Xenopus huevo extracto es un sistema modelo útil para investigar el punto de control de daño en el DNA. Este protocolo es para la preparación de extractos de huevo de Xenopus y reactivos de punto de control de daño de ADN que inducen. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN en el estudio de la señalización de punto de control de daño de ADN.
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Artículo de método
Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando
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Resumen
Resumen
Sobre una base diaria, las células se someten a una variedad de lesiones endógenas y ambientales. Para combatir estas agresiones, las células han evolucionado checkpoint daño en el DNA de señalización como un mecanismo de vigilancia para detectar daños en el ADN y dirigir la respuesta celular al daño del ADN. Hay varios grupos de proteínas llamadas sensores, transductores y efectores implicados en la señalización de punto de control de daños en el ADN (Figura 1). En esta vía de señalización complejo, ATR (ATM y Rad3 relacionada-) es una de las principales quinasas que pueden responder al daño del ADN y la replicación del estrés. ATR activados pueden fosforilar sus sustratos tales como aguas abajo (quinasa Chk1 Checkpoint 1). En consecuencia, fosforila y activa Chk1 conduce a muchos efectos aguas abajo en el punto de control de daño del ADN incluyendo la detención del ciclo celular, activación de la transcripción, reparación de daños en el ADN, y la apoptosis o senescencia (Figura 1). Cuando el ADN está dañado, no activa los resultados de punto de control de daño del ADN en UNREPdaños al aire y, posteriormente, la inestabilidad genómica. El estudio del puesto de control el daño del ADN aclarará cómo las células mantener la integridad genómica y proporcionar un mejor entendimiento de cómo las enfermedades humanas, tales como el cáncer, desarrollar.
Xenopus laevis extractos de huevo se están convirtiendo en un poderoso sistema libre de células modelo de extracto en la investigación puesto de control de daños en el ADN. Baja velocidad extracto (LSE) fue descrito inicialmente por el grupo Masui 1. La adición de cromatina de los espermatozoides demembranated a los resultados de LSE en la formación de núcleos cuando el ADN se replica de manera semiconservativa una vez por ciclo celular.
El puesto de control vía de señalización ATR/Chk1-mediated es desencadenada por el estrés o daño en el ADN de replicación 2. Dos métodos se utilizan actualmente para inducir el punto de control de daño en el ADN: los enfoques que dañan el ADN y el ADN que imitan las estructuras de daños-3. Daño del ADN puede ser inducida por la radiación ultravioleta (UV), γ-irradiación, metilo metanonaesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS es un agente alquilante que inhibe la replicación del ADN y activa el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiación UV también provoca el daño del ADN 8 ATR/Chk1-dependent puesto de control. El daño en el ADN que imita la estructura AT70 es un complejo de recocido de dos oligonucleótidos poli-(dA) 70 y poli-70 (dT). El sistema AT70 fue desarrollado en el laboratorio Bill Dunphy y es ampliamente utilizada para inducir ATR/Chk1 señalización de punto de control 9-12.
Aquí, se describen protocolos (1) para preparar extractos libres de células de huevo (LSE), (2) para el tratamiento de la cromatina de esperma de Xenopus con dos ADN diferentes enfoques dañar (MMS y UV), (3) para preparar el ADN daños que imita la estructura AT70, y (4) para activar el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated en LSE con cromatina de esperma dañado o una estructura que imita a daño en el DNA.
Protocolo
1. Preparación LSE
- Ranas hembra (Xenopus laevis) se inyecta dos veces para la recolección de huevos. La primera inyección (cebado) es 100 U PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) por rana. Las ranas se debe purgar por lo menos dos días antes de la inducción de huevo y por el que se ranas cebados son utilizables para un máximo de dos semanas. Para las ranas primos, inyectar PMSG por vía subcutánea en los sacos linfáticos dorsales usando una jeringa de 3 ml y aguja 27 G.
- Para inducir la puesta de huevos, inyectar 500 U hCG (gonadotropina coriónica humana) por vía subcutánea rana preparado en los sacos linfáticos dorsales usando una a....
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Discusión
Hay varias ventajas en el estudio del punto de control de daño en el DNA utilizando extractos de Xenopus huevo. El uso de extractos de huevo proporciona una gran cantidad de extractos libres de células sincronizadas en la interfase del ciclo celular. Los extractos de huevo puede ser realizado fácilmente y económicamente. Es relativamente fácil de dañar el ADN o cromatina y para revelar un defecto en el punto de control de daño de ADN después de immunodepleting una proteína diana a partir de extracto de huevo. P.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo está apoyado en parte por fondos proporcionados por la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte, Wachovia fondo base para la excelencia docente, y una subvención de NIGMS (R15GM101571).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Anti-P-S344 Chk1 anticuerpos | Señalización Celular | 2348L | |
| Chk1 anticuerpos anti- | Santa Cruz | SC7898 | |
| La aprotinina | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| La cicloheximida | Sigma | C7698-5G | |
| Citocalasina B | EMD | 250233 | |
| Ditiotreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-cisteína | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptina | VWR | 97063-922 | |
| Metanosulfonato de metilo (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazol | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Muestra de tampón | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals EE.UU. | 209-12041 | |
| Equipo | |||
| Cuchara para la puesta de huevos | Rubbermaid Commercial Products | 6308 | |
| CL2 IEC centrífuga con rotor basculante | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 rotor basculante | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 más centrifugadora supervelocidad | Thermo Scientific | 46910 | |
| Reticulador UV | UVP | 95-0174-01 | |
| Soluciones | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM de HEPES, ajustar el pH a 7,8 con 10 M NaOH | ||
| La aprotinina / Leupeptina acciones | 10 mg / ml cada una en agua. Almacenar 20 alícuotas a -80 ° C. | ||
| Buffer X | 0,2 M de sacarosa, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, ajustar el pH a 7,5 con HCl | ||
| La cicloheximida acciones | 10 mg / ml en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. | ||
| Citocalasina B de stock | 5 mg / ml en DMSO. Almacenar 20 alícuotas a -20 ° C. | ||
| Ditiotreitol (DTT) acciones | 1 M en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. | ||
| ELB | 0,25 M sacarosa, 1 mM DTT, 50 ug / ml de cicloheximida, 2,5 mM de MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7 | ||
| Nocodazol acciones | 10 mg / ml en DMSO. Guarde 5 alícuotas a -80 ° C. | ||
| Mezcla de Energía | 375 mM de fosfato de creatina, 50 mM de ATP, y 25 mM de MgCl 2. Las alícuotas se guardan a -80 ° C. | ||
| Solución de tinte nuclear | 0,4 g / ml Hoechst 33258, glicerol 25%(V / v), en 1x PBS | ||
| Tautomycin acciones | 100 mM en DMSO. Almacenar 10 alícuotas a -80 ° C. |
Referencias
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Re....
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Reimpresiones y permisos
