I detta dokument beskriver vi en användbar metod för att studera ligand-gated funktion jonkanal i nervceller i akut isolerade hjärnsnitt. Denna metod innefattar användning av en drog-fyllda mikropipett för lokal applicering av läkemedel till neuroner som spelats in med standardtekniker patch clamp.
Tobaksbruk leder till många hälsoproblem, inklusive cancer, hjärtsjukdomar, emfysem och stroke. Beroende av cigarettrökning är en utbredd neuropsykiatrisk störning som härrör från de biofysiska och cellulära åtgärder nikotin på nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) hela det centrala nervsystemet. Förstå olika nAChR subtyper som finns i områden i hjärnan som är relevanta för nikotinberoende är en viktig prioritering.
Experiment som använder elektrofysiologi tekniker såsom hela celler patch clamp eller två-elektrodspänningen inspelningar klämma är användbara för farmakologisk karakteristik av nAChR av intresse. Celler som uttrycker nAChR, såsom däggdjursceller vävnadsodlingskolvar eller Xenopus laevis oocyter, är fysiskt isolerade och är därför lätt studeras med hjälp av verktygen i modern farmakologi. Stora framsteg har gjorts med användning av dessa tekniker, särskilt när målreceptorn var redan känt ennd ektopisk uttryck lätt att uppnå. Ofta är det dock nödvändigt att studera nAChR i sin naturliga miljö: i nervceller i hjärnan skivor akut skördas från laboratorium möss eller råttor. Till exempel möss som uttrycker "överkänsliga" nAChR subenheter såsom α4 L9'A möss 1 och α6 L9'S möss 2, möjliggöra entydig identifikation av neuroner baserat på deras funktionella uttryck av en specifik nAChR subenhet. Även hel-cell patch clamp inspelningar från nervceller i hjärnan skivor rutinmässigt görs av skickliga electrophysiologist, är det svårt att lokalt tillämpa läkemedel såsom acetylkolin eller nikotin till det inspelade cell inom en hjärna skiva. Utspädning av läkemedel i superfusate (bad ansökan) är inte snabbt reversibla, och U-rör-system är inte lätt anpassas för att arbeta med hjärnsnitt.
I detta dokument beskriver vi en metod för att snabbt applicera nAChR-aktiverande läkemedel till nervceller som spelats in i vuxen mOuse hjärnsnitt. Standard helcells-inspelningar görs från neuroner i skivor, och en andra mikropipett fylld med ett läkemedel av intresse manövreras i läge nära den inspelade cellen. En injektion av trycksatt luft eller inert kväve i läkemedels-fyllda pipett orsakar en liten mängd läkemedel lösning som skall sprutas ut från pipetten på det inspelade cellen. Med denna metod, nAChR-medierade strömmar kan lösas med millisekund noggrannhet. Drug Application gånger kan lätt varieras, och läkemedlet fyllda pipett kan dras tillbaka och ersättas med en ny pipett, vilket möjliggör koncentration-respons-kurvor skapas för en enda neuron. Även beskrivet i samband med nAChR neurobiologi, bör denna teknik vara användbar för att studera många typer av ligandstyrda jonkanaler eller receptorer i neuroner från hjärnsnitt.
Metoden som presenteras i detta dokument är i stort sett användbar för att studera ligand-gated funktion jonkanal i beredningar hjärnan slice. Det finns emellertid ett antal faktorer som väsentligt påverkar kvaliteten och reproducerbarheten av experimentella data som resulterar från användning av denna metod. Till exempel, framkallade strömmar är mycket känsliga för diametern av spetsen av läkemedlet fyllda pipett. Små tips kommer att orsaka problem med att mata ut läkemedelslösningen och stora tips med …
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag DA030396. Tack vare medlemmarna i Drenan labbet för hjälp diskussion och kritik av manuskriptet. Särskilt tack till Mi Ran Kim för tekniskt bistånd och Jonathan Thomas Ting för råd om vuxna skivor mushjärna.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
KCl | Sigma | P3911 |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
HEPES | Sigma | H3375 |
glucose | Sigma | G5767 |
Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
thiourea | Sigma | T8656 |
Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
NaCl | Sigma | S9625 |
Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
potassium gluconate | Sigma | G4500 |
EGTA | Sigma | E3889 |
Mg-ATP | Sigma | A9187 |
GTP | Sigma | G8877 |
DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
RC-27 Recording chamber | Warner | |
TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
Nikon FN-1 | Nikon | |
C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
Picospritzer III | General Valve Co. | |
MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |