Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.
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Artículo de método
La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona
En este artículo
Resumen
Resumen
Los estudios genómicos de cáncer en humanos han arrojado una gran cantidad de información acerca de los genes que están alterados en los tumores 1,2,3. Un desafío que surge de estos estudios es que muchos genes están alterados, y puede ser difícil distinguir las alteraciones genéticas que impulsaron la tumorigénesis de aquellos que surgió incidentalmente durante la transformación. Para hacer esta distinción es beneficioso tener un ensayo que puede medir cuantitativamente el efecto de un gen alterado en la iniciación del tumor y otros procesos que permiten a los tumores a persistir y difundir. Aquí presentamos un medio rápido para detectar un gran número de candidatos modificadores de melanoma en el pez cebra utilizando un modelo de tumor 4 autóctona que abarca los pasos necesarios para la iniciación y el mantenimiento de melanoma. Un reactivo clave en este ensayo es el vector miniCoopR, que acopla una copia de tipo salvaje del factor de especificación mitfa melanocitos a un casete de recombinación Gateway en el que candidato melAnoma genes pueden ser recombinados 5. El vector miniCoopR tiene un minigen rescate mitfa que contiene el promotor, marco de lectura abierta y la región 3 'no traducida del gen de tipo salvaje mitfa. Nos permite hacer construcciones con larga duración marcos de lectura abierta de modificadores de melanoma candidatos. Estos clones individuales pueden ser inyectados en célula única Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra. El vector miniCoopR se integra por Tol2 transgénesis mediada 6 y rescata a los melanocitos. Debido a que están físicamente acoplado a la minigen mitfa rescate, genes candidatos se expresa en los melanocitos rescatadas, algunas de las cuales se transforman y se desarrollan en tumores. El efecto de un gen candidato en la iniciación melanoma y propiedades celulares de melanoma se puede medir usando libres melanoma curvas de supervivencia, los ensayos de invasión, tinción de anticuerpos y ensayos de trasplante.
Protocolo
1. La detección de Onset Modificadores Melanoma
- Cree clones de entrada de puerta de enlace media por PCR amplificando el marco de cuerpo entero de lectura abierta de los genes de interés (GOI) y recombinación en pDONR 221 con BP Clonase II (Invitrogen). Use Multisite tecnología de Gateway (Invitrogen) para recombinarse p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 y miniCoopR 5 para colocar los genes de interés bajo el promotor en el vector mitfa miniCoopR (Figura 1A).
- Inyectar 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos Tol2 transposasa mRNA en una célula Tg (mitfa:....
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Resultados
Uno de células Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra fueron inyectados con el vector que contiene el oncogén miniCoopR melanoma SETDB1 5 o EGFP, cada uno bajo el control del promotor mitfa. Los embriones con rescate de melanocitos se seleccionaron y se dejó madurar. A los 2 meses de edad de los animales con rescate de melanocitos mayor que 4 mm 2 fueron seleccionados. Los animales fueron examinados semanalmente para melanomas. Curvas.......
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Discusión
El método miniCoopR permite la expresión de genes de interés en los melanocitos de pez cebra. Este enfoque tiene la ventaja del hecho de que el gen de pez cebra mitfa actúa células autónoma. Por esta razón, los melanocitos rescatadas por el vector miniCoopR son determinados para contener el minigen y cualquier gen de interés al que está acoplado físicamente. Melanocitos rescatados son claramente visibles y pueden ser obtenidos en los animales que fueron inyectados como una sola célula de los embriones. Un grado.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Leonard I. Zon en cuyo laboratorio estas técnicas fueron desarrolladas inicialmente; Kwan Kristen y el difunto Chi-Bin Chien para los regalos de los plásmidos utilizados en este trabajo, James Lister y Raible David para obtener ayuda con la tinción de anticuerpos, y por James Neiswender el vídeo de microinyección. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R00AR056899-03 a CJC
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Reactivos de puerta de enlace de recombinación | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Referencia 5 | ||
| Mitfa anticuerpo | Referencia 5 | ||
| FITC cabra anti-conejo de anticuerpos IgG | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper pez cebra | Referencia 9 | ||
| 701N 10 l Jeringa | Hamilton / Fisher | 14-824 | Ynbsp; |
| 40 mM de filtro | BD Falcon / Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referencias
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M.,
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Reimpresiones y permisos
