Summary
Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.
Abstract
Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die Rezeptor-zwischen der Plasmamembran (PM) und intrazellulären Kompartimenten erfordert einen experimentellen Ansatz mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus muss ein solcher Ansatz haben auch die Fähigkeit an Rezeptoren auf der PM von denen in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert unterscheiden. Am wichtigsten ist, Erfassen Rezeptoren in einem Vesikel erfordert herausragende Nachweisempfindlichkeit, da jedes Vesikel trägt nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren. Standard-Ansätze zur Untersuchung Rezeptortransport gehören Oberfläche Biotinylierung durch biochemische Detektion, die sowohl die erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung fehlt folgt; und Fluoreszenzmikroskopie Prüfung immunmarkierten Oberflächenrezeptoren, die chemische Fixierung von Zellen erfordert und daher keine ausreichende zeitliche Auflösung 1-6. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir und andere entwickelt und eingesetzt eine neue strategischetegie, dass ermöglicht die Visualisierung des dynamischen Einfügen von Rezeptoren in der PM mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung 7-17. Der Ansatz enthält Tagging von einem pH-sensitiven GFP, das superecliptic pHluorin 18, an den N-terminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors. Superecliptic pHluorin hat die einzigartige Eigenschaft, Fluoreszenz bei neutralem pH-Wert und nicht fluoreszierenden bei saurem pH (pH <6,0). Daher sind die markierten Rezeptoren nicht fluoreszierenden wenn sie innerhalb des Lumens des sauren intrazellulären Transport Vesikel oder endosomalen Kompartimenten, und sie werden nur leicht sichtbar, wenn an den extrazellulären neutralen pH-Umgebung ausgesetzt ist, an der äußeren Oberfläche der Uhr. Unsere Strategie konsequent ermöglicht es uns, PM Oberflächenrezeptoren von denen in intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden. Um eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösungen, sowie die Empfindlichkeit erforderlich, um dynamische Menschenhandel von Rezeptoren zu untersuchen erreichen, beschäftigten wir insgesamt internen reflektierenion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die uns um die optimale räumliche Auflösung der optischen Bildgebung (~ 170 nm) zu erreichen aktivieren, um die zeitliche Auflösung der Video-Rate-Mikroskopie (30 Bilder / sec), und die Empfindlichkeit zu erfassen Fluoreszenz eines einzelnen GFP Molekül. Durch die Abbildung pHluorin-markierten Rezeptoren unter TIRFM konnten wir direkt visualisieren einzelnen Rezeptor-Insertionen in die PM in kultivierten Neuronen waren. Dieser Ansatz kann potentiell Bildgebung einem Membranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die mit superecliptic pHluorin markiert werden könnte angewendet werden, und wird Dissektion der wichtigsten Mechanismen, die detaillierte Insertion verschiedener Membranproteine (Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter, etc.) zu ermöglichen die Uhr.
Protocol
Ein. Vorbereiten Maus Glia Kultur für neuronale Kultur Conditioning
- T75-Flaschen sind mit Kollagenlösung (1:3 Verdünnung Purecol in ddH 2 O) beschichtet. Die Kolben werden aufgerichtet und über Nacht trocknen gelassen in einer Gewebekultur Kapuze.
- Dissektion Puffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM Dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, ohne Calcium) und Glia (DMEM mit 10% FBS, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 ergänzt ug / ml Streptomycin und Glutamax) hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Am Tag der Glia Kultur, ist die Glia Medien für mindestens 30 min in einem 37 ° C Wasserbad Dissektion Mäusehirnen erwärmt. Embryonalen oder neugeborenen Mäusen durch schnelle Enthauptung getötet. Cerebral Cortexbereiche werden unter einem Dissektionsmikroskop seziert.
- Seziert Hirngewebe in Papain-Lösung (100 ml Papain und 20 ul 1% DNase I in 2 ml Puffer Dissektion) bei 37 ° C verdaut for 20 min.
- Nach Papainverdau werden Hirngewebe mit 10 ml vorgewärmten Glia Medien gespült. Frisches Glia Medien (2 ml) wird dann zu den verdauten Hirngewebe zugegeben und die Gewebe mit einer feuer-poliertes Glas Pasteurpipette verrieben.
- Frische Medien Glia (8 ml) wird zu der dissoziierten Geweben aufgenommen. Eine Zelle 70 um-Sieb verwendet wird, um die dissoziierte Gewebesuspension filtern. Die Zellen werden dann in T75-Flaschen (in der Regel 2-3 Embryonen kann Saatgut ein T75-Kolben) ausgesät und in eine 37 ° C Zellkulturbrutschrank.
- Am nächsten Tag wird die Medien von den T75-Flaschen abgesaugt. Die Kolben werden mit 10 ml PBS gespült. Frische Medien Glia (10-15 ml) wird dann zu jedem Kolben zugegeben.
- Innerhalb von 10-12 Tagen sollte Glia in den T75-Flaschen werden konfluent. Glia-Zellen werden mit PBS gespült, und mit 5 ml 0,05% Trypsin zu jedem T75 Kolben zugegeben.
- Nach Trypsin Inkubation bei 37 ° C für 5 min, Gliazellen dissoziiert und Gliazellen voneinander T75 Kolbeninhalt zweigeteiltverschiedene Kollagen-beschichteten T75-Flaschen.
- Kultur Einsätze (Millipore PICM03050) sind, indem sie in 6-Well-Platten, Beschichten mit Kollagen und lufttrocknenden über Nacht hergestellt. Glia Medien (je 2 ml) unterhalb jeder Kultur Einlage platziert.
- Glia von konfluenten T75-Flaschen mit Trypsin behandelt und auf die Kultur beimpft Einsätze (ein T75-Flasche pro 6-Well-Platte, 2 ml jeder Einsatz). Diese Gliazellen Kultur Einsätze werden zur Konditionierung der neuronalen Kulturen werden.
2. Neuronale Kultur
- Die Deckgläschen für neuronale Kultur durch Einweichen in 70% HNO 3 mindestens über Nacht gereinigt. Deckgläser werden dann mit ddH 2 O mindestens 3-mal gewaschen und getrocknet, in einem Isotemp Ofen (> 200 ° C) über Nacht.
- Gereinigt Deckgläschen in einer 6-Well-Platte, ein Deckglas pro Well platziert. Deckgläser mit Poly-L-Lysin-Lösung (2 ml, 0,1% in 100 mM Borsäure, pH = 8,5) über Nacht in einem 37 ° C Inkubator beschichtet.
- DiePoly-L-Lysin-Lösung wird von den Deckgläsern entfernt und Deckgläser werden 3 mal mit autoklaviertem ddH 2 O gewaschen Deckgläser werden dann in einem 37 ° C Inkubator über Nacht in Plattierungsmedien (Neurobasal mit 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 pg / ml Streptomycin, Glutamax ergänzt; 2% B27 Supplement wird dem Plattierungsmedium zugegeben am Tag sie verwendet wird).
- Am folgenden Tag wurden die Plattierungsmedien wird entfernt und 2 ml frisches Plattierungsmedien mit B-27 in jede Vertiefung, die ein Deckglas aufweist zugegeben.
- Trächtigen Mäusen (E15-18) werden mit CO 2 euthanasiert und embryonalen Mäuse werden durch Dekapitation getötet. Der Hippocampus oder Striatum wird aus dem Hirngewebe seziert und in ein 15 ml konischen Röhrchen mit eiskaltem Dissektion Puffer, Kultur Neuronen im Hippocampus oder Striatum medium spiny Neuronen sind.
- Seziert Hirngewebe dissoziiert werden mit Papain, wie in den Schritten 1.4) und 1.5) beschrieben.
- Fach Dissoziation, wird die Anzahl der Zellen in jedem neuronalen Suspension mit einem Hämozytometer gezählt. Neuronen werden dann auf jeder Deckplättchens in einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well Platte ausgesät und kultiviert in einem 37 ° C Inkubator über Nacht (Neuronen sind DIV 0).
- Um Glia Kultur fügt zur Konditionierung der neuronalen Kulturen herzustellen, wird die Glia Medien aus den Glia Kultur Einsätze entfernt und frisches Plattierungsmedium zugegeben (2 ml in dem Einsatz und 2 ml unterhalb der Einlage).
- Am nächsten Tag (DIV 1) werden die Deckgläser mit Neuronen unter den Gliazellen Kultur Einsätze, ein Deckglas in jedem gut platziert.
- Neuronen werden mit dem halben Volumen von frischem vorgewärmten Fütterung Medien (mit B-27) alle 3-4 Tage lang gefüttert, bis sie bereit für die Transfektion und Imaging Experimente sind.
3. Transfektion
- Neuronal Transfektion erfolgt mit Lipofectamin 2000. Für jede neuronale Kultur (ein Kultur pro Deckglas), 2 ulLipofectamin 2000 und 1 ug DNA verwendet werden. Frische Neurobasalmedium ohne Aufpreis wird verwendet, um Lipofectamin und DNA verdünnen.
- DNA und Lipofectamin werden für 20 min bei Raumtemperatur nach Durchmischung inkubiert.
- Sparen Sie 1 ml der Medien von unterhalb jeder Glia Kultur Einsatz und 1 ml aus dem Inneren jedes Einsatzes, und übertragen Sie die Medien zu einer konischen Rohr. Fügen Sie das gleiche Volumen der Fütterung media + B27 auf die gespeicherte Medium und Inkubation bei 37 ° C. Dieses Medium wird für die neuronale Kultur nach Transfektion verwendet.
- Nach der 20-min Lipofectamin / DNA Inkubation werden Glia Kultur fügt momentan von den 6-well Platten entfernt. Die 200 ul Lipofectamin / DNA-Gemisch wird jedem Deckglas mit Neuronen aufgenommen. Die Kultur Glia Einsätze werden dann zu jeder Vertiefung zurückgegeben, oberhalb der Neuronen. Erzeugung von Blasen unter der Membran der Kultur fügt sollte vermieden werden. Neuronen sind mit der Lipofectamin / DNA-Gemisch bei 37 ° C für 2-4 Stunden inkubiert.
- Nach the 2-4 h Inkubationszeit werden Glia Inserts wieder entfernt. Die Kulturmedien mit dem Lipofectamin / DNA-Gemisch wird aus jedem Well entfernt. Die Medien in Schritt 3.3) gespeichert wird, um Neuronen (2 ml pro Vertiefung) zugegeben. Glia Kultur Einsätze werden in jede Vertiefung zurückgeführt und die Medien von Glia jedes Einsatzes entfernt wird, und 2 ml des Mediums aus Stufe 3.3) wird in jeden Einsatz zugegeben.
- Neuronen sind für eine zusätzliche 24-72 Stunden damit Ausdruck der transfizierten cDNA vor TIRF Bildgebung auf diese Neuronen durchgeführt wird kultiviert.
4. TIRF Imaging
- Künstliche Liquor (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM Glucose, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wird für Live-Imaging-Experimente verwendet werden. Unsere TIRF Imaging-System ist speziell Set-up mit einem 100-mW Cyan Laser zur Anregung und eine Electron Multipliziert Charge Coupled Device (EMCCD) Kamera für einen Detektor.
- Vor der Bebilderung Experimenten wird die aCSF in einem 37 gewarnt & dzB, C Wasserbad für mindestens 30 min. Heizeinsatz für Echtzeit-Bildgebung auf dem Mikroskoptisch platziert und der Heizeinsatz, Laser und Kamera werden für mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebungsexperimenten erwärmt.
- Ein Deckglas mit transfizierten Neuronen in der Live-imaging Kammer montiert. Die vorgewärmte aCSF ist in der Kammer angeordnet, nachdem die Kammer montiert ist; dieser Schritt sollte so schnell wie möglich durchzuführen.
- Sobald die Kammer auf der Heizeinsatz auf dem Mikroskoptisch platziert wird, werden visuell unter transfizierten Neuronen epi-fluoreszierenden Bildgebungsmodus identifiziert.
- Nach gesunde transfizierten Neuronen identifiziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2), wir führen typischerweise 1 min von Foto-bleach zu dem bereits bestehenden pHluorin Fluoreszenz auf der Plasmamembran zu beseitigen, wie pHluorin-Rezeptoren auf der Plasmamembran sehr hohe Fluoreszenz Ebenen wann haben TIRF Bildgebung ersten Mal gestartet wird, stört das mit Visualisierung einzelner insertion Veranstaltungen.
- Nach Photobleichmittel wird die Verstärkungseinstellung des Elektronen-Vervielfacher auf dem EMCCD Kamera auf Maximum gesetzt, und die Aufzeichnung wird für 1 min bei 10 Hz durchgeführt.
- Jede Aufnahme enthält 600 Bilder. Individuelle Einsetzen Ereignisse werden durch die Wiedergabe der Aufnahme wieder mit ImageJ identifiziert. Individuelle Insertionen analysiert manuell mit ImageJ.
5. Repräsentative Ergebnisse
Konsequente neuronalen Kultur ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Live-Imaging-Experimente. Abbildung 1 zeigt mit der Maus Hippocampusneuronen kultiviert mit unserem Protokoll von DIV 11 bis 18 Div. Es ist klar, aus den Bildern, dass die Neuronen haben umfangreiche Prozesse entwickelt und dass die dendritischen Prozesse dicht mit dendritischen Dornen, Anzeichen dafür, dass diese Neuronen gesund Kultur sind abgedeckt. Unsere Kultur Protokoll könnte auch für andere Arten von Neuronen im Gehirn verwendet werden. Zum Beispiel haben wir vor kurzem verwendet dieses Protokoll zu Kulturstriatalen medium spiny Neuronen in einer Studie zu Dopamin D2-Rezeptor (DRD2) Insertion in kultivierten Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums 9 zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt mit der Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums kultiviert mit unserem Protokoll bei DIV 8. Wir haben auch erfolgreich TIRF Bildgebung superecliptic pHluorin-tagged DRD2s in dieser Art von Neuron ausgeführt. Abbildung 3 zeigt die Expression von pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) in einem Medium spiny Neurons und Visualisierung der pH-DRD2 Insertion in diesem Neuron.
Abbildung 1. Maus Hippocampus Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. DIV: Tag in vitro, dem Tag der Kultur wird als DIV 0 betrachtet. Aus den Bildern, ist es offensichtlich, dass Hippocampusneuronen reife bei dieser Art der Kultur zwischen 11 und DIV DIV 15. Bei DIV 11 und 13, werden neuronalen Dendriten mit filipodia und unreif Stacheln bedeckt. Bei DIV 15 und18 werden neuronalen Dendriten mit großen Stacheln bedeckt, einen Hinweis auf reifer Neuronen. Linke Panels: niedrigste Vergrößerungsbildern der Maus Hippocampusneuronen in verschiedenen Altersstufen. Rechts-Panels: hoher Vergrößerung Bilder (Zoom auf neuronalen Dendriten der linken Seite) der neuronalen dendritischen Prozesse mit dendritischen Dornen in verschiedenen Altersstufen.
Abbildung 2. Maus striatalen medium spiny neuron Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. Neuronen in den Bildern sind DIV 8.
Abbildung 3. Eine Maus striatalen medium spiny neuron mit super Ekliptik pHluorin-markierten Dopamin-D2-Rezeptor (pH-DRD2) transfiziert. Bild auf der linken Seite ist Maximum Intensity Projection einer Zeitraffer-Aufnahme (600 Bilder, 100 ms pro Bild). Weiß Pfeilspitzen zeigen einzelne vesikulären Einfügen von pH-DRD2. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen in der xy Dimension verliert aber die Zeitinformation. Bild auf der rechten Seite zeigt yt Maximum Intensity Projection, bei dem die xyt Stapels um 90 Grad um die y-Achse ist, und die maximale Pixel auf jeder x-Achsen-Linie ist auf ein einzelnes y-Achsen-Pixels projiziert. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen entlang der yt Achse, sondern verliert die x-Achse Informationen.
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Discussion
Aus unbekannten Gründen sind Mäuseneuronen immer schwieriger, Kultur als Rattenneuronen. Nach unserer Erfahrung funktioniert eine Mischkultur aus Neuronen und Gliazellen auch für die primäre kultivierten Maus Neuronen. Allerdings ist eine solche Mischkultur nicht geeignet für TIRF Imaging-Experimente, wie sie in dieser Art von Kultur Neuronen und ihre Prozesse auf der Oberseite des Glia-Zellen wachsen, Situierung der neuronalen Zellkörper und dendritischen Prozesse außerhalb der Reichweite der TIRF-Mikroskopie neigen. Deshalb ist ein geringerer Dichte neuronalen Kultur mit wenigen Glia auf dem Deckglas ideal für TIRF Bildgebung. Zunächst testeten wir die Banker Verfahren 19, 20, in denen der Boden einer Kulturschale mit Glia ausgesät wird und Neuronen auf einem Deckglas ausgesät und kopfüber in der Kulturschale gelegt. Das Deckglas und der Glia Schicht werden durch drei kleine Tropfen Wachs auf dem Deckglas getrennt. Diese Methode eignet sich gut für kleinere Größe Deckgläser (z. B. 15-mm-oder 18-mm-Deckgläschen), aber wenn wir testeten die Verwendung von 25-mm coverslips waren Neuronen in der Nähe der Mitte der Deckgläser nicht gesund wie diejenigen in der Nähe der Ränder Deckglas.
Während die Ursache für diesen Unterschied in Neuron Gesundheit war uns nicht klar, begründeten wir, dass es sein kann aufgrund der begrenzten Diffusion von Nährstoffen in die Mitte des Deckglases Bereich. Deshalb gedreht an die Schnittstelle Kulturverfahren in diesem Manuskript beschrieben ist, wie die Membran aus dem Kulturmedium Einsatzes erlaubt die freie Diffusion von Nährstoffen zu den Neuronen auf Deckgläsern. Wir seeded Neuronen auf 25-mm Deckgläser mit den Neuronen nach oben. Wir ausgesät Glia auf einer Kultur einfügen, und legte die Glia Feeder Insertion auf dem Deckglas. Wir haben festgestellt, dass die Schnittstelle Kultur-Methode besser als andere Methoden, die wir getestet, wenn mit 25-mm-Deckgläschen für Low-Density-Maus neuronalen Kultur haben, und liefert konsistente Ergebnisse für TIRF Bildgebung. Um die Eigenschaften des Rezeptors Insertion (Frequenz, Amplitude), eine Kontrollgruppe mit Neuronen transfiziert w quantifizierenith Wildtyp pHluorin-markierten Rezeptoren sollten immer einbezogen werden. Diese Kontrollgruppe dient auch als eine Qualitätsüberprüfung für neuronale Kultur.
Unsere TIRFM System basiert auf einer manuellen Zeiss AxioObserver Mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) ausgebildet ist. Die Anregung Laser ist ein Newport 488nm-100mW Cyan Laser System (Newport Corporation, Irvine, CA). Der Laser ist mit einem Zeiss TIRF Schieber über eine KineFLEX-P-2-S-488-640-0.7-FCP-P2 Lichtleitfaser (Point Source, Mitchell Point, Hamble, UK) gekoppelt ist. A Z488RDC dichroitischen Spiegel (Chroma Technology Corporation, Bellows Falls, VT) wurde verwendet, um den ankommenden Laser auf einem Zeiss-α-Plan 100x Objektiv (NA = 1,46, Carl Zeiss) zu reflektieren. Ein ET525/50 Emissionsfilter (Chroma Technology Corporation) wurde für GFP-Fluoreszenz-Detektion. Ein Evolve EMCCD Kamera (Photometrics, Tucson, AZ) als Detektor verwendet. A 2.5X Relais-Linse wurde zwischen dem Mikroskop-Kamera-Anschluss und dem Nocken eingesetztZeit, um eine optimale räumliche Auflösung zu erreichen (0,064 um pro Pixel bei Verwendung des 100X NA = 1,46 Ziel). Die Kamera wurde bei -80 ° C während der Bildgebung Experimenten erhalten. A Uniblitz LS6 Verschlusszeit von einer VMM-D3-Controller (Vincent Associates, Rochester, NY) gesteuert wurde zwischen Laserkopf und Ballaststoffe Launcher integriert. Daten wurden unter Verwendung μManager Software ( http://www.micro manager.org / ).
Alle Imaging Experimente wurden bei 37 ° C in aCSF Lösung enthaltend 2 mM CaCl 2 durchgeführt. Diese aCSF Lösung wird auf pH = 7,4 bei Raumtemperatur eingestellt wird. Beim Erwärmen auf 37 ° C wird der pH-Wert dieser aCSF wird 7,2, die optimal für Neuronen in Kultur ist. Während der Akquisition wird Laserleistung auf Maximum eingestellt, sowohl für Foto-Bleichmittel und zur Datenerfassung. Belichtung bei 100 ms eingestellt und Akquisition betrug 10 Bildern pro Sekunde (10 Hz). EMCCD Gewinn wurde ein Satzt Maximum. Aufnahmen wurden mit ImageJ Software (Rasband, WS, NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012), und Einsetzen Ereignisse registriert und analysiert manuell. Insgesamt Ereignisse pro Minute pro Flächeneinheit wurden als die Frequenz der Insertion entnommen und mit der Kontrollgruppe als 100% normalisiert. Yt gerenderten Bilder wurden in ImageJ durch Drehen der ursprünglichen xyt Stapel 90 ° entlang der y-Achse erzeugt wird, und die maximale Intensität jeder Linie x wurde auf ein einzelnes Pixel der y-Achse mit der maximalen Intensität Projektionsalgorithmus in ImageJ projiziert.
9; Insertion Ereignisse werden in der Regel als das plötzliche Auftauchen von fluoreszierenden punta (schnell ansteigende Phase), gefolgt von einer abklingenden Phase, die Rezeptor-Diffusion auf der Plasmamembran 7 stellt folgten beobachtet. Das Aussehen von fluoreszierenden punta mit einer langsam steigenden Phase oder solche ohne eine scheinbare Decay-Phase (plötzlicher disappearance) werden aus der Datenanalyse ausgeschlossen, da diese Ereignisse wahrscheinlich Trafficking von intrazellulären Vesikeln, die ein weniger saures Lumen (wie jene vom endoplasmatischen Retikulum) haben repräsentieren. Photobleichmittels von bereits vorhandenen Oberflächen-Rezeptor Bevölkerung minimiert auch den Beitrag der bereits vorhandenen Oberflächen-Rezeptor-Clustering auf der Plasmamembran. Bisher sind alle unsere Daten manuell mit ImageJ analysiert. Zukünftigen Entwicklung von Computer-Algorithmen für den automatischen Eventerkennung und Datenanalyse wird zur Erleichterung der Anpassung und Anwendung dieser bildgebenden Verfahren zur Untersuchung von Rezeptor-Insertion zur Plasmamembran wichtig.
Um einzelne vesikulären Insertionsereignisse von pHluorin-markierten Rezeptoren visualisieren, müssen mehrere wichtige Parameter berücksichtigt werden. Zuerst muss die Laseranregung stark genug sein, um Detektion von Fluoreszenz von einzelnen Vesikeln aktivieren. In unserem speziell angefertigten System, verwendeten wir eine 10 0-mW 488-nm-Laser als unsere Anregungsquelle. Zweitens muss der Detektor des Abbildungssystems, um sowohl die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit, um Daten von Echtzeit dynamisch Rezeptor Insertion erwerben. Aus diesen Gründen verwenden wir ein EMCCD in unserem System. Die Kombination aus einer starken Anregung Laser und einem EMCCD-Detektor bietet Einzel-GFP-Molekül Detektionsvermögen in unserer Imaging-System. Unsere Wahl eines speziell entworfenen TIRF-System ist darauf ausgerichtet, die maximale Leistung aus begrenzten Ressourcen. Es ist erwähnenswert, dass alle handelsüblichen TIRF System mit ausreichender Laseranregung Leistung (einen 100-mW 488-nm-Laser reicht für unsere Zwecke ist, und lässt sich problemlos über die meisten kommerziellen Plattformen) und eine Kamera EMCCD sollte auch für solche geeigneten bildgebenden Studien. Daher ist die Anpassung solcher Bildgebung für Neuronen nicht durch Leistung des TIRFM System beschränkt, sondern durch die Qualität des neuronalen Kultur und Konsistenz der neuronalen Kulturen.
ove_content "> Drittens aufgrund der anfängliche Fluoreszenz von bestehenden pHluorin-tagged Plasmamembran-Rezeptoren, Photobleichmittel unter TIRF Betriebszustand in der Regel notwendig, für den Nachweis von Fluoreszenz, die von einem einzelnen Vesikels. Wir normal funktionieren 1-Minuten-Photobleichmittels mit der TIRF Bildgebungsmodus bei maximaler Laserleistung einmal ein Neuron optisch erkannt wird, führt das in der Eliminierung der Mehrheit der bereits bestehenden Oberfläche pHluorin Fluoreszenz. Es ist auch wichtig zu beachten, dass hohe Laseranregung Leistung erhöht auch die Möglichkeit der Laser-Schaden und Phototoxizität. In unserer Erfahrung , mit einer um 100 mW 488 mW-Laser als die Anregungsquelle nicht erscheint zu merklichen Schädigung von Neuronen innerhalb des Datenerfassungsperiode einzuführen, während eine ausreichende Laserleistung zum Visualisieren Rezeptoren in einzelnen Vesikeln. Eine weitere wichtige Überlegung ist, dass Unterschiede in der Art und Anzahl der Rezeptoren in jedem Vesikel beeinflussen auch die Laseranregung Anforderung.Zum Beispiel haben wir zuvor konnten Regulierung der Glutamatrezeptor-Untereinheit GluA1 Insertion zur Plasmamembran mit Hilfe eines 50-mW Anregungslaser 7 prüfen. Wir schätzen, dass jedes Vesikel in dieser Studie untersuchten 56 ± 6 GluA1 Moleküle, ähnlich der Schätzung von einer anderen Gruppe mit ähnlichen Methoden hergestellt 12 enthalten. In unserer aktuellen Studie der DRD2 schätzten wir, dass jedes Vesikel 30 ± 1-Moleküle enthalten, und ein 100-mW-Laser war ausreichend für diese Studie. Jedoch wegen des hohen Pegel der Hintergrundgeräusche in lebenden Zellen, Prüfung einer Vesikel, die nur mehrere Rezeptormoleküle (z. B. 5-10) manchmal eine Laserleistung höher als 100 mW erforderlich, um ein ausreichendes Signal-zu-Erreichung Rauschverhältnis zur Visualisierung von Rezeptor Insertion zur Plasmamembran in Neuronen. Die richtige Balance von Empfindlichkeit und Erregung Macht ist für die Planung einer erfolgreichen Studie wichtig.Der Einsatz von bis i TIRFMmage superecliptic pHluorin-markierten Rezeptoren hat, mehrere unterschiedliche Typen von neuronalen Rezeptoren 7-17 angewandt. Allerdings ist es sehr wichtig, im Auge zu behalten, dass unsere aktuellen Verfahren auf Tagging-Rezeptoren beruht mit einem GFP-Molekül und Überexpression von markierten Rezeptoren. Anbringen eines GFP-Molekül an die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins kann mit dem Protein, das die Funktion stören und es ist daher wichtig, sicherzustellen, dass es keine Markierungsstrategie signifikant mit der Funktion des Proteins ab 9 eingreifen. Darüber hinaus kann ein überexprimierten Rezeptor oder nicht, unterliegen den regulatorischen Mechanismen, die den Handel mit endogenen Rezeptoren regieren. Unabhängige Methoden sind daher notwendig, um Ergebnisse aus bildgebenden überexprimierten pHluorin-markierten Rezeptoren erhalten validieren. Zum Beispiel, in unseren Untersuchungen an GluA1 Einsetzen 7, Oberflächen-Expression und synaptische Handel mit endogenen GluA1 Rezeptoren wurden validiert usingen Standard Immunfärbung / biochemischen Methoden oder elektrophysiologische Ansätze. Zusammengefasst unsere Imaging Ansatz, in Kombination mit anderen Standard-Methoden für Membranprotein Trafficking, dürfte maßgeblich Sezieren detaillierten molekularen und zellulären Mechanismen, die Plasmamembran Insertion anderer Membranproteine in Neuronen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von The Jackson Laboratory unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
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