כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.
פלורסנט כלאה באתר באמצעות בדיקות DNA על 3-ממדי גרעינים נשמרו אחרי מיקרוסקופיה confocal 3D (דגי DNA 3D) מייצג את הדרך הישירה ביותר כדי לחזות את המיקום של לוקוסים גנטיים, כרומוזומלית תתי אזורים או שטחים שלמים בתאים בודדים. סוג זה של ניתוח מספק תובנה הארכיטקטורה העולמית של הגרעין, כמו גם את ההתנהגות של לוקוסים הגנומי ספציפיים ואזורים בתוך השטח הגרעיני. Immunofluorescence, לעומת זאת, מאפשר זיהוי של חלבונים גרעיניים (ההיסטונים שונים, משתנה ומכפילי היסטון, מכונות וגורמי שעתוק, תת תאים גרעיניים, וכו '). האתגר הגדול בשילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D הוא, מצד אחד לשמר epitope זוהה על ידי הנוגדן כמו גם ארכיטקטורת 3D של הגרעין, ומצד שני, על מנת לאפשר את החדירה של הבדיקה DNA כדי לזהות לוקוסים גנטיים או טריטוריות כרומוזום 1-5. כאן אנו מספקים פרוטוקול שמשלב הדמיה של שינויי הכרומטין עם לוקוסים הגנומי גרעינים נשמרו 3D.
מנגנוני ממסד epigenetic הדק וירושה של פרופילי תעתיק ספציפיים התפתחותיים ותא מסוג. ברמה אחת זה כרוך אפנון של אריזת הכרומטין שמגדירה אזורים גנטיים פעילים או שקטים. בקנה מידה גדול יותר, ארגון 3D הגלובלי של הגנום גרעיני והאדריכלות גם לשחק תפקיד בשליטה על דפוסי תעתיק. לפיכך, נתיחה של תכונות epigenomic אלה חיוני להבנה מלאה של איך גנים מוסדרים 6-11.
שילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D מספקים הזדמנות ייחודית כדי להשלים ניתוחים מולקולריים והביוכימי ידי הערכת אינטראקציות / עמותות של רצפי DNA ו / או חלבונים בתוך הגרעין ספציפיות. יתר על כן, אילו טכניקות תפוקה גבוהה הגנום כגון הכרומטין immunoprecipitation (שבב ואילך) או קונפורמציה לכידת כרומוזום בשילוב עם רצף עמוק (4C-seq, 5C, Hi-C) מספקות dat הגלובליעל אוכלוסיות תאים 12, טכניקות דגי immunofluorescence / דנ"א לאפשר ניתוחים ברמת התא הבודדה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחי 3D (חיסוני דגי 3D). היתרון של פרוטוקול זה הוא ההדמיה המשולבת של דנ"א ושימור של מבנים חלבוניים. הניסיון שלנו בתחום זה אפשר לנו לשפר ולפשט את פרוטוקולים קיימים. למרות שיש לנו להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הפסקות גדילי הדנ"א כפולים בהלימפוציטים עוברים רקומבינציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים וסוגי תאים אחרים.
הטכניקות המפורטות לעיל שמשו במעבדה שלנו לנתח את הרגולציה של רקומבינציה V (D) J של אימונוגלובולין ולוקוסי TCRA / ד בפיתוח לימפוציטים 30,31. אנו בטוחים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לזיהוי של חלבונים שונים גרעיניים, תאים גרעיניים ולוקוסים, בסוגי תאים שונים. ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לחברי Skok המעבדה, במיוחד סוזנה יואיט, לדיונים והערות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS הוא לוקמיה ולימפומה חוקר חברה. JC הוא עמית אירווינגטון מכון לחקר הסרטן. MM נתמך על ידי קרן לאומי למדע חינוך גרנט אינטגרטיבית בוגר והמחקר Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |