúrgico se prepara con alcohol y solución Chlorhexadine o Betadine y paños quirúrgicos se colocan en el campo quirúrgico.
le "> 4. LaminectomíaSe hace una incisión de aproximadamente 10-15 cm de piel se realiza y la musculatura paravertebral se diseca de la columna vertebral bilateralmente. A continuación, un dorsal multi-nivel laminectomía se realiza. Los procesos de lámina y apófisis espinosas de las tres vértebras suprayacente C3-C5 o L2 L4-segmentos se eliminan mediante gubia y un taladro quirúrgico.
5. La colocación de la torre de perforación espinal
Llamamos Derrick Spinal el dispositivo diseñado para la entrega de genes (y célula) terapias en el 2-5 de la médula espinal. Una discusión detallada sobre el diseño y evolución de este dispositivo se puede encontrar en Riley et al., 2011. 4
Para fijar el dispositivo al paciente, mensajes percutáneas se coloca a través de incisiones en la piel de 1 cm por encima y por debajo de la incisión primaria y montado en la lámina por encima y por debajo de la incisión primaria.
A continuación, dos retractores integrados están unidos a la four percutáneas puestos de arriba y por debajo del sitio de la incisión para exponer el área de la columna vertebral que ha sido objeto de laminectomía.
6. Apertura Dural
Con la ayuda de una herramienta dental Woodson y una cuchilla 11, una incisión de 2,5 cm se realiza a través de la duramadre, la exposición de la médula espinal. La duramadre se refleja fuera de la capa pial utilizando sutura Nurolon 4-0 y se asegura a la musculatura paravertebral profunda.
Empanadas quirúrgicos se colocan en los extremos rostral y caudal de la abertura. Estos proporcionan una barrera parcial al flujo de fluido cerebroespinal y también proporcionar un blanco seguro para los cirujanos para colocar ventosas sin dañar el cable. En los seres humanos, bajo un aumento de microscopio quirúrgico, la superficie de la piamadre se diseca en este punto. Debido a limitaciones técnicas, este procedimiento no es necesario o factible en los animales.
7. Inyecciones de la médula espinal y el Desplazamiento lateral de la torre de perforación espinal para inyección adicionals
Inmediatamente antes de las inyecciones, un bolo de metilprednisolona (125 mg, IV) se administra para prevenir la inflamación de la médula espinal.
En este punto, el sistema de barandilla de la plataforma está conectada y las barandas laterales se ajustan para adaptarse a la longitud apropiada. La góndola es top-cargado en las barras 2 y la unidad Z está montado en la junta universal. A continuación, la cánula cargado se coloca en el microdrive. Uso de la junta universal en la plataforma de la microinyección, los ángulos coronal y sagital se ajustan para asegurar una trayectoria ortogonal a la superficie de las inyecciones en la columna seguir la colocación de la cánula. La aguja se posiciona en consecuencia medial a la zona de entrada de la raíz dorsal (DREZ). El DREZ se identifica bajo un aumento de 3,5 X lupa quirúrgica y penetrado en una trayectoria ortogonal a la superficie del cable en un punto <1 mm medial.
En los seres humanos, una resonancia magnética preoperatoria proporciona una línea de base de evaluación of dimensiones de la médula espinal para la planificación operativa. Además, el espesor de la médula espinal se mide para determinar la profundidad del objetivo de la asta ventral.
La suspensión se infunde a una profundidad de 4 mm de contacto pial. Una brida de plástico Ultem sirve de tope en la superficie pia para evitar que la aguja avanza más profunda de lo deseado. Una vez que la punta de la aguja se posiciona en el objetivo, el manguito de metal exterior rígido se tira hacia arriba, dejando expuesto el tubo flexible. Una vez que se termine la inyección, la aguja se deja en su lugar durante 1 min para prevenir el reflujo de células hasta el tracto cánula de inyección.
Hay que tener cuidado para evitar la vasculatura superficie ligeramente el ajuste de la lateralidad o microdrive sea Rostro caudalmente. Un poco de sangrado de los sitios de penetración puede ocurrir. Cuando dicho sangrado es encontrado, empanadas micro se coloca sobre el sitio de punción sangrado y se aplica succión para que absorbe y expulsa la sangre fuera de la cánula Penetración sitio y evitar la acumulación en el cable. Esta forma fiable permite que la sangre se coagule. Cauterio se evita como es la presión directa.
Después de la retirada la aguja, el aparato estereotáxico se trasladó a la zona diana próxima a lo largo del eje rostro-caudal, separadas por 2 o 4 mm o que sean necesarios para evitar los vasos sanguíneos visibles en la superficie dorsal de la médula espinal. Este proceso se repite tantas veces como se propone en un estudio dado.
8. Floating Cánula
Una cánula de infusión personalizada de diámetro pequeño, se utiliza para las inyecciones. La cánula consiste en una aguja biselada 30-calibre de longitud fija conectada a un manómetro 30-tubo flexible silastic de longitud variable. El extremo distal está equipado con un bloqueo luer Hamilton que está conectado a una bomba de microinyector. El tubo de Silastic proximal está envainado dentro de una cánula de calibre 24-exterior rígido que asientos en el extremo proximal de la brida de aguja de inyección. Esta brida de dos asientosla cánula exterior y sirve como un tope de profundidad para la aguja de inyección. Para cada inyección, el volumen apropiado de una suspensión terapéutico se infunde por una. Mediante un pre-calibrada Minj-PD microinyector bomba (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) a una velocidad de 5 l por minuto
9. Cierre
Una vez que todas las inyecciones se han hecho, la torre de perforación espinal se quita suavemente y se cierran las incisiones en cuatro capas. La duramadre se cierra utilizando un 4,0 Nurolon puntada, de una manera estanca. 0 sutura Vicryl se utiliza para la capa muscular profundo. Fascia se cierra con sutura Vicryl 0 también de una manera estanca. La capa dérmica se cerró finalmente con 2,0 Vicryl, con una sutura. El cierre cutáneo se completa con una sutura de nylon 3-0.
10. Recuperación y Manejo del Dolor
Los animales son extubados y monitoreados durante 2 hr recuperación de la anestesia siguiente. A continuación, los animales se transfieren al individuo cedades y controlarse al menos una vez al día para el consumo de alimentos, la defecación, la micción y.
Para el manejo del dolor, un parche transdérmico de fentanilo (75 mcg) está grapado en la parte posterior de los animales durante tres días de la analgesia postoperatoria. Además, buprenorfina (0,05 mg / kg, BID, IM) también se puede administrar por hasta tres días después de la operación.
11. Resultados y resultados representativos
Las observaciones clínicas y el comportamiento se realizan antes de la cirugía y después se graban en los días 1 a 7 y semanalmente hasta parámetro de acuerdo con el diseño del estudio. Datos de conducta se recoge para evaluar la morbilidad neurológica a lo descrito previamente 6. La función sensorial se evaluó mediante la presencia o ausencia de una respuesta de retirada a un estímulo mecánico a los dedos de los pies de las extremidades delanteras y traseras. La función motora sigue la puntuación de Tarlov (Tabla 1): 0 - Parálisis, sin movimiento; 1 - tono perceptible en las extremidades traseras, m leveOVIMIENTO, 2 - Movimiento de las extremidades traseras, pero incapaz de sentarse o estar de pie, 3 - Capacidad para ponerse de pie y caminar, pero atáxica y por períodos cortos; 4 - La recuperación completa, la función motora normal.
Seguridad del procedimiento se determina por la capacidad de un animal para volver a pre-operatorio línea de base. Déficit neurológicos transitorios en su mayoría deben resolver entre el post-operatorio días 1 y 7, con algunas variaciones dependiendo de las razas animales y los procedimientos (número de inyecciones, entre otros parámetros). Morbilidad permanente se define por déficits neurológicos duraderos que no se resuelven por el tiempo que los animales alcanzar el punto final predeterminado IACUC (Figura 2).
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Representative Results
| Puntuación de Tarlov | |
| 0 | Parálisis, sin movimiento |
| 1 | Tono perceptible en las extremidades traseras, movimiento leve |
| 2 | El movimiento de las extremidades posteriores, pero incapaz de sentarse o estar de pie |
| 3 | Capacidad para ponerse de pie y caminar, pero atáxica y por períodos cortos |
| 4 | La recuperación completa, la función motora normal |
Tabla 1. Puntuación Tarlov. Morbilidad neurológica y la recuperación se evalúa al anotar función del animal motor.
Figura 1. Tabla Posicionamiento Procedure. Los animales se colocan en una posición en decúbito prono sobre un marco personalizado diseñado para imitar posicionamiento pacientes en una mesa de Jackson quirúrgico espinal. El marco utiliza eslingas ajustables que se colocan bajo el tórax y la pelvis del animal, permitiendo que el abdomen para colgar libre y, por lo tanto, minimizar la presión sobre el abdomen y el pecho y sangrado consecuente venoso epidural. El marco también proporciona la inmovilización externa de la columna vertebral para el procedimiento.
Figura 2. Evaluación de la función motora y resultados representativos. Animales someterse a un examen general antes de la cirugía neurológica y de forma regular después de la recuperación completa del procedimiento. Marcha y la función motora se evaluó de acuerdo con la puntuación de Tarlov. Esta escala proporciona criterios objetivos para evaluar la capacidad de los animales para deambular como un Surropuerta de medida de la función motora. Seguridad del procedimiento se determina por la capacidad de un animal para volver a pre-operatorio línea de base. Déficit neurológicos transitorios en su mayoría deben resolver entre el post-operatorio días 1 y 7, con algunas variaciones dependiendo de las razas animales y los procedimientos (número de inyecciones, entre otros parámetros). Morbilidad permanente se define por déficit neurológicos duraderos que no se resuelven en el momento en animales alcanzan extremo predeterminado IACUC.
Suplementario
En el caso de terapias de células, antes de la laminectomía y bajo anestesia, la vena yugular 10F catéter crónico (Tecnologías de Acceso, CCPS072106A) se coloca para la administración intravenosa de inmunosupresores para la duración del estudio. El cuello del animal se entalla. La vena yugular interna se expuso quirúrgicamente y se canuló con el catéter, que se asegura con un lazo de seda 3-0. El extremo proximal de la vena yugular interna es eln ligó con una corbata de seda 3-0. A continuación, el catéter se tuneliza de la piel del cuello dorsalmente y se fija con puntos de sutura de nylon 3-0. Por último, la herida se irriga y se cierra con una sutura de nylon marcha 3-0. Tal procedimiento no se requiere en los seres humanos.
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Discussion
A pesar de la aprobación para proceder con la técnica descrita en los seres humanos 7-9, preguntas críticas siguen sin respuesta en orden para las terapias de la médula espinal para tener éxito. Una comprensión rigurosa de la tolerancia de la médula espinal a la inyección intraparenquimatosa es necesaria para permitir la planificación y ejecución de los ensayos de desarrollo de terapias para desmielinizante y degenerativa y enfermedad traumática de la médula espinal. Actualmente, no hay un entendimiento claro del número de inyecciones que la gran médula espinal de mamífero pueden tolerar sin morbilidad transitoria y permanente. Del mismo modo, el espaciamiento de las inyecciones puede afectar la morbilidad. Además, macroscópicas (por ejemplo, ventilación relacionada con el movimiento del paciente o involuntaria) y microscópico (es decir, la oscilación con la ventilación y el pulso cardíaco) movimientos de la médula espinal presentar riesgos para la médula espinal durante la inyección. Una comprensión del umbral para la morbilidad en un modelo animal grande ayudarácalcular la dosificación de todos los programas de terapia de la médula espinal. Nuestra traducción trasplante de médula espinal laboratorio está disponible para ayudar a los programas preclínicos de desarrollo de todos los equipos en la actualidad el diseño de los ensayos para la aplicación de la médula espinal.
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Disclosures
Dr. Boulis es el inventor de dispositivos para permitir la inyección segura y precisa de la médula espinal humana. Neuralstem, Inc. ha adquirido una licencia exclusiva de esta tecnología. Dr. Boulis recibido una cuota de inventarios de esta tarifa, y tiene los derechos de pago de regalías para la distribución de esta tecnología. Otros autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a la Dirección de la Universidad Emory de Animal personal de Recursos para la atención veterinaria. Las fuentes de financiamiento incluyen: ALS Association, Departamento de Defensa, y Neuralstem Inc.,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
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- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
