Summary
Genetiskt kodade optogenetic verktyg gör icke-invasiv manipulation av specifika nervceller i
Abstract
Ett växande antal genetiskt kodade verktyg blir tillgängliga som tillåter icke-invasiv manipulation av den neurala aktiviteten av specifika nervceller i Drosophila melanogaster 1. Ledande bland dessa är optogenetic verktyg, som gör det möjligt att aktivera eller tysta specifika nervceller i den intakta och fritt rörliga djur med starkt ljus. Channelrhodopsin (ChR2) är en ljusaktiverat katjon kanal som, när den aktiveras av blått ljus, orsakar depolarisation av nervceller som uttrycker den. ChR2 har varit effektivt för att identifiera neuroner kritiska för specifika beteenden, t.ex. CO 2 undvikande, snabel förlängning och jätte-fiber-medierad reaktion vid oväntade yttre 2-4. Eftersom de intensiva ljuskällor som används för att stimulera ChR2 också stimulera fotoreceptorer, har dessa optogenetic tekniker inte tidigare använts i det visuella systemet. Här kombinerar vi en optogenetic förhållningssätt med en mutation som försämrar ljusöverledningen till demonstrate att aktivering av ett kluster av vävstol känsliga nervceller i flugans optiska lob, Foma-1 neuroner, kan köra en flykt beteende för att undvika kollision. Vi använde en nollallel av en kritisk komponent i ljusöverledningen kaskad, till fosfolipas C-β, som kodas av norpA genen, göra flyger blinda och även använda Gal4-UAS transkriptionsaktivator för att driva uttryck av ChR2 i Foma-1 neuroner. Enskilda flugor placeras på en liten plattform omgiven av blå lysdioder. När lysdioderna är tända, den flyger snabbt start till flygning, på ett sätt som liknar visuellt driven vävstolen-fly beteende. Vi tror att denna teknik lätt kan anpassas för att undersöka andra beteenden i fritt rörliga flugor.
Introduction
En växande arsenal av genetiskt kodade verktyg har tagits fram för att manipulera neural aktivitet i specifika celler i Drosophila melanogaster 1. Dessa verktyg möjliggör den icke-invasiv aktivering eller tysta specifika nervceller i den intakta och fritt rörliga djur. Bland dessa finns Channelrhodopsin2 (ChR2), en ljusaktiverat katjon kanal, viktiga fördelar, eftersom den kan temporärt kontrolleras och snabbt induceras. När nervceller som uttrycker ChR2 utsätts för klarblå (470 nm) ljus de snabbt depolarisera och uppvisar förhöjda bränning priser 3-5. Sådan riktad aktivering av specifika nervceller i fritt rörliga djur har visat tillräcklig särskilda nervceller för beteenden som CO 2 undvikande 3, snabel förlängning 2,4, och jätte-fiber förmedlade svar skrämmer 4. Men eftersom de intensiva ljuskällor som behövs för att stimulera ChR2 också stimulera fotoreceptorer, tillämpa optogenetic tekniker till det visuella systemet har varit begränsade. Genom att kombinera en optogenetic förhållningssätt med en mutation som försämrar ljusöverledningen har vi visat att aktivering av en specifik grupp av nervceller i flugans optiska loben kan driva fly beteende används för att undvika kollision 6.
De flesta, om inte alla, visuella djur uppvisar en flykt beteende för att undvika kollisioner med mötande objekt. Promenader eller stillastående flugor, när du presenteras med en hotande kollision, start i flykt, bort från mötande kollisionen 7-9. Dessa starter kännetecknas av upphöjda vingar före start och en instabil flygning bana 10,11. Detta svar skiljer sig från jätte-fiber-medierad reaktion vid oväntade yttre, hopp som inte föregås av upphöjda vingar, och oftast resultera i en fritt fallande tumla 4,9. Efter att ha identifierat en specifik grupp av vävstol känsliga nervceller i den optiska lob, Foma-1 neuroner, som är uniquely inställd att koda närmar föremål, försökte vi att undersöka deras deltagande i flugans Loom fly beteende. Här visar vi att använda optogenetics att selektivt aktivera dessa nervceller och framkallar flugan flykt beteende.
Vi använder Gal4-UAS transkriptionsaktivator systemet för att driva expressionen av ChR2 i Foma-1 neuroner. ChR2 kräver kofaktor all-trans-retinal och eftersom detta finns i låga nivåer i Drosophila centrala nervsystemet måste den kompletteras flugorna "kost. 3,4 Som starkt ljus används för att aktivera ChR2 och flugor uppvisar starka phototactic beteenden 12, försökte vi att eliminera möjligheten av en visuell respons till stimulansen. För att göra detta använde vi djur som var homozygot mutant för en noll-allel av norpA genen, som kodar för en kritisk komponent i ljusöverledningen kaskaden, fosfolipas C-β. Fotoreceptorer i sådana muterade flugor kan inte ansvad för ljus 13. För att testa optogenetic stimulering av flykt svar, måste vi isolera en enda fluga och bada den i starkt blått ljus. För att göra detta lägger vi individuella flugor i pipettspetsar. Ett pipettspetsen placeras i en anpassad hållare, så att flugan geotactically kommer att gå upp spetsen och ut på en rektangulär plattform. Flugan kan fritt gå runt på toppen av denna plattform. Plattformen är omgiven av fyra LED blå arrayer, vardera innehållande 3 lysdioder, fokuserade på toppen av plattformen. Efter fluga är på plattformen är lysdioderna lyser, och flugan svar registreras med hjälp av en höghastighetskamera 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera Channelrhodopsin Flugor
- Cross UAS-ChR2 flugor med Gal4 förare som du väljer, använder vi G105-Gal4, som uttrycks i Foma-1 nervceller i optiska lob.
- För att eliminera möjligheten av en visuell respons på blått ljus stimulering båda fluglinor är i aw + norpA bakgrund.
- Slutresultat: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Efter vuxen flyger eclose, sätta utvalda kvinnor på färsk mat, kompletterat med 10 M all-trans-retinal (en co-faktor som krävs för ChR2) och skyddas från ljus, i 3 dagar innan du utför beteende analys.
2. Gör 10 M All-trans-retinal Förbättrad Food
- Lös 100 mg av all-trans-retinal i 17,6 ml 95% etanol för att göra 20 mM retinal. Håll all-trans-retinal skyddas från ljus i alla lägen.
- Smält vanlig mat majsmjöl flyga i mikrovågsugn, och låt svalna tills varm vid beröring.
- Blanda 50 pl av 20 mMall-trans-retinal till injektionsflaskor med 10 ml flyga mat.
- Låt flaskorna svalna och hålla skyddas från ljus.
3. Utrustning
- Pipettspetsar: Standard 1.000 il pipettspetsar skärs nära spetsen, skapar en pordiameter av ~ 2,25 mm.
- Plattform (se figur 1).
- En Delrin bas, var 17 cm x 25 cm, konstruerad med gängade hål i varje hörn för att passa ¼ "NPT kylvätskeslangen kontakter.
- En vertikal hållare, tillverkad av Delrin, är fäst till centrum av basen. De totala mått är 25 mm x 40 mm x 65 mm (bredd x djup x höjd). En 10 mm bred skåra löper längden av hållaren, med en vingskruv vid botten. En plattform är fäst till toppen av hållaren, 25 mm x 40 mm X 10 mm, med en 3,5 mm diameter hål i linje med spåret i hållaren.
- LED-matriser (se figur 1).
- Fyra armar kylvätskeslangen, ~ 18 cm långa, är fästa vid plattformen base med kontakten kylvätskeslangen. Kylvätskeslangen används endast som strukturellt stöd och används inte för kylning.
- Korrekt åtskilda spår skärs i den slutliga delen av kylvätska slang av varje arm att fästa en kylfläns till slutet av varje arm.
- En blå LED Rebel Tri-Stars är monterad på varje kylfläns med färdigskurna termisk tejp. En Carclo 18 ° Tri-objektiv fästas på varje Tri-Star.
- LED Tri-Stars är kopplade till BuckPuck DC drivrutiner och en strömförsörjning som anges. Vi har ordnat vårt upplägg med varje BuckPuck driver två Tri-Stars i serie.
- Belysning av alla fyra LED Tri-stjärnor på 700 mA gav en irradians på 713 W / m 2 på vår plattform.
- Kamera: Kameran är monterad på en liten stativ och fokuserade på toppen av plattformen.
4. Behavioral analys
- Kortfattat bedöva flugor på is.
- Placera enskilda flugor i pipettspetsar, med tejp för att stängabåda ändarna av spetsen.
- Efter flugorna har vaknat och aktivt utforska pipettspetsen, ta bort tejpen och placera en pipett i spåret i vertikal hållare. Vingskruven används för att fästa pipettspetsen på plats och stänga bottnen av spetsen.
- Som flugan utforskar pipettspetsen (typiskt 30 till 60 sekunder), starta kameran inspelningen strax innan flugan kommer ut ur spetsen på plattformen.
- Efter att flugan har uppstått på plattformen, vänta 1-2 Seco och slå på den blå lysdioder. Använd en timer för att manuellt mäta tiden tills flugan initierar flygningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blind flyger som antingen uttrycker ChR2 eller G105 föraren ensam visar en låg start efter deras belysning med ljus blå ljus. Blind flyger uppvisade samma andelen start oavsett belysning (figur 2), vilket tyder på att dessa starter var spontana snarare än på grund av belysning med blått ljus. När ChR2 uttrycks i Foma1 neuroner, emellertid, framkallar belysning med blått ljus escape responsen. Över 50% av de testade flugor lyfte inom 1 sek av belysning, och 75% inom 5 sekunder (Figur 2). Däremot tog bara 10% av kontroll flugor av inom 1 sek, och 20% inom 5 sek. Då G105 drivrutin uttrycks både i Foma-1 neuroner och i γ-lob av svamp kroppen använde vi en förare som särskilt uttrycks i denna del av svamp kroppen (201Y-Gal4) som en ytterligare kontroll. Dessa flugor uppvisade en hastighet av start liknande de andra utförda kontroller (figur 2), Vilket indikerar särskilt att optogenetic aktivering av Foma-1 neuroner framkallade flykt svar.
Hög hastighet avbildning tas vid 200 bilder per sekund av de optogenetically inducerade svaren visade att dessa svar liknade vävstolen-framkallade fly beteende (Figur 3). Nämligen filmade 90% av flugor höjt sina vingar före start (n = 30) 6. Vidare var den efterföljande flygningen bana mindre stabila än frivilligt starter 10, med flugans kropp är i en något vertikal orientering (figur 3), men mer stabil än jätte svar fiber medierade 9.
Figur 1. Experimentell uppställning visar plattformen med den vertikala hållaren och fyra kylvätska spolning armar håller kylflänsar med LED-matriser fästa vid dem. EN, Uppställningen under omgivande belysning. B uppställningen när lysdioderna är tända. C, en närbild av en Tri-Star LED på kylflänsen. D en närbild av Tri-Star med tri-objektiv monterat. E, en schematisk bild av Buckpuck Driver och LED-krets. F, kopplingsschema för BuckPuck och LED-krets.
Figur 2. Kumulativ histogram tid att fly hoppa för försök och kontroll fluglinor. Alla flugor Express w + norpA att göra dem visuellt blinda. "Foma-1" flugor har G105-Gal4 föraren, "MB" flugor har 201Y-Gal4 drivrutin som driver uttryck i svamp kroppen.
Figur 3. Höghastighetsinternet bildrutor på ChR2 inducerade flykt svar. Ramar är numrerade efterföljandeially med 5 ms mellan ramar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat optogenetic stimulering av escape beteenden genom att bada fritt gå flugor i starkt blått ljus. Detta tillvägagångssätt kan enkelt anpassas för att undersöka andra beteenden i fritt promenader flugor, och kan skalas till större plattformar genom att helt enkelt tiling LED matriser vi använde över ett större område. Med antingen billig kamera vi beskriver, eller andra tillgängliga system kamera kan användaren skräddarsy bildhastigheten och rumsliga upplösningen i bilderna som förvärvats för att passa beteendet av intresse. Dessutom är vår avbildning begränsad till tiden efter lysdioderna lyser, eftersom den blå LED ger belysning för kamera samt aktivering av ChR2. Detta är tillräckligt för vårt beteende, men om positionen eller rörelsen av flugan innan LED-belysning måste registreras, skulle ytterligare ljuskällor tillhandahåller signaler i det infraröda området, i kombination med lämplig filtrering av kameran, införlivas.
_content "> Optogenetics allmänt har hyllats som ett icke-invasivt sätt att manipulera neurala aktiviteten. Ändå har denna teknik varit i stort sett otillgängliga för det visuella systemet som ljuset används för att aktivera ChR2 kommer även aktivera visuella vägar. Dessutom användningen av optogenetics att undersöka icke-visuella beteenden kan också hämmas av flugor "phototactic svar på starkt ljus. Användning av norpA flugor som är visuellt blinda kan vi använda optogenetic verktyg i det visuella systemet, och förhindrar phototaxis från förmörkar andra beteenden.Detta protokoll kräver att ChR2 uttryckas i neuronerna av val, att flugorna matas all-trans-retinal, samt att flugorna badas i starkt blått ljus. Protokollet vi utvecklat har mött dessa krav, men har inte helt optimerad. Till exempel, tror vi att mängden ljus som vi använder kan vara ljusare än nödvändigt, och att en högre koncentration av all-trans-retinal, eller längre matning Timig, kan resultera i en högre start. Vi har inte systematiskt undersökt dessa parametrar.
De Foma-1 neuroner vi aktiverar finns i lobula komplex av fluga, och är därmed beläget nära den bakre ytan av hjärnan. Det är möjligt att framgången för detta experiment bygger på nervceller är nära ytan, som ljuset måste tränga igenom flugans nagelband att aktivera ChR2. Sålunda kan celler belägna djupare i hjärnan inte framgångsrikt aktiveras med denna metod.
Den G105 Föraren uttrycks i ett kluster av 5 neuroner på vardera sidan av den optiska lob, den Foma-1 neuroner, såväl som i neuroner i γ-lob svamp kroppen. Lyckligtvis hade vi en drivrutin för att göra kontroll experiment för att eliminera en roll svamp kroppen nervceller i flykt beteende. Men aktivering av alla 10 Foma-1 neuroner om krävs för detta beteende, eller om det bara är en eller tvåspecifika celler är tillräckliga, inte kan fastställas vid denna tidpunkt. När fler specifika drivrutiner utvecklas och intersektionella strategierna för att begränsa uttryck förfinas 1,14, räknar vi med att kunna rikta nervceller med större specificitet.
Kryptokromer är fotoreceptorer inblandade i dygnsrytmen och beteenden som är känsliga för blått ljus. I detta protokoll används kryptokromer troligen aktiveras av blått ljus som används för att stimulera ChR2. Detta verkar inte påverka start beteende observerades här, eftersom den låga start observerats i kontroll flugor (för vilka det blå ljuset aktiverar kryptokromer men inte ChR2 i Foma-1 neuroner) tätt matchar utnyttjandeandelen -off observerats i kontroll flyger utan belysning eller vid belysning med grönt ljus (som inte aktiverar kryptokromer). För andra beteenden som är mer direkt påverkade av kryptokromer kan detta visa sig vara problematiskt. En potentiellförbättring undvika detta kan vara användningen av en röd-skiftad channelrhodopsin som aktiveras av gul, 589 nm, ljus 15.
I våra experiment observerade vi en låg nivå av spontan starter så att ~ 10% av kontroll flugor tog fart inom 1 sek av LED belysning, och 13-28% inom 5 sek. När vi observerat samma hastighet på start när flugorna var upplyst med grönt ljus som inte effektivt aktiverar ChR2, liksom flugor utan belysning, anser vi att dessa var spontana flygningar mer än ljuset inducerade starter. Effekten av ChR2 aktivering av Foma-1 neuroner på flykt beteende måste därför mätas på toppen av denna spontana aktivitet. För andra beteenden som inte innebär start, dock kan detta resultera i avslutade prövningar om flugor fly från plattformen innan genomförandet av testade beteende. I vilken utsträckning dessa spontana rymningar utgör en experimentell olägenhet är Obviously beroende tidsplan av beteendet av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en Stanford Dean Fellowship (SEJdV), en National Institutes of Health direktörens Pioneer Award (TRC DP0035350), en McKnight Foundation Scholar Award (TRC) och R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
