Passaging Hues humane embryonale stamcelle-linjer med Trypsin

Summary

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Abstract

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin. Humane embryonale stamceller er gjenstander av cellekultur, og har en tendens til å erverve karyotypic unormalt med høy befolkningstetthet doblinger. Riktig passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn, udifferensiert, karyotypically normal Hues menneskelige embryonale stamceller kultur. Først blir en ekspanderende kultur vasket i PBS for å fjerne rester av media og celleavfall, da cellene er kledde med en minimal mengde varme 0,05% Trypsin-EDTA. Trypsin er igjen på cellene for opp til fem minutter, da cellene er forsiktig forskyves med en 2ml serologisk pipette. Cellesuspensjonen samles og blandes med et stort volum av fargetoner media, blir deretter cellene samles ved forsiktig sentrifugering. Den inaktiverte trypsin media blanding fjernes, og cellene resuspendert i forvarmet fargetoner media. En passende Delingsforholdet beregnes (vanligvis 01:10-01:20), og celler re-belagt på en 1-2 dagers gammelplate som inneholder en monolayer av bestrålte mus embryonale fibroblast mater celler. Den nylig sådd Hues kultur plate er igjen urørt i 48 timer, så media blir endret hver dag etterpå. Det er viktig å ikke trpsinize ned til en enkelt celle suspensjon, da dette øker risikoen for å innføre karyotypic misdannelser.

Protocol

Generelt

Vi anbefaler tining ikke mer enn én prøve på et gitt tidspunkt for å sikre enkel håndtering. Behandleren bør vokte seg for å forlate kulturer ved romtemperatur og lave CO2 i lange perioder av gangen. Alle sentrifugering av levende celler er gjort på 500-600 xg i 5 min ved romtemperatur.

MEFs (Mus Embryonale Feeder Cells)

1. Pre-varme MEF media til 37 ° C. Fjern MEF hetteglass fra -80 ° C og umiddelbart senk den nederste halvdelen av røret i en 37 ° C vannbad. Det tar cirka 30-45 sekunder før cellene er 80% tint (liten frossen del igjen).
2. Raskt bringe slangen til laminær panseret, spraye ned med 70% alkohol, og overføre celler til forvarmet media.
3. Aspirer gelatin løsningen fra platene forberedt tidligere.
4. Delmengde 2 ml av MEF løsning i en dråpe klok måte i hver av de seks brønnene. Pass på å fordele MEFs jevnt om brønnen. Datoen MEFplate, og plasser i en 37 ° C inkubator natten for å tillate MEFs å feste på plate.
5. Etter 6 timer MEFs vil bli festet til plate. Det er best å bruke MEF plater 24-48 timer etter plating. IKKE bruk en MEF plate som er over fire dager gammel.
6. Pre-varme fargetoner media og 0,05% Trypsin / EDTA til 37 ° C Under panseret, prelabel en steril 50 ml konisk rør.
7. Nøye aspirer nyansene media fra kultur til deles. Vask forsiktig brønnene med 2 ml 1X fosfatbufret løsning (PBS) per brønn. Aspirer PBS. Legg 0,75 ml 0,05% Trypsin / EDTA til brønnen.
8. Sett lokket, og observere celler under 4x forstørrelse. Den MEFs rundt fargetoner koloniene skulle begynne å trekke. Når MEFs er tilstrekkelig avrundet og grensene for nyansene koloniene er grovt, returnere platen til panseret. Denne prosessen tar ca 5 min, absolutt INGEN lenger enn 10 minutter eller dine celler vil ikke re-vokse.
9. Forsiktig Pipetter opp og ned, vask bunnen av the vel, inntil MEF monolayer er helt løsrevet (monolayer er klissete og kan forbli i ett stykke).
10. Overfør cellesuspensjon til en 50 ml konisk rør som inneholder flere fargetoner media. Spinn røret av celler 500xg i 5 minutter, Aspirer av media, være forsiktig for ikke å forstyrre cellepelleten.
11. Slik plate på en ny plate av MEFs, legger hensiktsmessig å fastsette volum av celler til flere fargetoner media, og pipetter løsningen 5-7 ganger med en automatisert pipette.
12. Fjern MEF media fra en fersk plate av MEFs.
13. Delmengde nyansene løsningen dråpe lurt til hver brønn, og pass på å fordele synker jevnt om brønnen. Uten risting platen, forsiktig tilbake cellene til en 37 ° C inkubator natten for å la Hues kolonier frø.
14. Fargetoner celler som kommer ut av en splittet bør oppføre seg på samme måte som de som kommer ut av en tin.

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan vi rutinemessig passasje fargetoner humane embryonale stamcellelinjer i vårt laboratorium. Effektiv og regelmessig splitting og passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn humane embryonale stamceller linje. Trypsin mediert passasje er en betydelig fordel av fargetoner cellelinjer, er det imidlertid viktig å ikke over trypsinize kulturer eller å ha en stor andel av enkeltceller under re-platting.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml