Summary
Ein Verfahren, um das Lösungsmittel Zugänglichkeit der Thiolgruppe von Cystein-Resten der Analyse
Abstract
Imitieren und Nutzung Virus Eigenschaften und physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften verspricht, um Lösungen für einige der weltweit dringlichsten Herausforderungen. Die schiere Reichweite und Arten von Viren mit ihren faszinierenden Eigenschaften gekoppelt potenziell geben unendlich viele Möglichkeiten für Anwendungen in der Virus-basierten Technologien. Viren haben die Fähigkeit, zu Teilchen mit diskreten Form und Größe, Spezifität Symmetriegründen polyvalence und stabile Eigenschaften in einem weiten Bereich von Temperatur und pH-Bedingungen selbst zusammen. Es überrascht nicht, mit einer solchen Reihe von bemerkenswerten Eigenschaften, werden Viren zur Verwendung in Biomaterialien 9, Impfstoffen 14, 15, elektronische Materialien, chemische Werkzeuge und molekularen elektronischen Behälter 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12 vorgeschlagen.
Um Viren in der Nanotechnologie zu verwenden, müssen sie aus ihren natürlichen Formen modifiziert werden, um neue Funktionen zu verleihen. Diese anspruchsvolle prozess kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich genetischer Modifikation des viralen Genoms und chemisch Anbringen fremden oder gewünschten Moleküle an die Viruspartikel reaktiven Gruppen 8 durchgeführt werden. Die Fähigkeit, einen Virus zu modifizieren vorwiegend abhängig von den physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften des Virus. Darüber hinaus müssen die genetische oder physiochemischen Modifikationen ohne Beeinträchtigung der nativen Struktur Virus und Virus-Funktion ausgeführt werden. Maize rayado fino Virus (MRFV) Hüllproteinen in Escherichia coli Herstellung stabiler und leere VLPs, die durch Protein-Protein stabilisiert sind selbstorganisieren Interaktionen und die in Virus-basierten Technologien Anwendungen 8 verwendet werden. VLPs in Tabakpflanzen hergestellt wurden als ein Gerüst, auf dem eine Vielzahl von Peptiden kovalent angezeigt werden 13 untersucht. Hier beschreiben wir die Schritte 1) bestimmen, welche der Lösungsmittel-zugänglichen Cysteine in einem Virus-Kapsid sind für ModifikationenKation, und 2) Bioconjugate Peptide an den modifizierten Kapside. Durch die Verwendung von nativem oder durch Mutation eingefügten Aminosäurereste und Standardkoppelstellen Technologien haben eine breite Vielfalt von Materialien auf der Oberfläche von Pflanzenviren wie Brome Mosaic Virus 3, Carnation-Mottle-Virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tabak Mosaik angezeigt worden Virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 und MRFV 13.
Protocol
Ein. Virus Impfung und VLPs Reinigung aus Nicotiana benthamiana Pflanzen
- Produzieren verkappt T7-RNA-Transkripte von Kartoffelvirus X (PVX)-basierten Vektorplasmide tragenden MRFV Wildtyp (wt) und Cys-mutierte Hüllprotein (CP) Gene 12, unter Verwendung Ambions T7-mMessage mMachine Kit.
- Für jeden T7-Transkript Reaktion inokulieren zwei voll ausgebaut Blätter von N. benthamiana mit 10 ul Reaktionen und bebrüten die Pflanzen für 10 Tage im Gewächshaus bei 60% Luftfeuchtigkeit für 16 Stunden mit Licht (25.000-30.000 lux) bei 25 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana virus-infizierten Blättern 10 Tage nach der Inokulation (dpi), wiegen das Pflanzengewebe (50 Gramm) und auf Eis stellen.
- Homogenisieren das Pflanzenmaterial in einem Mixer in Gegenwart von 100 ml einer gekühlten Lösung von 0,5 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 (Einsatz 2 ml Puffer pro Gramm Pflanzengewebe).
- Filtern Homogenat bis 3 Schichten cheeseclOTH und Klärung durch Zentrifugieren bei 27.000 × g für 30 min. Den Überstand in ein gekühltes Messzylinder, messen die Lautstärke, und dann übertragen auf eine gekühlte sterile Becher. Entsorgen Sie die Pellets.
- Verfahren Überstände durch Zugabe von 10% Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000), Rühren für 15 min bei 4 ° C und Inkubation für weitere 45 min bei 4 ° C zur Ausfällung der Virus-ähnliche Partikel (VLP)-PEG-Matrix.
- Zentrifugieren der Probe bei 27.000 × g für 20 min bei 4 ° C und Entfernen des Überstandes.
- Verarbeiten das Pellet durch Zugabe von 8 ml von 0,05 M Na-Citrat, pH 5,5 mit 2% Triton X-100. Schwenken Sie die Röhrchen auch zum Lösen der Pellets. Übertragen Sie die Pellet-und Puffer, um ein gekühltes sterile Becher. Spülen Sie die Röhrchen sofort mit 2 ml des gleichen Puffers und fügen Sie den Becher. Man rührt die Suspension bei 4 ° C, bis die Pellets gelöst werden (im allgemeinen 1 Std.).
- Klärung durch Zentrifugation für 5 min bei 27.000 × g, verwerfen des Pellets und prozess der Überstand durch Zentrifugation bei 140.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C.
- Resuspendieren des Pellets in 1 ml 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 und platzieren der Suspension auf einem 10-40% Saccharosegradienten in 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 hergestellt.
- Zentrifuge die Steigung für 3 Stunden bei 140.000 xg bei 4 ° C.
- Ein Licht über die Oberseite des Zentrifugenrohres und sammelt das Licht streuenden obere Bande bei 4 cm von dem oberen Ende des Rohres, verdünnt mit 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5, und Zentrifugieren für 3 Stunden bei 140.000 × g bei 4 ° C.
- Das Pellet in 0,5 ml sterilem Wasser und bei 4 ° C für bis zu sechs Monate.
- Quantifizierung der VLPs Konzentration durch Ausführen eines Bradford-Protein-Assay. Die Ausbeute an VLPs zwischen 1 und 3 g / g von Pflanzengewebe.
2. Fluorescein-5-Maleimid-Kennzeichnung Reaktionen von VLPs
- Eine 1 mM-Lösung von Fluorescein-5-maleimid (427,37 g / mol) in 50 mM Natrium-PhosphatE-Puffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mix mit den Wirbel, und überprüfen Sie die vollständige Auflösung. Schützen Sie das Rohr aus Licht mit Aluminiumfolie.
- Fügen Fluorescein-5-Maleimid zu VLPs in Schritt 1 und Mix produziert. Verwenden eines 25-fachen molaren Überschuss von Fluorescein-5-maleimid für Molmenge Sulfhydryle. Generell mit 30 ul VLPs in einer Konzentration von 1 ug / ul und 60 ul des Fluorescein-5-Maleimid Lösung erzeugt akzeptable Ergebnisse.
- Inkubieren der Reaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Abbruch der Reaktion durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 50 mM.
- Entfernen nicht umgesetzten Fluorescein unter Verwendung einer Entsalzung Spinsäule (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) und Zentrifugation für 2 min bei 1500 xg bei Raumtemperatur.
- Für SDS-PAGE-Analyse, mit 10 ul 2 x Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer auf 10 ul jeder Reaktion. Bewahren Sie das markierte Protein von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu einem Monat oderin Einzel-Aliquots bei -20 ° C bis zu 3 Monaten.
3. Markierungsreaktion und Bestimmung von Biotin Incorporation
- Verwenden Entsalzen Spinsäulen (Thermo Scientific Inc., Rockford IL), einen Puffer Austausch von Wasser zu Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,0 der VLPs in Schritt 1 erzeugten durchzuführen.
- Bereiten Sie eine 20 mM Stammlösung von Maleimid-PEG2-Biotin durch Zugabe von 190 ul PBS im No-Weigh Maleimid-PEG2-Biotin und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren.
- Fügen Maleimid-PEG2-Biotin an die VLPs und mischen. Verwenden eines 10-fachen molaren Überschuss an Reagenz zur VLP-Lösungen ≤ 2 mg / ml.
- Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 4 Stunden.
- Entfernen nicht umgesetzten Maleimidbasis PEG2-Biotin unter Verwendung eines Spin-Säule entsalzt (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) und Zentrifugation für 2 min bei 1500 xg bei Raumtemperatur.
- Bestimmen Sie die Mol Biotin pro Mol VLPs mit dem Pierce Biotin Quantifizierung Kit (Thermo Scientific) und following Anweisungen des Herstellers.
4. Vernetzen von Cys 2-VLPs und F Peptid
- VLPs, welche im verfügbaren Cysteinreste zum Vernetzen in Schritt 2 (Cys 2-VLPs) geführt sind in der folgenden Stufe eingesetzt. Bereiten Sie eine neue Vernetzung Stammlösung (28,63 mM) durch Auflösen von 10 mg NHS-PEG4-Maleimid Vernetzer in 680 ul Dimethylsulfoxid.
- Man löst eine 17 (F)-Aminosäuren langes Peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 ul Konjugationspuffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) in einer Konzentration von 0,1 mM.
- Add 4 ul Quervernetzer bis 50 ul des gelösten Peptid (Protein-NH2) bei 1 mM Endkonzentration (das ist ein 10-facher molarer Überschuß für 0,1 mM Peptidlösung).
- Inkubieren der Reaktion für 2 h bei 4 ° C.
- Läutern vernetzten Peptid unter Verwendung einer Entsalzungssäule (Thermo Scientific Inc., Rockford IL), äquilibriert mit Konjugationspuffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) durch Zentrifugation bei 1.500 xg1 min bei Raumtemperatur.
- Einrichten einer Reaktionsmischung kombiniert VLPs (Protein-SH) und vernetztes Peptid (Protein-NH2) in einem molaren Verhältnis der Anzahl von Thiolen und Aminen aktiviertes in der Reaktion und die Differenz im Molekulargewicht zwischen VLPs und Peptid beteiligt bestimmt.
- Inkubieren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 h bei 4 ° C.
- Für die Western-Blot-Analyse, mischen Sie die resultierende konjugierte Produkt 1:1 mit Laemmli-Puffer, kochen für 10 min, und fahren Sie mit SDS-PAGE auf einem pre-cast 10-20% Tris-Glycin-Gel (Invitrogen), gefolgt von Elektroblotten auf eine Nitrocellulosemembran (Invitrogen). Blockieren der Membranen mit 1 x PBS, pH 7,2, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) und 5% Magermilchpulver und Sonde mit Peptid-spezifischen Antikörper, die in geeigneten Phosphatase-markierten sekundären Antikörper folgt.
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Representative Results
Transiente Expression von mutierten MRFV Hüllproteins (CP) Gene in N. benthamiana Pflanzen in einem PVX-basierten Vektor Herstellung VLPs ist in Abbildung 1 beschrieben. Das modifizierte MRFV Hüllproteingen wird durch PCR amplifiziert und dann platziert unter der transkriptionellen Kontrolle des duplizierten subgenomische CP-Promotor in einem PVX-basierten Vektor, pP2C2S 2, (ein Geschenk von D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, England). Im vitro RNA-Transkription produziert RNA-Transkripte, die dann verwendet werden, um N. impfen benthamiana Pflanzen. In den infizierten Pflanzen (2A) MRFV-CP Untereinheiten bilden VLPs (2B), die leicht gereinigt werden. Anschließend werden die VLPs an Peptide vernetzt.
Ein Beispiel für reaktive Aminosäuren der MRFV Hüllprotein ist in Abbildung 3 dargestellt. Jede Aminosäure ausgewählt werden verwendet, um Reste befestigen, wenn sie exponiert ist. Die chemical Techniken umfassen traditionelle Biokonjugation Strategien wie die Acylierung der Aminogruppe von Lysin, Alkylierung des sulfhydrilic Gruppe von Cystein, und Aktivierung der Carbonsäurereste und Kupplung mit Aminen zugesetzt. Darüber hinaus können die aromatischen Gruppen von Tyrosin und Tryptophan attraktive Ziele für Biokonjugation durch Diazotierung und Alkylierung sein.
Die Lösungsmittelzugänglichkeit von Cys-Resten von VLPs zu Thiol-spezifische Reagenzien ist in Abbildung 4 dargestellt. Gereinigtes Gew.-VLPs (Bahn 4) und Cys-Mutanten, die VLPs Cysteinreste in Position 107 bis 111 (Spur 1) und 192 bis 194 (Bahn 3) des CP-Gen 12 in nativen Bedingungen nicht reaktiv mit Thiol-spezifische Reagenz (Fehlen der Fluoreszenz). Fluorescein-5-maleimid verleiht orangen Fluoreszenzfarbe nur für die Cys-Mutante, die VLPs Cysteinreste in Position 125 bis 129 des CP-Gen (Spur 2). Das Ergebnis zeigt, dass VLPs in Spur 2 eine geometrische arran habengement von Cysteinen Rückstände im Lösungsmittel ausgesetzten freien Thiolgruppen, während die Cysteinreste in den Proben in den Spuren 1 und 3 vielleicht in Disulfidbrücken bei der Faltung des Hüllproteins beteiligt sind.
Markierungsreaktionen mit Maleimid-PEG2-Biotin gefolgt von einer Biotinylierung Test stellen ein weiteres Beispiel der Analyse des Lösungsmittels Zugänglichkeit der Cys-Reste. Weil Biotin ist ein relativ kleines Molekül, kann es in mehreren Kopien auf dem konjugierten VLPs, die jeweils einem Molekül Avidin zu binden, wie in 5 gezeigt. Das Niveau der Biotinylierung, zeigt 84,74 Mol Biotin pro Mol Protein 13, die Anzahl der Biotin-Moleküle, die an die VLPs und folglich die Anzahl von Liganden, die an der äußeren Oberfläche dargestellt werden kann. Aufgrund der Verfügbarkeit von mehreren Thiolgruppen an den VLPs können Peptide durch Vernetzungsreaktionen mit NHS-PEG4-maleimid befestigt werden. Dieses Reagenz ist ein er tero-bifunktionellen Vernetzer reaktiven Enden, wie N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester und Maleinimid-Gruppen enthält, so dass eine kovalente Konjugation von Amin-und Sulfhydrylgruppen enthaltenden Molekülen. Wie in 6A gezeigt, reagiert der NHS-Ester mit primären Aminen bildet Amidbindungen, während Maleimid reagiert mit Sulfhydrylgruppen Bildung stabiler Thioetherbindungen. Vernetzungsreaktionen produzieren VLPs-Peptid-Komplexe, die immunreaktiv mit den Antikörpern in Western-Blot wie in 6B gezeigt sind.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von VLPs in Pflanzen durch VLPs Aufreinigung und nachfolgenden Vernetzung von Peptiden an.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Symptome durch T7-Transkripte Inokulation auf N. produziert benthamiana Pflanzen (A) und Transmissionselektronenmikroskopie der produzierten VLPs (B).
Abbildung 3. Ein Protein-Struktur-Vorhersage von Wildtyp-(wt)-MRFV-CP zeigt reaktive Cystein-Aminosäuren (durch Pfeile angedeutet).
Abbildung 4. SDS-PAGE-Analyse von gereinigten VLPs konjugiert DurchleuchtungCEIN-5-Maleimid. (A) einfach blau sicheren Fleck wurde verwendet, um Proteine zu färben. (B) Fluorescein-5-Maleimid-Erkennung durch Fotografieren unter UV-Beleuchtung. M: Prestained breiten Proteinmarker (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys gereinigten VLPs, 2: 2-Cys gereinigten VLPs, 3: 3-Cys gereinigten VLPs, 4: gereinigte Gew. VLPs. (Cys 1-VLPs, Cys 2-VLPs und Cys 3-Cys-VLPs sind MRFV-VLPs Mutanten 13).
Abbildung 5. AT = 3 Bändermodell isometrische VLPs zeigt den sulfhydrylreaktiven Chemie für (A) und Biotin-Markierung (B) Fluorescein-5-maleimid Etikettierung.
Abbildung 6. Schematische Darstellung Protein-Vernetzung zwischen den Cys 2-VLPs und F-Peptid (A) und Westernblot (B) der Cys-VLPs-F sondiert mit spezifischen Antikörpern gegen F Peptid. M: Prestained breite Palette Protein-Marker (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLPs-F in Schritt 4 erzeugte Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine sehr empfindliche und schnelle Analyse von reaktiven Cysteine auf der Oberfläche der Pflanzen produzierte VLPs sowie auf anderen Proteinkomplexen. Maleimide sind Thiol-spezifische Reagenzien, die mit freien Sulfhydryl enthaltenden Molekülen reagieren, um eine stabile Thioether-Bindungen zu bilden. Diese Methode stützt sich auf die Spezifität der Maleimide mit Sulfhydrylgruppen nicht in Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren beteiligt reagieren. Die Erhaltung der nativen Struktur der VLPs ist sehr wichtig, durch den gesamten Prozess. In der Anmeldung beschrieben, werden die Umsetzungen im nativen Bedingungen und bei pH 7 durchgeführt werden, um die native Struktur der VLPs aufrechtzuerhalten. Bei neutralem pH, haben Maleimide optimale Reaktivität mit freien Sulfhydrylgruppen. Dies erlaubt eine Markierung der VLPs mit entweder Fluorescein oder Biotin an Cystein zugänglich Modifikationen.
Milden pH-Wert (6,5-7,5) und Pufferbedingungen sind auch im vernetzenden eingesetztenReaktionen. Die Anzahl der funktionellen Gruppen an den VLPs bestimmt die geeignete Verhältnis zwischen Vernetzer und VLPs. Niedrigere Vernetzer um Protein-Verhältnissen kann in Fällen, wo es viele funktionelle Gruppen verwendet werden. Umgekehrt wird eine höhere Vernetzer zu Protein Verhältnis mit weniger verfügbaren funktionellen Gruppen eingesetzt.
Ein Array von Faktoren einschließlich Raum Arm, Spaltbarkeit, chemische Zusammensetzung, Dimension und Löslichkeit bestimmen letztlich die Auswahl der Vernetzer eingesetzt. Außerdem ist die Wahl des Vernetzers benutzt auch eine Funktion der Größe der zwei Proteine (hier VLPs und Peptid) in der Konjugation beteiligt. Heterobifunktionellen Vernetzer sind ideal für Protein-Peptid-oder Protein-Protein-Vernetzung. Sie ermöglichen mehr kontrolliert zweistufige Reaktionen, die die unerwünschten Selbst-Konjugation und Polymerisation, die bei homo-bifunktionellen NHS-Ester verwendeten Reagenzien sind auftritt minimieren. Im ersten Schritt reagiert die NHS-Ester witen primären Amine bilden Aminobindungen. In dem zweiten Schritt reagiert die Maleinimid mit Sulfhydrylgruppen bildenden Thioesterbindungen.
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Disclosures
Die Erwähnung von den Handelsnamen von kommerziellen Produkten in der Publikation ist ausschließlich für den Zweck der Bereitstellung von Informationen und impliziert nicht, Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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