Un protocolo para el análisis del ciclo celular en vivo de Drosophila Tejidos usando la Acoustic Attune citómetro de enfoque se describe. Este protocolo proporciona simultáneamente información sobre el tamaño relativo de células, el número de células, y el tipo de contenido de ADN celular a través de rastreo de linaje o expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes In vivo.
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Resumen
Resumen
La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para obtener información sobre el contenido de ADN en una población de células, para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular. Esta técnica se ha ampliado con éxito a los tejidos mitóticas del organismo modelo Drosophila melanogaster para los estudios genéticos de la regulación del ciclo celular in vivo. Cuando se combina con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico y manipulaciones genéticas, se puede obtener información detallada acerca de los efectos sobre el número de células, el tamaño celular y el ciclo celular en la eliminación in vivo. Sin embargo este método en vivo de células se ha basado en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante, limitar a los usuarios a citómetros de flujo equipado con un láser UV. Hemos modificado este protocolo para utilizar un tinte más reciente en vivo de células de ADN, Vybrant DyeCycle Violet, compatible con el láser violeta 405nm más común. El protocolo presentado aquí permite el análisis del ciclo celular eficiente junto con célulastipo, tamaño relativo de células y la información de número de células, en una variedad de tejidos de Drosophila. Este protocolo se extiende la técnica útil para el análisis del ciclo celular de Drosophila tejidos en vivo para un pequeño analizador de sobremesa, la acústica Attune citómetro de enfoque, que puede ser gestionado y mantenido en una escala de laboratorio-único.
Introducción
La citometría de flujo puede ser utilizado para las mediciones de la viabilidad celular, tamaño de la celda relativa, contenido de ADN y la expresión de la proteína fluorescente en las poblaciones de células vivas. Debido a la replicación de ADN nuclear durante la fase S, la información sobre el contenido de ADN en una población de células puede ser usado para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular 1-3. Este método se ha convertido en una piedra angular del análisis del ciclo celular en sistemas modelo de la levadura a los mamíferos.
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha conver....
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Protocolo
1. Fly Ganadería
- Cruz vuela de genotipos deseados en viales de plástico estrechas con 10 ml de levadura-glucosa Medio 3 u otros medios de comunicación ricos en proteínas de su elección. Las amplias herramientas de Drosophila transgénicas disponibles para la expresión específica de tejido y el linaje en el rastreo con expresión de la proteína fluorescente in vivo se describen en detalle en otra parte 4,5. Transfiera los padres a viales frescas todos los días para obtener una serie de 24 colecciones progenie hora, o para la estadificación más precisa, recolectar embriones en placas de agar y la transferencia d....
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Resultados
La Figura 2 muestra los resultados representativos de una muestra de ala larvas, que expresan GFP en la mitad posterior del tejido, usando la plantilla proporcionada GFP. Se obtienen resultados similares con el mismo tipo de tejido y el patrón de expresión de RFP usando la plantilla proporcionada RFP (Figura 3A). Las plantillas y los voltajes suministrados (Tabla 2) son adecuados para el análisis de los ojos de larvas (Figura 3B), cerebros y las alas, así como los ojos .......
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Discusión
El protocolo se describe aquí permite el análisis de ciclo celular, tamaño de celda relativo y el número relativo de células en los tejidos de Drosophila en directo en diversas etapas de desarrollo. Cuando este análisis se acopla con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico o linaje de rastreo, la información detallada se puede obtener sobre las respuestas celulares a ciclo celular discreta o perturbaciones de crecimiento. Como prueba de principio, hemos desbaratado quiescencia en el c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Aida de la Cruz para el desarrollo y la enseñanza del protocolo original en que se basa esta versión 10. El trabajo en el laboratorio Buttitta está apoyado por el NIH GM086517.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 12x75 mm Poliestireno de fondo redondo 5 ml Tubo de ensayo | BD Falcon | 352058 | tubos de 5 ml | ||||||||||||
| Citómetro de enfoque acústico Attune | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | configuración Azul / Violeta | ||||||||||||
| Software de citómetro Attune (versión 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC solamente | ||||||||||||
| Perlas de seguimiento de rendimiento Attune (5 x 106 perlas/ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | Para la prueba de rendimiento diaria | ||||||||||||
| Pinzas de acero inoxidable Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |||||||||||||
| Placas de embriones 30 mm x 12 mm | Microscopía electrónica Sciences | 70543-30 | Placas de disección de vidrio | ||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf 022670051 | ||||||||||||||
| Solución de tripsina-EDTA (10x) | Sigma | T4174 | |||||||||||||
| Vannas-Tü bingen Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | ||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | |||||||||||||
| Tabla 1. Reactivos e instrumentos necesarios. | |||||||||||||||
Solución de tinción de ADN vivo (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ PBS libre (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ PBS libre (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibásico), 20mM KH2PO4 (monobásico) ajustado al pH 7.2 | |||||||||||||||
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Referencias
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J.
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Reimpresiones y permisos
