Experimentele Human Pneumokokken vervoer

Summary

Experimentele menselijke pneumokokken vervoer biedt een natuurlijk model van wagen en een potentieel model voor gebruik in de ontwikkeling van vaccins. Deze techniek is waardevol maar ingewikkeld en brengt klinisch risico door een pathogeen in een mens. We hebben een uitgebreide protocol.

Abstract

Experimentele menselijke pneumokokken vervoer (EHPC) is wetenschappelijk van belang omdat nasofaryngeale vervoer van Streptococcus pneumoniae is zowel de belangrijkste bron van transmissie en de voorwaarde van invasieve ziekte. Een model van slede een nauwkeurige bepaling van de immunologische correlaten van bescherming zal het immuniserende effect van het vervoer en het effect van druk op de gastheer pathogeen in de nasofaryngeale niche. Verder methoden vervoer detectie bruikbaar in epidemiologische studies, waaronder vaccins studies, kunnen worden vergeleken.

Streven

Wij streven naar een EHPC platform dat is een veilige en handige reproduceerbare methode die zou kunnen leiden tot down-select kandidaat roman pneumokokkenvaccins gebruikt worden met het voorkomen van het vervoer als een surrogaat van het vaccin geïnduceerde immuniteit te ontwikkelen. Het zal werken aan het testen van kandidaat-vaccins en beschrijvingen van de mechanismen die ten grondslag liggen EHPC en vaccin bescherming tegen Carrièresge ^1. Actueel geconjugeerde vaccins tegen pneumokokken kinderen beschermen tegen invasieve ziekte, hoewel nieuwe vaccins zijn dringend nodig omdat de huidige vaccin niet is voorzien in een optimale bescherming tegen niet-bacteriëmische longontsteking en is er bewijs van serotype vervanging door niet-vaccin serotypen ^2-4.

Methode

We enten met S. pneumoniae gesuspendeerd in 100 pl zoutoplossing. Veiligheid een belangrijke factor in de ontwikkeling van het model EHPC en wordt bereikt door intensieve screening vrijwilliger en monitoring. Een veiligheidssysteem commissie, bestaande uit artsen en wetenschappers die onafhankelijk zijn van de studie geeft objectieve feedback op een wekelijkse basis.

Het bacterieel inoculum is gestandaardiseerd en vereist dat geen dierlijke producten geënt in vrijwilligers (plantaardige media en zoutoplossing). De doses die nodig zijn voor kolonisatie (10 ⁴ -10 ⁵⁾ zijn veel lager than die gebruikt worden in diermodellen (10 ^{7) 5.} Detecteren pneumococcen wagen wordt versterkt door een grote hoeveelheid (bij voorkeur> 10 ml) nasale wash die relatief vrij slijm. Dit protocol zal zich bezighouden met de belangrijkste onderdelen van het protocol op zijn beurt. Dit zijn (a) selectie vrijwilliger, (b) pneumokokken inoculum preparaat, (c) inoculatie (d) het volgen en (e) het vervoer detectie.

Resultaten

Onze huidige protocol is veilig in meer dan 100 vrijwilligers aan een aantal doses met behulp van twee verschillende bacteriële serotypen ^6. Een dosis variërend studie met behulp van S. pneumoniae 6B en 23F wordt momenteel uitgevoerd om de optimale dosis te bepalen voor inoculatie 50% vervoer. Een voorspelde percentage van 50% van het vervoer zal de EHPC model hoge gevoeligheid voor werkzaamheid van het vaccin te hebben met kleine studie nummers.

Protocol

1. Vrijwilliger selectie en screening

1. Gezonde vrijwilligers worden geworven via poster advertenties en op de website van de Universiteit op basis van de NHS Research and Ethics Committee begeleiding.
2. De inclusiecriteria voor deelname zijn:
   1. Volwassenen van 18-60 jaar.
   2. Spreekt vloeiend Engels en is in staat om gemakkelijk te communiceren met zowel mobiele telefoon en sms.
3. De uitsluitingscriteria voor deelname zijn:
   1. Nauw contact met het risico individuen (kinderen, immunosuppressie volwassenen, ouderen, chronisch slechte gezondheid).
   2. Huidige roker of belangrijke rokers geschiedenis (> 10 pack jaar).
   3. Astma of andere luchtwegaandoeningen.
   4. Zwangerschap.
   5. Allergie voor penicilline of amoxicilline.
   6. Huidige betrokkenheid bij een ander klinisch onderzoek, tenzij waarnemingen of aan niet-interventionele fase.
   7. Kan volledig geïnformeerde toestemming te geven.
4. Een eerste screening bezoek, ongeveer een week voor enting, bestaat uit een gerichte anamnese en gericht klinisch onderzoek.
5. Als een eerder opgenomen afwijking wordt gevonden, zal de vrijwilliger worden uitgesloten van de studie en de nodige onderzoeken zal worden geregeld via de eerste lijn.
6. Tijdens de eerste screening een bezoek aan een volledig bloedbeeld wordt verkregen om ervoor te zorgen dat het aantal witte bloedcellen is binnen het normale bereik voor de inoculatie bezoek. Een nasale wassen wordt uitgevoerd om natuurlijke pneumokokken dragers uitgesloten (zie 6.1).
7. Voorafgaand aan inoculatie, worden vrijwilligers opgeleid op de risico's van deelname aan het onderzoek en zijn voorzien van een noodsituatie bijsluiter, digitale thermometer, noodnummers en 3 daagse cursus van amoxicilline.

2. Voorbereiding van Inoculatie Voorraden

1. Bereiding van de inoculatie voorraden worden uitgevoerd in een schone omgeving. De gebruikte pipetten dienen enkel gebruikt wordend inoculum voor bereiding. Alle glas en plastic waren moet steriel zijn. Wij raden inoculatie voorraden worden bereid in een speciale ruimte, met behulp van een speciale fumehood en incubator.
2. Pneumokokken stammen worden geënt op een bloed agar plaat. Platen worden geïncubeerd bij 37 ° C in _5% CO2 gedurende de nacht. De volgende dag zijn alle bacteriën wordt geschraapt uit het bloed agar plaat en geënt in een kraal voorraad archiveringssysteem. Deze kraal voorraden worden gebruikt voor inoculatie voorraad voorbereiding. Test de kraal voorraden op vervuiling en kolonie uniformiteit voor de voorbereiding van een inenting voorraad.
3. Om de inoculatie voorraad te bereiden, enten een bloed agar plaat met twee kralen van de gewenste pneumokokken serotype kraal voorraad, strepen om de hele plaat te dekken. Incubeer de platen bij 37 ° C in _5% CO2 gedurende de nacht. Alle verdere incubaties gebruikt gelijke condities. Ook broeden de Vegitone afdrukmateriaal 's nachts om steriliteit te waarborgen.
4. De volgende ochtend wattenstaafjede helft van de plaat, zorg ervoor dat u geen bloed agar te verwijderen en toe te voegen aan 12 ml voorverwarmde Vegitone bouillon. Herhaal met de andere helft van de plaat. Laat de twee 12 ml flesjes bij 37 ° C gedurende 2 uur of totdat een verandering in troebelheid optreedt, wat het eerst komt.
5. Voeg de 12 ml tot 40 ml voorverwarmde Vegitone bouillon en meng. Herhaal dit voor de andere 12 ml flacon. Dit is tijdstip = 0. Verwijder 100 ul met de optische dichtheid (OD) bij 600 nm gelezen. Verwijder 20 ul voor het kwantificeren van bacteriën door kolonievormende eenheid (CFU) count met een variant van de werkwijze van Miles en Misra (M & M) ^7. Incubeer beide flacons.
   1. Voor de M & M, verdeel een bloed agar plaat in zes delen. Voeg 180 ul steriel PBS zes putjes van een plaat met 96 putjes (U-bodem). Voeg 20 ul van de bouillon boven goed en meng. Serieel verdunnen van het monster 1:10 zes keer en gooi 20 ul van de zesde goed. Plaats drie druppels van 10 ul boven ver in het eerste deel van debloed agarplaat. Herhaal dit voor de vijf andere bronnen. Zorg ervoor dat de plaat droog is voordat het wordt omgekeerd en geïncubeerd.
   2. De volgende dag telt het aantal zichtbare kolonies in elke verdunning sectie en record. Met de verdunning gedeelte met een aantal tussen 30 en 300, delen het aantal zichtbare kolonies door drie van een gemiddelde.
   3. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal kolonies met de verdunningsfactor en delen door 10 (het bedrag van de druppel 10 pi). Dit geeft CFU / ul.
   4. Vermenigvuldig dit getal met 1.000 tot CFU / ml te krijgen.
6. Voer OD600 metingen en kwantificering van bacteriën door M & M werkwijze per uur tot begin mid-log fase wordt bereikt, een OD van 0,25.
7. Zodra deze OD bereikt, voeg gesteriliseerde 10% glycerol aan een flesje en bereiden 1 ml aliquots. Store aliquots bij -80 ° C.
8. Voor een meer geconcentreerde voorraadoplossing wordt gecentrifugeerd andere flacon 3345 xg gedurende 15 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de pellet in 22,5 ml van Vegitone middellange en voeg 10% glycerol. Bereid 1 ml aliquots en bij -80 ° C.
9. Reactie voorraad bij -80 ° C gedurende ten minste 48 uur voor ontdooien en kwantificeren.
10. Kwantificeer de bevroren bacteriële voorraad door de M & M-methode. Individueel te testen drie stock buizen om reproduceerbaarheid te garanderen. Gebruik de gemeten waarde van de voorraad te verdunnen tot de gewenste concentratie inoculum in zoutoplossing, zoals hieronder beschreven.
11. Voor inoculatie wordt de hoeveelheid in de pneumococcen inoculum berekend voor en na de inoculatie. Kwantificering van bacteriën door de M & M methode wordt gebruikt om het gemiddelde aantal pneumococcen in het inoculum die goed is voor de tijd die nodig is om de gehele procedure te bepalen.
    1. Bereid een inoculum, verdunnen tot de gewenste concentratie en voer kwantificering van de M & M werkwijze voor de "pre-inoculatie" count.
    2. In onze Clinical Research Facility duurt het team 30 min in beslag de hele inoculatie procedure. Pneumococcal schorsingen in een zoutoplossing zal geven over het algemeen een verminderde tellen in dit interval. Om rekening te houden voor deze, laten we de verdunde inoculum zitten bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en vervolgens een "post-inoculatie" kwantificering van de bacteriën door de M & M-methode.
    3. Het gemiddelde van de voor en na de definitieve geïnoculeerd concentratie te bepalen. Pas de "zitten" tijd op basis van uw klinisch protocol maar houd het interval zo kort mogelijk.
12. Alle nieuwe aandelen dienen te worden verzonden naar een referentielaboratorium voor de bevestiging van voorraad zuiverheid en identiteit.

3. Inoculumbereiding

1. Bereiding van het entmateriaal moet beginnen 30 minuten vóór de geplande vrijwilliger inoculatie afspraak.
2. Neem een ​​van de eerder gemaakte voorraad buizen uit de -80 ° C vriezer, ontdooi het en draai de buis in de microcentrifuge bij 17.000 xg gedurende 3 minuten.
3. Warm bloedagarplaten in de 37 ° C incubator. Bereideneen 96 wells plaat bacteriële kwantificering van M & M werkwijze en bereiden verdunning buizen volgens de gewenste dosis.
4. Verwijder het supernatant van de bouillon gecentrifugeerd buis en resuspendeer de pellet in 1 ml zoutoplossing. Deze stap verwijdert de bouillon van de inoculum.
5. Centrifugeer nogmaals stap.
6. Verwijder het supernatant zoutoplossing Resuspendeer de pellet in 1 ml zoutoplossing.
7. Voer verdunning set voor de gewenste inoculum concentratie en kwantificeren door M & M-methode.
8. Neem het inoculum aan de vrijwilliger benoeming en na inoculatie van de vrijwilligers, de kwantificering te herhalen in het lab. Label de buis met de datum en inoculum dosis en bij -80 ° C.
9. Om consistentie van inoculatie tot inoculatie, is het belangrijk om dezelfde pipetten en toegewijde laboratoriumapparatuur telkens.

4. Inenting

1. Vrijwilligers moeten comfortabel zitten in een semi-liggende positie.
2. Langzaam verdrijven het inoculum op het neusslijmvlies met een draaiende beweging.
3. Het is essentieel dat de pipetpunt niet in aanraking komt met de nasale mucosa als een verstoring in de integriteit van het epitheel kan leiden tot de bacteriën in de bloedbaan.
4. Het is ook van vitaal belang dat het inoculum niet te ver naar achteren geplaatst of het zal lopen in de keel, maar moet wonen in de neusholte.
5. Herhaal dit voor de andere Naris.
6. Laat de vrijwilliger in de semi-liggende positie te blijven gedurende 10 minuten zonder snuiven of snuiten van de neus. Dit maakt tijd voor de bacteriën om zich te verspreiden over de mucosa.

5. Monitoring

1. Vrijwilligers worden dagelijks gecontroleerd na inoculatie. Dit is inclusief een dagelijks tekstbericht verzonden door de vrijwilliger aan onderzoekers voor 2 uur.
2. Als de tekst is niet ontvangen door 2 uur de vrijwilliger gecontacteerd zijn / haar welzijn waarborgen. Als hij / zij niet reageert, zal de toegewezen nabestaanden contact worden opgenomen om de vrijwilliger het welzijn te garanderen.
3. Vrijwilligers wordt gevraagd te rapporteren over alle bovenste luchtwegen symptomen bij elke afspraak. Klinische personeel zal u vragen de vrijwilliger zijn / haar symptomen te beschrijven en zal follow-up geen klachten.
4. De antibiotica die aan de vrijwilligers alleen worden genomen onder drie omstandigheden, indien ze onwel en geïnstrueerd om ze door het onderzoeksteam, indien zij die pneumococcus aan het einde van de studie, of als ze onwel en niet in staat om het onderzoeksteam te contacteren. De vrijwilliger wordt aangemoedigd om deze noodsituatie pak houden met hen te allen tijde tijdens de studie en wordt verzocht om het onderzoeksteam contact op een dagelijkse basis voor de komende 7 dagen.
5. Ons team is 24/7 bereikbaar met verpleegster contact tijdens de werkuren en twee artsen beschikbaar op hours. Alle vragen worden behandeld door telefoongesprek en / of onmiddellijke herziening. Voorzieningen zijn beschikbaar voor onmiddellijke, directe toegang tot een infectieziekte afdeling, indien nodig.

6. Nasale Wash (NW) Procedure

1. Nasale wasvloeistoffen (NW) worden uitgevoerd bij een eerste screening bezoek en 48 uur, 7 en 14 dagen na de inoculatie. De gebruikte NW methode is ontleend Naclerio et al.. ⁸ vrijwilligers natuurlijk gekoloniseerd door S. pneumoniae zijn uitgesloten van inoculatie en follow-up.
2. De vrijwilliger is comfortabel zitten en het hoofd wordt weer gekanteld 30 ° van de verticale.
3. Vraag de vrijwilliger om diep adem in te nemen en hun adem in te houden terwijl duwen hun tong op en naar achteren tegen het dak van de mond. Hoewel in deze positie wordt de vrijwilliger gevraagd om aan te geven dat ze klaar zijn.
4. Een spuit met 20 ml zoutoplossing wordt in het voorste nasale ruimte en 5 ml zoutoplossing wordt uitgedreven. De volunteer leunt dan naar voren onmiddellijk en verdrijft het vocht door uitademen snel door hun neus in een folie kom.
5. Herhaal deze procedure 3 keer zodat iedere Naris is tweemaal gewassen en de volledige 20 ml werd gebruikt.
6. Pool alle monsters samen in een centrifugebuis en naar het laboratorium bij kamertemperatuur verwerking.

7. Nasale wassen Processing

1. Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 3345 x g.
2. Verwijder het supernatant en opslaat als 1 ml porties in gelabelde Eppendorf buisjes bij -80 ° C.
3. Voeg 100 ul van STGG medium ⁹ tot en met de pellet en meng goed. Toe dat de totale volume in de buis op dit punt wordt bepaald. Deze verdunning wordt de berekening van de CFU van een rijtuig positieve NW.
4. Plaat een 20 ul druppel van de STGG met de geresuspendeerde pellet op een agar plaat met gentamicine en streeploos de hele plaat.
   1. Als de NW is na inoculatieVerwijder 10 pi van de STGG met de geresuspendeerde pellet en het gebruik van bacteriële kwantificering van M & M methode.
5. Voeg een 800 ul van STGG-NW buis en meng goed.
6. Plaat 25 pi op een agar plaat en 25 pi op een chocolade agar plaat, strepen de hele plaat.
7. Verdeel het resterende bedrag bacteriën gesuspendeerd in STGG medium in 2 cryovials en bewaar bij -80 ° C.
8. Incubeer de platen bij 37 ° C geïncubeerd in _5% CO2.
9. Onderzoek de platen de volgende dag voor pneumokokken en andere potentiële respiratoire pathogenen.
10. Pneumokokken worden geïdentificeerd op platen door kolonie morfologie. Alpha hemolytische kolonies met tekenaar morfologie zijn sub-gekweekte op bloed-agar met een optochin schijf en 's nachts geïncubeerd.
11. Vermoedelijke pneumokokken kolonies die optochin gevoelig zijn Gram gekleurd door Gram positieve diplokokken bevestigen en geserotypeerd met behulp van het Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.

Representative Results

Wij hebben ervaring enten 159 mensen, waarvan 35 hebben pneumokokken uitgevoerd. De laagste dosis we vervoer bereikt met behulp serotype 6B was 11.100 CFU/100 ul per Naris de hoogste dosis was 313.000 CFU/100 ul per Naris. De laagste dosis we vervoer bereikt met behulp serotype 23F was 9000 CFU/100 ul per Naris de hoogste dosis was 84.500 CFU/100 ul per Naris.

Onze methode van vervoer assessment is een nasale wassen, gekozen omdat een recente studie ¹⁰ blijkt dat 91% van de vrijwilligers nasale wassen blijken te zijn comfortabeler dan nasofaryngeale swab, de nasale wassen was ook meer kans om pathogenen met behulp van microbiologische cultuur op te sporen. Microbiële flora teruggevonden op bloed agar platen geënt met NW variabel kan zijn en moeilijk te lezen. Gentamicine wordt gebruikt op het eerste bloed agar plaat te selecteren op pneumococcus. De chocolade agar plaat en de tweede plaat agar worden gebruikt om andere potentiële respiratoire pad detecterenOgens die kunnen helpen of hinderen pneumokokken kolonisatie. Een voorbeeld van een bloed-agarplaat geïnoculeerd met NW dat leesbaar is weergegeven in fig. 1a, een moeilijke plaat met vele soorten flora is weergegeven in figuur 1b.

Bij elke benoeming vrijwilligers werden gevraagd om een ​​bovenste luchtwegen symptomen te beschrijven, indien aanwezig, en vergelijkingen tussen dragers en niet-dragers werden gemarkeerd. Van de 145 personen onlangs geïnoculeerd met pneumococcus, 28 klaagde symptomen (tabel 1). Acht van deze drager waren twintig niet. De meest voorkomende symptomen zijn aspecifieke nasale symptomen (Tabel 1). Van de gevallen waarin er werden gemeld systemische symptomen, waaronder koorts en / of malaise, geen van het uitgevoerde onderzoek bleek het bewijs van pneumokokken en symptomen kwamen overeen met gelijktijdige virale infectie, behalve in een geval van tonsillitis. Twee pneumokokken positive vrijwilligers werden behandeld met antibiotica. Een klaagde over keelpijn en oorpijn en, na een ontmoeting met de studie arts, werd geadviseerd om antibiotica te nemen als voorzorgsmaatregel. De andere vrijwilliger werd klinisch gediagnosticeerd met tonsillitis. Alle vrijwilligers had een snelle oplossing van de symptomen.

Figuur 1. Agar plaat geënt met NW. Bloedagarplaten geïnoculeerd met NW kan moeilijk te lezen. 1a is een voorbeeld van een plaat die gemakkelijk te lezen pneumokokken duidelijk zichtbaar. 1b is een plaat met veel co-koloniserende flora waardoor het moeilijk te detecteren of pneumokokken aanwezig is.

Symptomen		Vervoer (n = 32)	Geen vervoer (n = 112)
Allesymptomen		24%	18%
Systemische	Koorts	3%	4%
	Malaise *	9%	4%
Lokaal	Oren	9%	3%
	Neus	0	10%
	Keel	12%	3%

Tabel 1. Karakterisering van vrijwilliger meldde symptomen na S. pneumoniae 6B inoculatie. Alle klachten werden beoordeeld door de externe veiligheid commissie en, na de volledige onderzoeken, werden geen symptomen toegeschreven aan pneumokokkeninfecties. De meest voorkomende symptomen waren keelpijn, opgezette neus en griepachtige ziekte.

Discussion

De EHPC platform heeft een aantal mogelijke toepassingen waaronder het gebruik als een mucosaal vaccin model en als een surrogaat voor het testen van bescherming nieuw eiwit vaccins. De werkwijze is afhankelijk van een consistente techniek inoculatie en een hoge kwaliteit NW.

Reproduceerbaarheid kan een probleem met het inoculum te zijn. Door de variabele aard van de bevroren bacteriële aliquots, kan het moeilijk zijn om de gewenste dosis repliceren. Een halvering of verdubbeling van de gewenste dosis wordt beschouwd binnen het bereik. Het is essentieel dat de bacteriële kwantificering worden gedaan onmiddellijk vóór en na inoculatie, om nauwkeurig te bepalen kwantificering van bacteriën door CFU. Daarom kan het nuttig zijn als vrijwilliger afspraken gelijktijdig plaatsvinden zodat slechts een inoculum hoeft te worden voorbereid en de kwantificering plating gedaan vóór en na inoculatie gebeurt niet meer dan 30 min elkaar.

De NW-methode vereist dat de samenwerrantsoen van de vrijwilliger en zou niet een ideale methode bij kinderen. Als de opbrengst minder dan 5 ml, kan de procedure worden herhaald met tot een extra 20 ml. Het dragen van prothesen kan de NW opbrengst. Als de vrijwilliger heeft een verstopte / verstopte neus en de zoutoplossing raakt voren na het inbrengen, blazen de neus, rug steek de spuit een beetje verder, en kantel het hoofd achterover meer indien nodig.

De NW is een techniek die beter wordt met de praktijk. Sommige volume meestal verloren het is de bedoeling om een ​​rendement van ten minste 10 ml. Als de vrijwilliger kan saline smaak in de NW dan de verbinding tussen de achterste nasofarynx en oropharynx is onvoldoende afgesloten door tong de vrijwilliger. Als de vrijwilliger slikt meeste zoutoplossing, opnieuw de procedure uitleggen, benadrukt het duwen van de tong tegen het gehemelte. Herhaal vervolgens de procedure om het volume te verhogen geretourneerd.

Als de NW bevat substantial hoeveelheid slijm, is het het beste om het te verwijderen voordat centrifugeren. Vortex het monster teneinde iets dat kan worden gebonden aan het slijm en verwijder zoveel mogelijk van de grote stukken mogelijk tijdens het verwijderen zo min mogelijk zoutoplossing los.

Een eerdere EHPC studie in de Verenigde Staten werd veilig afgesloten en had geen bijwerkingen ^11. Om de voortdurende veiligheid van de EHPC platform te garanderen, hebben we het opzetten van een noodsituatie protocol dat is gebaseerd op 24 uur toegang tot het onderzoeksteam. Vrijwilligers krijgen contactgegevens, zodat ze toegang krijgen tot het onderzoeksteam 24 uur per dag. Alle benodigde medische zorg wordt verleend in het Academisch ziekenhuis Royal Liverpool. Als een verdere mate van bescherming, een veiligheids-commissie, bestaande uit clinici en wetenschappers van buiten de onderzoeksgroep ontvangt wekelijks een veiligheidsrapport. Het rapport bevat de bacteriële dosis elke vrijwilliger ontvangen en of er klachten of ziekte gemeld. Dit rapport kan de veiligheid van ee studie extern worden bekritiseerd zonder vooringenomenheid. De veiligheidscommissie zijn ook 24 uur per dag in het onwaarschijnlijke geval van een noodsituatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0.9% Sodium Chloride	B. Braun	3627667
Skim milk powder	Fluka	70166
Tryptone soya broth	Becton Dickinson	211768
Glucose	BDH	284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood	Oxoid	PB0124
Pneumotest-latex kit	Statens Serum Institut	51823