Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Summary

Wie neuronale Netze sind in der embryonalen Gehirn etabliert ist eine grundlegende Frage in Entwicklungsneurobiologie. Hier haben wir eine Elektroporation kombiniert Technik mit neuartigen genetischen Werkzeugen, wie Cre / Lox-Plasmiden und DNA-vermittelte PiggyBac Umsetzung System in der aviären hindbrain nach dorsal Interneuronen kennzeichnen und verfolgen ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele auf verschiedenen Entwicklungsstadien.

Abstract

Elektroporation des Kükenembryonen Neuralrohr hat viele Vorteile, als schnell und effizient zur Expression fremder Gene in neuronalen Zellen. In diesem Manuskript bieten wir eine Methode, die eindeutig zeigt, wie DNA in das Vogelgrippe hindbrain elektroporieren bei E2.75 um spezifisch zu markieren eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen, und wie sie ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele bei viel fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung zu folgen, bis E14.5. Basierten Plasmiden und der PiggyBac DNA-vermittelte Umsetzung System GFP-Expression in einem Subtyp von hindbrain Zellen (die dorsale meisten Untergruppe von Interneuronen dA1) fahren - Wir haben neue genetische Werkzeuge einschließlich spezifischer Enhancer-Elemente, Cre / Lox genutzt. Axonal Bahnen und Ziele dA1 Axone sind in der frühen und späten embryonalen Stadien an verschiedenen Hirnstamm Regionen gefolgt. Diese Strategie trägt fortgeschrittene Techniken zur gezielten Zellen von Interesse in der embryonalen hindbrain und traCing Schaltung Bildung in mehreren Stufen der Entwicklung.

Introduction

Die hindbrain stellt einen wichtigen Relais Nabe des Nervensystems durch die Kommunikation zwischen den zentralen und peripheren Nervensystems über-und absteigenden neuronalen Netzen. Es regelt grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein, Gehör und Motorik ^1-3. Während der frühen embryonalen Entwicklung wird der Wirbeltiere hindbrain transient entlang seiner anterior-posterioren (AP) Achse in sich wiederholenden Rhombomere, in denen verschiedene neuronale Zelltypen gebildet werden und erzeugen mehrere Hirnstammkerne Zentren ⁴ unterteilt. Die hindbrain wird auch entlang der dorsal-ventralen (DV) Achse in eine basale und alar Platte, an dem diskreten neuronalen Vorläuferzellen werden angegeben und differenzieren in verschiedene Standorte DV ^3,5,6 unterteilt. Wie die frühen AP und DV-spezifische neuronale Muster sind für die Errichtung von funktionellen Schaltkreisen Hirnstamm ist weitgehend unbekannt.

Um Wissen zu diesem grundlegenden gewinnenFrage, sind Werkzeuge erforderlich, um bestimmte Untergruppen von Neuronen im frühen hindbrain beschriften und ihre axonalen Bahnen und Konnektivität bei fortgeschrittenen Stadien zu verfolgen. Wir haben zuvor spezifische Enhancer-Elemente verwendet, und eine Cre / loxP-basierten bedingten Ausdruck System für die Verfolgung axonal Flugbahn des dorsalen spinalen Interneuronen in den frühen Hühnerembryozellen ^7-9. In der aktuellen Manuskript haben wir die hindbrain gezielt und aktualisiert die experimentelle Paradigma zur Kennzeichnung späten embryonalen hindbrain Interneuronen, Axone und deren synaptischen Ziele, mit einer modifizierten Elektroporation Strategie und die PiggyBac - vermittelte DNA Umsetzung. Unsere neue Strategie ermöglicht die Kennzeichnung von verschiedenen neuronalen Subtypen in einer Seite des hindbrain und die Verfolgung ihrer axonalen Projektionen und synaptische Sites an verschiedenen embryonalen Stadien, von 2 bis 12 Tage nach der Elektroporation. Basierend auf dieser Methode, beschriftet wir die meisten dorsal-Untergruppe von hindbrain Interneuronen (dA1/Atoh1 ⁺ 10 gefunden.

Die Kombination von Küken Elektroporation genetischen Rückverfolgung von Neuronen und Analyse Projektionsstellen bei viel fortgeschrittenen Entwicklungsstadium bietet eine einzigartige Plattform, um die Bildung von neuronalen Netzwerken im Gehirn zu untersuchen und molekularen Mechanismen, die Schaltung Bildung regeln aufzuklären.

Protocol

1. Rautenhirn Elektroporation

1.1 Egg Handling

1. Legen Sie die Eier horizontal in einem befeuchteten Inkubator (37 bis 38,5 ° C). Die Embryonen werden nach 65-70 h Inkubation Elektroporation, wenn sie 16-17 (HH) Stufe (25-30 Somiten) zu erreichen.
2. Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, sondern bleiben in der horizontalen Position.

1.2 Vorbereitungen

1. Ziehen Glaskapillaren (0,5 mm Durchmesser).
2. Verbinden gebogenen L-förmigen Gold Genetrodes Elektroden (3 mm Durchmesser) mit einem Adapter Halter an den Impulsgenerator. Elektroporation Parameter umfassen 25 Volt, 5 Pulszahlen, 45 ms Pulslänge 300 ms Impulsintervalle.
3. Bereiten Sie eine Mund Pipette, 10 ml Spritze und Nadel, Parafilm-Streifen, mit einer weichen Bürste, scharfe Präparierscheren und 25 ml steriler PBS-Lösung. Dieser Betrag ist in der Regel ausreichend, um ein Ei Fach (18 Eier) zu behandeln.
4. Zur Vorbereitung eines angemessenen Mischung von DNA-Plasmide (5 ug / ul jeder) undfügen über 0,025% Fast Green Farbstoff DNA-Injektion zu visualisieren. Normalerweise wird ein Volumen von 4 ul ist ausreichend für die Injektion von einem Tablett.

1.3 Windowing, Injektion und Elektroporation

1. Reinigen Eierschalen mit 70% Ethanol.
2. Griff ein Ei auf einmal zu embryonalen Belichtungszeit, um Luft zu minimieren.
3. Machen Sie ein Loch im Ei-Pol mit der Schere Enden entfernen und 3-4 ml Albumin mit der Spritze. Nehmen Sie eine größere Menge von Albumin als es Lebensfähigkeit reduziert.
4. Öffnen Sie eine kleine ovale Fenster (2,5 x 2 cm Größe) in der oberen Mitte der Eierschale mit den Präparierscheren.
5. Tropfen einige Tropfen PBS auf der Oberseite des Embryos bis zur Trockenheit während des gesamten Prozesses zu verhindern.
6. Legen Sie eine kleine Menge des DNA-Gemisch in die Glaskapillare mit dem Mund ansaugen.
7. Setzen Sie den Embryo mit seinem hinteren Ende in Richtung zu Ihnen. Keine Tinte Injektion wird in dieser Phase erforderlich, da der Embryo ist deutlich sichtbar. Vermeiden Tinte Injektion erhöhtembryonale Überleben. Dringen die Schwanzflosse hindbrain indem die Kapillare bei ~ 45 °. Entfernen Sie keine Membran aus der ganzen Embryo. Spritzen DNA-Lösung vorsichtig in den hindbrain Lumen und ausatmen ohne Bildung von Luftblasen. DNA-Lösung breitet vorn.
8. Unmittelbar nach der DNA-Injektion, legen Sie die parallele Elektroden genau an der AP und DV hindbrain Position, die Sie wollen Ziel. Drücken Sie die Elektroden leicht ventral ohne Berührung des Herzens, wie es Lebensfähigkeit verringern kann. Pulse die Elektroporator. Die Elektroden in Blasen abgedeckt werden, um elektrische Leitfähigkeit zeigen (Abb. 1A).
9. Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und tropft einige Tropfen PBS, um den Embryo zu kühlen und Luftblasen zu entfernen. Verschließen Sie die Öffnung Ei richtig mit einem Parafilm Streifen der Trocknung während der Inkubation zu verhindern. Waschen Elektroden in PBS mit der weichen Bürste.
10. Platzieren Ei in den Inkubator für die gewünschte Zeitdauer. Überleben von Embryonen etwa 90% 2-3 Tage nachElektroporation, reduziert und bis zu 50% 12 Tage nach der Elektroporation.

2. Analyse von Embryonen

2.1 Flat-Mount Vorbereitung und Immunfluoreszenz

1. Flat-Mount-Präparaten der hindbrain können bis E6.5 durchgeführt werden, um einfach visualisieren Axone unter einem Mikroskop oder einem Stereo-Mikroskop.
2. Präparieren Sie die Embryo sorgfältig trennt sie vom umgebenden Membranen und Blutgefäße. Setzen Sie den Embryo in einem kleinen Silikon - beschichtete Petrischale mit PBS. Befestigen Sie den Embryo in die Schale mit Wolfram Pins nach dorsal. Führen Sie einen dorsalen Schlitz in der hindbrain Dach-Platte mit scharfen Glaskapillaren.
3. Mit scharfen Pinzette und Mikro-Schere halten Sie den oberen Teil des Kopfes und ziehen Sie den hindbrain Gewebe sehr sorgfältig von rostral nach kaudal. Nach der Abtrennung der hindbrain entfernen restlichen ventralen Gewebe, um eine saubere Vorbereitung zu erreichen.
4. Inkubieren Sie die hindbrain mit 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die hindbrain mit PBT (PBS/0.1% Triton X-100) zu PFA entfernen.
5. Für Immunfluoreszenz in Flachbild-montiert hindbrains hinzufügen 500 l Blocking-Lösung (5% Ziegenserum in PBT und Inkubation für 2 Stunden bei RT inkubieren mit ^1. Antikörper ON bei 4 ° C. Waschen mit PBT (15 min x 3) inkubieren. mit ^2. Antikörper für 2 Stunden bei RT. mit PBT (15 min x 3) zu waschen.
6. Setzen Sie den Blick auf hindbrain dorsal auf einem Glasträger. In fluoreszierenden Eindeckmitteln auf die hindbrain. Verwenden Glaskapillaren oder Wolfram Nadeln, um die hindbrain auf der Folie zu glätten.
7. In wenig Fett an jeder Ecke zu quetschen des Gewebes durch das Deckglas zu verhindern. Vorsichtig ein Deckglas auf der Oberseite des hindbrain und vermeiden Sie Luftblasen. Zur Einhaltung hinzufügen Nagellack Glaskanten decken.

2.2 Cryo-Abschnitte und Immunfluoreszenz

1. Cryo-Abschnitten des Hirnstamms ca.n in jedem Stadium zu axonalen Bahnen visualisieren durchgeführt werden. Doch nach E6.5 dies das bevorzugte Verfahren, da es schwierig zu Axone in der Wohnung montiert Embryo, der zu dick wird visualisieren. Darüber hinaus erfordert Demonstration von Synapsen Schneiden des Gewebes und hoher Vergrößerung Ansicht unter dem Mikroskop.
2. Präparieren Sie den Embryo und entfernen Sie alle umgebenden Gewebe. Abspülen mit PBS. Schneiden Sie den Embryo im kaudalen Teil der Medulla mit Mikro-Schere und Pinzette scharf. Einen breiten Einschnitt zwischen dem Kleinhirn und dem Mittelhirn und entfernen Sie das gesamte Hirnstamm. Das Gewebe sollte die Medulla, Pons und Kleinhirn.
3. Fix den Hirnstamm in 4% PFA über Nacht (ON) bei 4 ° C, Spülen mit PBS (10 min x 3), und Inkubation mit 30% Saccharose ON bei 4 ° C bis Untergang.
4. Einbetten hindbrain in einer Kryo-Form mit OCT (Optimal Cutting Temperatur)-Verbindung, und legen Sie sie bei -20 ° C bis Einfrieren, wie an anderer Stelle beschrieben ^11.
5. Trocknen Sie die Dias. 100 l Blocking-Lösung auf jeder Folie für 2 h bei RT. 100 ul Antikörper (verdünnt in Blocking-Lösung auf die gewünschte Konzentration). Inkubationszeit für ^1. und ^2. Antikörper ist ON bei 4 ° C oder 2 Stunden bei RT, beziehungsweise. Für jede Inkubationszeit sanft hinzufügen Parafilm Streifen auf der Oberseite der Folie, um Trockenheit zu verhindern. Waschen mit PBS (10 min x 3) zwischen Antikörpern. Falls erforderlich, fügen 1:1.000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-phenylindol), in PBS für 20 min bei RT verdünnt. Abspülen mit PBS.
6. Montage des Schlittens mit fluoreszierenden Montage Medien. Lassen Sie für 1 Stunde vor der Analyse trocken.

Representative Results

Dieses Protokoll wurde kürzlich verwendet, um die Muster und axonale Projektion Websites von dA1 Untergruppe von Interneuronen im chick hindbrain ¹⁰ aufzudecken. Um spezifisch zu markieren diese Axone, wurde ein Enhancer-Element (ATOH1), die zuvor als spezifisch für spinale Neuronen dI1 ^8,12,13 charakterisiert wurde, bestätigt, dass in hindbrain dA1 Zellen ¹⁰ ausgedrückt werden. Das Element wurde stromaufwärts nach Cre-Rekombinase und E2.75 zusammen mit einem Cre abhängige zytoplasmatische GFP-Reporter-Plasmid (; Abbildung 1BI pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-CGFP) co-Elektroporation geklont. Hindbrains wurden 48 h Nach der Elektroporation von Flachbild-Halterung Vorbereitung analysiert und zeigte zwei kontralateralen steigend axonalen Projektionsmustern (2A), ein Trakt wurde ausschließlich aus dA1 Neuronen Rhombomere 6-7, die in einer dorsalen funiculus verlängert sich ableiten, während die anderen entstand aus Rhombomere 2-5 und sich in einer seitlichen funiculus.

14,15. Ein Reporter Cre-bedingte myristoylierte-GFP (mGFP) Kassette zwischen den beiden Armen PB (PB-CAG-LoxP-STOPP-LoxP-mGFP-PB) geklont wurde bei E2.75 zusammen mit der Elektroporation ATOH1 :: Cre Enhancer und die Transposase Vektor (CAG :: PBase). Bei dieser Strategie wird die Cre-bedingten elektroporierten mGFP in die Küken Chromosomen integriert und damit die STOP-Kassette wird nur in dA1 Neuronen entfernt, so dass längere Expression von GFP in dA1 Zellen (Abbildung 1BII; ^10). Die myristoylierte Form der GFP Haltegurte an die Membran, so dass sie entlang der axonalen Membran anstatt im Zytoplasma lokalisiert ist, verdünnt. Brainstems wurden E13.5 gesammelt und analysiert in Sagittalschnitten (2B). dA1 Axone wurden gefunden, um im Kleinhirn zu sammeln und auf dem externen gr verlängern anular Schicht (EGL), die durch ZIC1 ⁺ Zellen gekennzeichnet ist.

Synaptic Ziele dA1 Axone im Kleinhirn wurden ebenfalls analysiert. E2.75 Embryonen wurden mit synaptischen Vesikel protein 2 (SV2)-GFP Reporterplasmids ^16,17, zusammen mit ATOH1 :: Cre-Enhancer und der PB Transposase (Abbildung 1BIII) Elektroporation. Dieses Verfahren ermöglicht die Expression des GFP-Reporters in den präsynaptischen Vesikeln dA1 axonal Termini. Das Kleinhirn war E13.5 geschnitten und gefärbt mit der allgemeinen präsynaptischen Marker synaptotagmin ^18,19 sowie mit Calbindin, die Purkinje Schicht (3A, 3B) beschriftet. SV2-GFP ⁺ synaptischen Vesikel wurden in mehreren Regionen des Kleinhirns, einschließlich der Purkinje Schicht nachgewiesen, was die synaptischen Verbindungen von dA1 hindbrain Interneuronen im Kleinhirn.

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Abbildung 1 (A) Illustration der Elektroporation Technik in E2.75 chick hindbrain (B) Schema der verwendeten Plasmide bedingt beschriften hindbrain dA1 Interneuronen; (I):.. Konstrukte umfassen die ATOH1 Enhancer-Element stromaufwärts nach Cre-Rekombinase cDNA geklont und eine bedingte Reporterplasmid, in dem ein Transkriptions-Stop-Kassette zwischen dem CAGG Enhancer / Promotor-Modul und der cytoplasmatischen GFP-Gen (CGFP) eingesetzt ist. . Die bedingte Expression von GFP in dA1 Neuronen wird durch ATOH1 :: Cre (II) angetrieben: Die Umsetzung PiggyBac Methode konstitutiv beschriften hindbrain Zellen. Konstrukte sind die ATOH1 :: Cre Enhancer Plasmid, ein Cre-bedingten Reporter Kassette, in denen myristoylierte GFP (mGFP) zwischen zwei Armen PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB) geklont wird, und eine Pbase Transposase Plasmid. DieIntegration des Reporter-Kassette in das Genom dA1 Neuronen wird durch den CAG :: PBase und ATOH1 :: Cre Vektoren angetrieben. (III): Ein ähnliches Verfahren zur Umsetzung PiggyBac synaptischen Ziele hindbrain Interneuronen beschriften. Die Cre-bedingten Reporterplasmids eine synaptische SV2-GFP zwischen zwei Armen PB (PB-LoxP-STOPP-LoxP-SV2-GFP-PB) flankiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Axonal Flugbahnen dA1 Interneuronen (A):. Ein Flachbild-montiert Herstellung von E4.5 hindbrain zeigt zwei aufsteigend dA1 axonalen Bahnen (grün, Pfeile). Die neurofillament Marker 3A10 (rot) wird verwendet, um Rhombomer Grenzen zu markieren. (B) einen sagittalenAbschnitt des Kleinhirns von E13.5 Embryo zeigt dA1 Axone (grün), der sich in das Kleinhirn. Die EGL-Zellen werden mit ZIC1 (rot) markiert. EGL, External Körnerschicht ist Maßstab Balken markiert.

Abbildung 3. Synaptic Ziele dA1 Interneuronen (A):. A Sagittalschnitt E13.5 Kleinhirn gebeizt Calbindin (pink) zu markieren Purkinje Schicht und DAPI (blau) zu kennzeichnen Kernen. (B). Eine höhere Vergrößerung Ansicht des markierten Bereichs in A. SV2-GFP-markierten dA1 Synapsen (grün) in der Purkinje Schicht des Kleinhirns (pink) dargestellt. Die allgemeine präsynaptischen Marker synaptotagmin (rot) mit SV2-GFP ⁺ Synapsen (gelb, Pfeile) co-exprimiert. Calb, Calbindin; S-Tag, synaptotagmin. Maßstab Balken markiert.

Discussion

In ovo Elektroporation ist eine praktikable, zuverlässige und wirksames Instrument, um Zellspezifikation und axonalen Wegfindung während der Entwicklung des Nervensystems chick ²⁰ zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir einen Modus der Elektroporation in das Küken hindbrain bei E2.75 mit Enhancer-Elemente, die die bedingte Kennzeichnung bestimmter Interneurone aktivieren. Diese Strategie wird mit dem PiggyBac-vermittelte Umsetzung System, um fremde Gene in das Genom Küken, die der axonalen Routen, Projektionen und synaptischen Websites Tracking ermöglicht bei fortgeschrittenen Stadien der Embryogenese Einsatz kombiniert.

Bisherige Verfahren zur Markierung von Axonen / Synapsen im chick hindbrain enthalten klassische retrograde oder anterograde Farbstoff Etikettieren oder Pfropfversuche ^21-23. Diese Studien trugen signifikante Ergebnisse auf hindbrain und absteigenden Axonen Traktate. Es wurden jedoch einige Bahnen und Projektionen von dieser zellulären Ansätze übersehen. In zusätzlich Ionen könnten molekulare Identität der Untergruppen von Neuronen, die in den berichteten funiculi projiziert nicht enthüllt werden. Unsere kombinierte Methode der Elektroporation und nachhaltig genetischen Tracing bietet die einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung der ausgewählten hindbrain Neuronen aus ihrer Spezifikation Stufen folgen, um axonalen Navigation und Projektion Ziele ^10. Bemerkenswerterweise wurde unser Ansatz bisher angewendet, um die Flugbahnen der axonalen Rückenmarks Interneurone für kürzere Zeiträume ^8,9 verfolgen.

Die beschriebenen Tools können auch dazu dienen, molekularen Mechanismen, die axonale Projektionen bestimmen, aufzudecken; Genetische Codes (wie die Lim homeo-domain-Code) wurden selektiv in einer bestimmten neuronalen Untergruppe mit dem modifizierten enhancer-Cre/Lox-based Ansatz und die Auswirkungen des axonalen Wachstums und Konnektivität wurde ^8,10 gefolgt. Daher kann dieses Protokoll nicht nur für die Zell-Kennzeichnung, sondern auch für genetische Manipulationen am gewünschten Zellen nützlich.

ve_content "> Einer der Vorteile der Elektroporation als in ovo Gentransfer-Methode ist die Schnelligkeit des Ausdrucks, die bereits innerhalb von 3 Stunden nach der Elektroporation ²⁴ beobachtet. Allerdings ist die transiente Expression des eingeführten Gens verklingt mit Zellteilungen in späteren Entwicklungsstadien Stufen. Um diese Einschränkung außer Kraft setzen wir nutzten die Umsetzung PiggyBac Verfahren zur in ovo Geninsertion. Dieses Werkzeug ermöglicht die Verfolgung von Axonen und Synapsen in einem robusten Weise für viel fortgeschrittenen Stadien nach der Elektroporation, im Vergleich zu bisherigen Methoden. Wie könnten wir leicht erkennen markierten Neuronen bis zu 12 Tage nach der Elektroporation (E14.5) ist es höchst plausibel, diesen Ansatz auch für längere Zeiträume, auch nach dem Schlüpfen zu verwenden.

Ein weiterer Vorteil der Küken Neuralrohr Elektroporation Relais auf der einseitigen Ausrichtung der Zellen in einem räumlichen und zeitlichen begrenzten Manieren. Dies ermöglicht Rückverfolgung axonalen Bahnen auf both Seiten des hindbrain in einer Schritt-für-Schritt Grundlage ist das schwieriger, in Säugetieren zu folgen. Dies ist vor allem, weil Keimbahn Transgenese Ergebnisse bei der Markierung von gewünschten Zellen in beiden Neuralrohrdefekten Seiten, verkompliziert die Möglichkeit, einseitige Projektionen zu verfolgen und zwischen dem Ursprung des ipsi und contra-lateralen axonalen Bahnen trennen. Letztlich auf dem hohen Grad an Homologie zwischen Mäusen und Küken Hirnstammneuronen ^3,5 basierend, bietet unsere Technik ein mächtiges Werkzeug, um neue Erkenntnisse über die Montage von Kabeln und Neuronen in den Entwicklungsländern Wirbeltier hindbrain gewinnen.

Wenn auch die Vorteile unserer Technik, um die Verwendung von Enhancer-Elemente bedingten Ausdruck der Reporter-Gene in das Küken Neuralrohr erfordert eine sorgfältige Auswertung für Zell-Spezifität und den Zeitpunkt der Expression der Enhancer-GFP-Konstrukte fahren; Einführung einiger Enhancer-Elemente wurden gefunden unser System zum Antrieb eines nicht beschränkten Expression von GFP in der hindbrain, während einigeandere ergab eine nicht-spezifische Expression zu früh, aber nicht zu spät, Neuralrohr Stufen (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus hat unsere Strategie unterstützt derzeit eine zeitliche Expression des Reportergens. Daher können wir nicht zwischen früh oder später geborenen Untergruppen von dA1 Interneuronen, die möglicherweise zu projizieren verschiedenen axonalen Bahnen zu unterschiedlichen Bereichen des Kleinhirns Ziel kann unterscheiden. Genetische Bau von zusätzlichen Tools, um zeitlich on / off schalten die Expression von GFP in hindbrain Neuronen von Vorteil sein wird, genauer zu verfolgen die Entwicklung von Axonen und Synapsen Flugbahnen in der embryonalen / Erwachsenen Hirnstamm. Schließlich ist ein technischer Nachteil unserer Strategie Elektroporation die Unzugänglichkeit des Embryos zu dieser Manipulation in den Stadien über E2.75-3 aufgrund seiner Position in dem Ei, Blutgefäße und Kuvertierung Membranen. Diese Einschränkung verhindert, dass die Ausrichtung unserer Plasmide in weitere Subtypen von Neuronen, die hindbrain später in der Entwicklung sind geboren.