Summary
En skada paradigm med Drosophila larver ventrala nerv sladd för att undersöka centrala nervsystemet förnyelse och reparation beskrivs. Stickande följt av laserskanning konfokalmikroskopi i tid-lapse och fast prover, i kombination med kvantitativ analys med målmedvetet utvecklat programvara och genetik, används för att undersöka de molekylära mekanismerna för CNS-förnyelse och reparation.
Abstract
En experimentell metod har utvecklats för att undersöka de cellulära svar på centrala nervsystemet (CNS) skada med frukt-fly Drosophila. Förstå reparation och förnyelse hos djur är en viktig fråga i biologi. De skadade människor CNS inte regenerera inte, och förstå hur man kan främja förnyelse är en av de viktigaste målen för medicinsk neurovetenskap. Den kraftfulla genetiska verktygslåda av Drosophila kan användas för att hantera problemet med CNS-förnyelse.
En skada till CNS-ventrala nerv sladd (VNC, motsvarande ryggradsdjur ryggmärgen) appliceras manuellt med en volfram nål. VNC kan därefter filmas i tidsförlopp med laserskanning konfokalmikroskopi för upp till 24 timmar för att följa utvecklingen av lesionen över tiden. Alternativt, kan den odlas, fixerades därefter och färgades med användning av immunofluorescens att visualisera neuron och gliaceller med konfokalmikroskopi. Med användning av lämpliga markörer, changes i cellmorfologi och cell tillstånd till följd av skada kan visualiseras. Med ImageJ och medvetet utvecklat plug-ins, kan kvantitativa och statistiska analyser genomföras för att mäta förändringar i sårets storlek över tid och effekterna av skada i cellproliferation och celldöd. Dessa metoder tillåter analys av stora provstorlekar. De kan kombineras med de kraftfulla genetiska Drosophila för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom CNS-förnyelse och reparation.
Introduction
Regenerering i djur visar att celler känna av när organismen tillväxt beställs och fullständig, och hur strukturell integritet hos en organism uppnås och bibehålls. Att förstå dessa mystiska förmågor celler är av stort intresse för biologi. Främja förnyelse är en av de viktigaste målen för medicinsk neurovetenskap. Hos människor, inte regenerera det skadade centrala nervsystemet (CNS) inte. Gnagarmodeller av ryggmärgsskada används för att förstå hur celler svarar på skada. Men etiska frågor, höga kostnader och den långsamma livscykel djuren begränsar utvecklingen.
Frukten-fly Drosophila är en allmänt använd modell organism i utvecklingsbiologi och neurovetenskap. Tack vare dess kraftfulla genetiska verktyg och kort livslängd, har Drosophila ledde återkommande till upptäckten av genfunktioner och nätverk gen med relevans för förståelsen av människan och sjukdomar. Det finns rikliga bevis för evolutionär konbevarande av geners funktion från flugor till människor.
Under de senaste åren har flera paradigmer för nervsystemskada etablerats i Drosophila. Vissa består av skada perifera nerver som löper längs vingen eller axotomin av perifera nerver, bland sensoriska 1 och motorn axoner 2. Emellertid, de perifera och centrala nervsystemen skiljer sig åt i många avseenden, och det är väl känt att i många djur det perifera nervsystemet kan regenerera medan CNS kan inte. Således, för att förstå CNS-regenerering, direkt skada på CNS är mer lämpligt. Stickande skada med en nål har framgångsrikt tillämpats på Drosophila vuxen hjärna att undersöka svaret på skada 3,4. Använda en annan metod, analyserade Ayaz et al. Avhuggna CNS axoner i odlade vuxna hjärnor med Piezo effekt microdissector och deras förnyelse i 4 dagar 5. Fördelen med dessa senare experimentell uppsättning ups är att de fokuserar på hjärnan, som utan tvekan är av stort intresse. Nackdelen är att hjärnan är mycket mer komplex än VNC, som endast behandlar motorisk och sensorisk kontroll. Arbeta på den vuxna hjärnan är också mer tidskrävande. Larven är redo för experiment i 4 dagar, medan det tar ca 10 dagar för vuxna eclosion och sedan ytterligare 5 dagar för deras mognad. Den vuxna hjärnan är också svårare att hantera, eftersom den är inkapslad i tjocka nagelband, som är svår att avlägsna. VNC har den ytterligare attraktion att vara funktionellt ekvivalent till ryggradsdjuret ryggmärgen.
Drosophila larv används allmänt som en modell organism för neurovetenskap 6-9. Även egentligen larven är i en utvecklingsfas, kan det också vara en fullt fungerande djur. Larven har förflyttning, flera sinnen inklusive luktsystemet, smak och nociception samt inlärning och minne. Således larver VNC wsom valts som den idealiska modellen för CNS-skada.
Larver och pupal VNCs kan dissekeras och odlas i skålen, fortfarande bibehåller cellulär integritet under upp till 24 timmar 10. Detta antydde att skada skulle kunna tillämpas på VNC, som sedan kan registreras i tidsförlopp för över denna tidsperiod, eller odlades och fixerades vid varje önskad tidpunkt under denna period.
Här presenterar vi en experimentell paradigm för CNS-skada med Drosophila larver VNC. VNC först dissekeras från larv och stickande skador appliceras manuellt med en volfram nål. VNC placeras sedan på en glas-botten täckglas, och filmade med tidsförlopp laserskanning konfokalmikroskopi. Alternativt kan VNCs odlas under en önskad tidsperiod, och de cellulära effekterna av skada kan analyseras i fasta prover med immunfärgning och konfokalmikroskopi. Sårområdet kan mätas, och kvantitativ analys av cellens Number (cellproliferation och celldöd) kan utföras med avsiktligt utvecklad mjukvara. Stora provstorlekar kan lätt hanteras, vilket resulterar i statistiskt validerade resultat. Dessa metoder har framgångsrikt kombinerat med de kraftfulla genetik av Drosophila att upptäcka en gen nätverk bakom glia regenerativa responsen på CNS-skada 11.
Protocol
1. Insamling av Stegvis Larver
- Placera 15 kvinnliga och 15 manliga flugor vuxna i en cylindrisk Perspex bur att lägga ägg i en petriskål med agar och druvsaft kompletteras med en liten skopa av jäst pasta för 3 timmar vid 25 ° C. Ändra plattan 3-4 gånger om dagen, och kasta den första plattan (dvs från O / N ägg-Lay). Kasta även plattorna från första dagen. Från den andra dagen, hålla plattorna med ägg vid 25 ° C. Efter 7 dagars samla ägg, börja med en ny uppsättning av förälder flugor.
- Efter ca 24 timmar, larver kläcks ur äggen. Genom att haka larver med en förtunnad pensel eller med en pincett, överför 35 larver från druvan agar till en flaska innehållande vanlig fluga mat (10 ml) (Figur 1A).
- Bibehålla flaskorna innehåller larver i 3 dagar (96 timmar efter äggläggning, AEL) vid 25 ° C.
2. Dissekering av larver Ventral Nerve Anslutningskabel för kultur
- Rengör varaNCH och händer med 70% etanol. Blötlägg 4 färgning block, 2 par pincett och en nål med 70% etanol, och låt lufttorka.
- Förbered 4 färgning block med följande media: en med destillerat vatten (DW) för att rengöra och poolen rengöras larver, en andra med 2 ml Shield och sjöng M3 insekt medium med 1% penicillin och streptomycin, ekdyson-fria (M3 PS medium) för att dissekera larverna, tredjedel med 2 ml M3 PS medium till poolen dissekerade ventrala nerv sladdar (VNCs) och kvart med 2 ml M3 PS-medium att sticka de VNCs. Alla reagens måste förvärmas till RT.
- Tillsätt vatten till injektionsflaskan innehållande 96 tim AEL larver. Därefter, genom att använda en spatel, försiktigt sprida mat med larver från flaskan på en våt pappershandduk. Överför 10 larver till en färgning block som innehåller DW att tvätta bort maten. Byt DW 6 gånger. Sedan ersätta med M3 PS medium.
- Överför en av larverna till en färgning block som innehåller 2 ml M3 PS medium.
- Under ett dissektionsmikroskop, di-ssect en larver hjärna noggrant med användning av standardmetoder 12, men för att minimera vävnadsskador, var särskilt försiktig genom att gå på följande sätt. Placera sidan larven rygg uppåt, och håll ryggsidan vid tredjedel från den främre änden med 2 par pincett (en i varje hand). Samtidigt håller den främre delen, dra bort den bakre änden med pincett, och riva epidermis. Hjärnan och VNC bör vara synlig från den bakre kanten av den främre halvan. Försiktigt isolera hjärnan och VNC komplex genom att ta bort fett kroppen, tarm och epidermis. När VNCs skadas för mycket kommer VNCs urarta helt eller delvis även utan stickande skador. Ta hänsyn till följande punkter:
- Dra inte eller riva de imaginal skivor och perifera nerver från bröst VNC eftersom detta kommer att skada VNC. Att skära perifera nerver, håll de perifera nerverna med två par pincett placeras nära varandra, och sedan dra nerverna med förCEPS. Imaginal skivor och delar mun kan lämnas kvar i VNC.
- Lämna ringen körteln och lymfkörtelområde fäst till hjärnan.
- Skär tarmen vid den punkt som är närmast hjärnan, där inte mycket mat finns.
- Genom att använda en P20 Pipetman med spetsen avskuren och vidgade lite, överföra VNC till en färgning block som innehåller färskt M3 PS medium. Innan överföring VNC, första pipett upp och ned endast mediet som används för dissektion för att förhindra VNC fastnar till spetsen.
3. Stickande Skada på Drosophila larver VNC
I det här avsnittet beskrivs hur du utför stickande skada på VNCs, och att förbereda knivhögg-VNCs för time-lapse analys och immunfärgning. Post-stickande odlingsbetingelser och varaktighet beskrivs i avsnitt 5 (för time-lapse analys) och i avsnitt 6 (för immunfärgning).
- Efter sammanslagning tillräckligt VNCs (4-5 för time-lapseoch över 24 för immunfärgning), överför en VNC till en ren färgning block med M3 PS.
- Orientera VNC så att ryggens neuropile är med tanke under dissekera mikroskop (Figur 1B). Detta är det mest naturliga orienteringen för VNCs att ligga i när den är bunden till de optiska lober.
- Stab med manuellt en volfram nål under dissektion mikroskop från ryggsidan nästan i rät vinkel och siktar på buken halvan av VNC (Figur 1B).
Var särskilt uppmärksam på följande:
- Stab endast en gång.
- Stab tills nålen träffar botten av glaset. Men var noga med att inte skada nålspetsen.
- Stammen av nålhållaren får inte röra mediet under stickande.
- Såret är inte synlig under dissektion mikroskop.
Obs: Stab-skada obesläktad degenerering
Förfarandetkan resultera i cellulär degeneration inom VNC distinkt från stickande lesionen. Degeneration resulterar i hål i neuropile, och ibland hål har observerats i cortex av icke-stucken prover. Prover med degeneration påverkar neuropile eller omfattande degenerering påverkar också VNC ytan måste kasseras. Degeneration kan identifieras enligt följande:
- Grov yta, särskilt vid den laterala / ventrala delen av bröstkorgen, vid 22 h av huggande. I extrema fall, ser VNC stack.
- Hål eller vakuoler i bröstkorg neuropile, som kan vara synliga som hål i bakgrunden signal med fluorescens immunfärgning.
4. Underhåll av nål och pincett
- Rutinmässigt kontrollera om nålspetsen är vass nog. Nålspetsen kan vara böjd eller trubbig efter att ha använt det i flera experiment. I detta fall, skärpa spetsen med en Arkansas sten eller motsvarande.
- Spetsarna på pincetten måsteträffas perfekt. Tipsen kan skadas vid användning. I det här fallet, justera spetsen med en Arkansas stenar eller motsvarande.
5. Kultur och Time-lapse inspelning av knivhuggen VNCs
För att visualisera axonal neuropile i den levande VNC, ett GFP-proteinet fälla linje som märker alla axoner - G9 13 - kan användas, och att visualisera alla gliaceller (utom mittlinjen Glia) den gliaceller förare repoGAL4 kan användas för att uttrycka UASdsRed S197Y 14 reporter. Genom att korsa G9 flyger till UASdsRedS197Y,, repoGAL4 flugor är VNCs från avkomma larver erhållits med gröna axoner och röda glia som kan spelas in i levande vävnad.
- Efter pooling 4-5 VNCs uppgav överföring 1 VNC till en ren färgning block med 2 ml M3 PS och sticka buken halvan av VNC i avsnitt 3.
- Överför knivhuggen VNC till en poly-L-lysin belagda 3,5 mm glas botten petriskål innehållande 1 ml M3PS. Placera VNCs ryggsidan nedåt. Tryck försiktigt VNC med den platta sidan av en pincett så att VNC att hålla sig till skålen.
- Försiktigt Tillsätt 1 ml M3 PS 15% FBS gör den slutliga koncentrationen av FBS till 7,5%.
- Acquire bilder med laserskanning konfokalmikroskopi. Skanna VNC, samla en Z-sektion serien hela dess tjocklek. Vi använde en Leica SP2 inverterat konfokalmikroskop med en temperaturstyrd miljökammare. Någon motsvarande konfokalmikroskop bör fungera, men det kan kräva optimering av inställningarna för skanning. Inställningarna för vår tidsförlopp konfokalmikroskopi var följande: temperatur miljökammare: 25 ° C, 20X objektiv med 4 gånger zoom, skanningsläge xyzt, med 512x512 pixlars upplösning, z = 1 pm steg och 1-timme eller 2 - timmars mellanrum.
- Leica SP2 konfokalmikroskop har en begränsning i filstorlek för skanning. Med dessa inställningar kan 8-9 tidpunkter ska skannas. Medandra konfokala mikroskop, borde det vara möjligt att få bildstaplar längre tidpunkter, dvs under loppet av upp till 24 timmar.
6. Kultur och immunfärgning av knivhuggen och Fast VNCs
- Bered en 24-brunnsplatta vävnadsodling innehållande 500 pl av M3 PS 7,5% FBS per brunn.
- Upprepa dissektion av mer än 24 VNCs för en 24-väl vävnadsodlingsplatta.
- Genom att använda P20 Pipetman med spetsen avstängning, överför 12 icke-knivhuggen VNCs från poolen till kultur skålen, med 1 VNC per brunn.
- Stab resten av VNCs i poolen som beskrivs i avsnitt 3. Överför varje knivhögg VNC till en väl varje.
- Placera 24-brunnars skål i 25 ° C inkubator under en önskad tid, beroende på experimentet. Cell integritet är oförändrad i minst 24 timmar.
- Efter odling, överföra 12 VNCs i 250 ul 4% formaldehyd PEM i en 1,5 ml rör med hjälp av P20 Pipetman med spetsen avstängning. Därefter fixative är noga pipetteras ut och var noga med att inte skada VNCs. En liten mängd fixativ är tillräcklig för att täcka proven bör förbli i varje rör. Tillsätt därefter frisk fixativ, och försiktigt skaka i 50 minuter vid RT.
- Skölj 2 gånger med 0,3% Triton X PBS, och sedan tvätta 2 gånger under 10 minuter med 0,3% Triton X PBS vid rumstemperatur.
- Block VNCs genom inkubering med 10% normalt getserum i 0,3% Triton X PBS under 1 h vid RT. Proverna kan förvaras vid 4 ° C under minst en månad.
- Inkubera VNCs med primära antikroppar för mer än 20 timmar vid 4 ° C.
- Skölj 2 gånger med 0,3% Triton X PBS, sedan tvätta 3 gånger i 10 min med 0,3% Triton X PBS vid rumstemperatur.
- Inkubera VNCs med sekundära antikroppar under mer än 16 timmar vid 4 ° C.
- Skölj 2 gånger med 0,3% Triton X PBS, sedan tvätta 3 gånger i 10 min med 0,3% Triton X PBS vid rums RT (i mörker vid användning av fluorescerande sekundära antikroppar).
- Ersätt PBS med 50% glycerol: 50% PBS under åtminstone entimme.
- Sedan ersätta med 80% glycerol: 20% PBS i minst en timme.
- Montera en VNC i ett fönster gjord på 2 lager av cello-tape (ca 0,06 mm) på en mikroskopi glasskiva. Justera riktningen och placera ett täckglas (18x18 mm) över fönstret. Två VNCs kan monteras på ett objektglas med denna metod.
Med hjälp av olika primära antikroppar, till skada olika cellulära svar kan analyseras (t.ex. ändringar i antalet celler och cell form).
7. Analysera data med ImageJ och en rad Plugins
Om VNC inte har stickande samband degeneration, måste provet räknas in för analys, oavsett lesionsstorlek. Som stickande görs manuellt, skiljer sig lesionsstorleken varje gång. Således är det viktigt att analysera statistiskt effekten av stickande, när så är möjligt.
- Wound storlek mätning. Storleken på såret är en indikator på reparation 15.Den stickande lesionen syns som saknar GFP uttryck. Skadeområdet kan mätas lapse data med fritt tillgängliga ImageJ programvara, enligt följande:
- Med hjälp av ImageJ, öppna en bunt konfokala bilder från "Arkiv"-menyn, välj "Importera" och härifrån välja "Image sekvens". Detta blir insamling av enskilda bilder till en bunt.
- Nästa ändra "stacken" till en "Hyperstack" genom att gå till "Bild"-menyn, välj "Hyperstack", välj sedan "stack till Hyperstack".
- Ange voxelstorlek med "Egenskaper" från "Bild"-menyn. I data som erhållits med hjälp av Leica SP2 konfokalmikroskop, kan voxelstorlek erhållas från skanning-programmet, och från metadata textfil sparas tillsammans med bilder. Med vår inställning som beskrivs i avsnitt 3, pixeldimensioner är xy = 0,366211 pm och z = 0,99709 nm.
- Genom att undersöka alla skivor i en tidpunkt, dra maximal översikt över det skadade området med polygon-markeringsverktyget i verktygsfältet. Detta är denRegionen av intresse (ROI).
- Lägg ROI till ROI chef genom att gå till "Analysera"-menyn, bläddra ner och välj "Verktyg" och sedan "ROI chef" och sedan "add".
- Upprepa detta för alla tidpunkterna.
- Klicka på "Measure"-knappen i ROI Manager för att få området storleken på varje ROI.
- Korrigering av VNC rörelse under time-lapse inspelning. "Stackreg" och "Turboreg" insticksmoduler 16 (från ImageJ webbplats http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): dessa plugins gör det möjligt att korrigera små provmängder rörelser under time-lapse. Bygg en bunt med en motsvarande representativ optisk sektion genom alla tidpunkter och tillämpa plugins. Det bidrar till att visualisera hur lesionen förändringar över tiden. Detaljerna om dessa metoder och bruksanvisning finns tillgängliga från forskargruppen som utvecklade dessa plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg /).
- Automatisk räkning av gliaceller. "DeadEasy Glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): detta har utvecklats för att räkna antalet repo-positiva gliaceller i Drosophila larver VNC och undersöka förändringen i glia nummer som orsakas av stickande skada 17. Plug-in fungerar korrekt, med ett fel på 0,1% falska positiva och 4,3% falska negativa 17. För att använda denna plug-in, första etiketten all Glia (utom mittlinjen) i provet med hjälp immunofluorescens med anti-repo-antikroppar. Installera sedan plug-in i ImageJ, öppna en bunt konfokala bilder och köra plug-in. Den räknar gliaceller automatiskt cirka 30 sekunder.
- Automatisk räkning av apoptotiska celler. "DeadEasy Caspase larver" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Detta har utvecklats för att räkna antalet celler märkta med anti-kluven-Caspase3, och en ny version anpassad för larver VNCs. Stickande skada orsakar en ökning av programmerad celldöd 11. För att använda denna plug-in, första etiketten apoptotiska celler i provet med hjälp immunofluorescens med anti-klyvd-kaspas-3-antikroppar. Installera sedan plug-in i ImageJ, öppna en bunt konfokala bilder och köra plug-in. Den räknar apoptotiska celler automatiskt cirka 30 sekunder.
8. Reagens
- Odlingsmedium: Shield och sjöng M3 insekt medium, 7,5% fetalt bovint serum, 1% penicillin och 1% streptomycin.
- 0,01% Poly-L-lysin i steril DW.
- Fixativ: 4% formaldehyd, ultraren i PEM (0,1 M PIPES, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4) lösning.
- Blockeringslösning för immunfärgning: 10% normalt getserum i 0,3% Triton X PBS.
- Anti-glutaminsyntetas2-antikroppar: 1:250 i blockeringslösning.
- Anti-GFP-antikroppar: 1:1000 i blockeringslösning.
- Anti-REPO antikroppar: 1:250 i blockeringslösning.
- Anti-ELAV antikroppar: 1:250 i blockeringslösning.
- Anti-kluvna kaspas 3-antikroppar: 1:1000 i blockeringslösning.
- Sekundära antikroppar: 1:250 i blockeringslösning.
Representative Results
Här visar vi hur du utför stickande skada på Drosophila larver VNC och analysera de cellulära svar på skada med tidsförlopp och immunfärgning konfokal fluorescensmikroskopi.
För tidsfördröjda data är lesionen visualiseras som en GFP-negativ område inom neuropile av prover som bär G9 axonal markör (Figur 2). Strax efter stickande, liten GFP-negativa områden, som ser ut som hål eller vakuoler, börjar visas (Figur 2A). Sådana GFP-negativa områden förstora vanligen upp till cirka 6 till 8 timmar efter stickande (figur 2A). Därefter, GFP-negativa områden krympa och kan även försvinna (Figur 2B). Av 22 timmar efter stickande, är arean som upptas av såret i allmänhet mindre än det maximala området var vid 6 till 8 h efter stickande (figurerna 2A, B). På liknande sätt DsRed-negativa området gliaceller processer ökar initialt också, men shrinKS Av 22 timmar efter huggande. Intressant, ofta DsRed-positiva gliaceller processer fylla GFP-negativa hål i neuropile innan deras försvinnande (figur 2C).
Använda immunfärgning i fasta prover, fina gliaceller processer och deras svar på skada kan visualiseras med bättre upplösning än med time-lapse-bilder. Detta kan göras till exempel med hjälp av repoGAL4 gliaceller föraren att inducera uttryck av ett membran tjudrad reporter (t.ex. UAS-mCD8GFP) i flugor att visualisera alla gliaceller (utom mittlinjen Glia). Detta kan också kombineras med andra gliaceller markörer, såsom anti-GS2, vilka etiketter neuropile-associerade gliaceller (Figur 3A, B). Här visar vi att även om den ventrala nerv sladden knivhuggen från ryggsidan, stickande skada resulterar i en buckla ventralt (figur 3A, pilspetsar). Stickande tycks påverka mer allvarligt neuropile och neuropile-associerad gliaceller: een yta och cortex gliaceller (figur 3B). Gliala processer visas oorganiserad i neuropile, medan de fortfarande behålla sin nätliknande organisation i cortex. Skada resulterar i GS2-positiva cellrester, som skiljer sig från normala celler som skräp fragment är mycket mindre och inte är ansluten till en cell kropp. Detta avslöjar skador neuropile-associerade glialceller (Figur 3B). Degenererande neuropile-associerade gliaceller observerades också med elektronmikroskopi 15. Anti-kluvna-kaspas 3 + apoptos färgning observeras i neuropile-associerade gliaceller 15, som visar de genomgår apoptos vid stickande skada. Neuropile associerade gliaceller har också visat att fagocytera neuronal skräp 15, och GS2 + signal kan även avslöja engulfment av apoptotiska neuroner genom gliala processer. Kluvna-Kaspas + apoptotiska celler observeras också i cortex, åtminstone en del av vilka motsvarar Elav + neuroner ( Med hjälp av fasta prover och immunfärgning även möjliggör kvantitativa analyser av cellulära svar på skada, t.ex. effekter i proliferation och apoptos. För detta har vi utvecklat avsiktligt två ImageJ plug-ins, DeadEasy Caspase larv och DeadEasy Glia, att räkna automatiskt antalet gliaceller och apoptotiska celler, respektive. De har validerats för att arbeta på larver VNCs och är mycket noggrann. Med hjälp av dessa är det möjligt att observera en ökning av antalet av repo-positiva gliaceller orsakade av stickande skada, genom 22 h (figur 4A) 15. Det finns också en ökning av antalet anti-klyvd-caspas-3 apoptotiska celler med 6 h efter stickande (figur 4B) 15. Sådan ökning av glia proliferation och apoptos som svar på skada i Drosophila CNS påminner om skadan svar i ryggradsdjur CNS. En viktig aspekt av detta programtokol är kvaliteten på VNC dissektioner. Det är svårt att säga när dissektion om VNCs har skadats eller inte i processen. Det är viktigt att ta särskild omsorg för att utföra mjuka dissektioner. Emellertid kommer dåliga kvalitet prover oundvikligen framställas, och det är viktigt att dessa identifieras i senare skeden och kasseras. I våra händer, verkar VNC degeneration vara oberoende skada, men istället på grund av grov dissektion. Vi har inte observerat en kritisk storlek i skada såret, och vi analyserar alla skadade prover som inte bryts ned. När VNCs bibehålla sin integritet tenderar VNC ytan ser slät och blank och inga hål i neuropile observeras (Figur 5A). Nedbrytning av VNCs kan kännas igen av 24 timmar efter dissektion från den grova ytan av VNC ventrala och laterala områden (figur 5B). Nedbrytning av neuropile samband med stickande skada kan också förekomma, och det är känt som neuropile hOles i bakgrunden signal immunofärgade prover. Prover med dessa tecken på degenerering måste kasseras (figur 5C). I våra händer, var frekvensen lyckad dissektion och skada i intakt och knivhuggen kontroll (YW) flugor är båda runt 70%. Denna kommer att variera med skickligheten hos den person som utför experimenten, och med genotyp. 
Figur 1. Schematisk bild av larver rastande och stickande skador. (A) vid dag 0, är flugor får lägga ägg i en druvsaft petriskål under 3 timmar. Dag 1, (L1) den streckade första stadiet larver samlas och placeras i flaskor som innehåller vanlig jäst mat, där de hålls i ytterligare 3 dagar. Vid dag 4, är larver som samlats in från mat flaska, och användes för stickande experimenten. (B) sidovy av larver centrala nervsystemet.Den bukhålan av den ventrala nerv sladd är knivhuggen med en nål från ryggsidan. Anterior är till vänster, och bakre till höger. 
Figur 2. Time-lapse progression av VNC lesion. Konfokalmikroskopi på levande VNCs med GFP-märkta axoner och DsRed-märkta gliaceller. Genotyp:. UASDsRed / +, G9 / +, repoGAL4 / + (A) lesion känns igen av bristen av fluorescens på axonal neuropile. Efter stickande, GFP-negativa hål visas, därefter ökar i storlek och antal. Projektioner av 5 optiska sektioner från varje tidpunkt efter stickande skada. (B) axonala neuropile lesion krymper från 9 h efter stickande. Dessa bilder är enkla optiska delar från olika tidpunkter efter stickande skada. För att identifiera motsvarande positioner i varje prov, samma skiva nummer från EACH tidpunkt i stapeln av time-lapse uppgifter valdes. Genom att jämföra de mönster visualiseras med G9-och repoGAL4> UASmCD8GFP i området inte påverkas av stickande, var skivorna kontrolleras som från motsvarande positioner i Z-axeln. Streckade linjerna i (A, B) visar kanten på såret. (C) Hög förstoring av sår på neuropile. GFP-negativa hål fylldes med DsRed-positiva gliaceller processer, och därefter försvann (pilspetsar). Horisontell vy. Främre upp. 
Figur 3. Cellulär karakterisering av VNC lesion. VNCs bär ett membran tjudrad GFP reporter för alla gliaceller (utom mittlinjen Glia) färgade med anti-GFP-och anti-GS2, en neuropile-associerad gliaceller markör. Genotyp:. + / +, UASmCD8GFP / +, repoGAL4 / + (A) VNCs knivhöggs från dorsal sida, men detta orsakar en buckla ventralt (pilspetsar). Sagittal vy av enstaka optiska sektioner, dorsala upp och främre vänster. (A, B) huggande skadan påverkar strängare neuropile-associerad gliaceller än cortex och yta gliaceller. Skada resulterar i GS2-positiva cellrester (pilspetsar i B). (B) Horisontell syn på enskilda optiska sektioner, främre upp. Pilhuvuden pekar på GS2 + celldebris. (C) Colocalisation av den apoptotiska markören anti-klyvd-kaspas-3 och den neuronala markören mot Elav visar att vid skada några av de döende cellerna i cortex är neuroner. np, neuropile, cx, cortex. 
Figur 4. Automatisk räkning av gliaceller och apoptotiska celler med DeadEasy. (A) Exempel på användning "DeadEasy larver Glia" att räkna REPO positivgliaceller. Vänster: VNC ventrala halvor färgade med anti-repo-antikroppar, mitten: Utgång från DeadEasy larver Glia visar celler som identifierats av plug-in, höger: samman. Siffrorna till höger är antalet repo-positiva celler räknas automatiskt i en hel bunt av optiska konfokala avsnitt i cirka 30 sekunder. Antalet glia ökningar knivhuggen VNCs. (B) Exempel på användning "DeadEasy Caspase larv". Vänster: projektioner av 5 optiska konfokala färgade med anti-kluven-kaspas 3-antikroppar, mitten: utgång visar celler som identifierats av plug-in, höger: Merge. Siffrorna till höger är antalet kaspas-positiva celler räknas automatiskt i en hel bunt av optiska konfokala avsnitt i cirka 30 sekunder. Antalet apoptotiska celler ökar i stabbed VNC. 
Figur 5. Exempel på degeneratjon. (A) En hälsosam VNC. Det finns inga tecken på degenerering. (B) sidan av bröstkorgen är degenererande (pilspetsar) i en knivhuggen prov. Asterisken indikerar lesionsplatsen. (C) Hål i bröstkorg neuropile (vit pilspets) och cortex (apelsin pilspets) i en icke-knivhuggen VNC. Prover med skadad neuropile och omfattande vakuolisering måste kasseras. Här VNCs färgades med neuropile tillhörande gliaceller markör mot Ebony. Horisontell vy, främre upp.
Discussion
Vi har etablerat ett protokoll för stickande skada på Drosophila larver CNS för att undersöka de cellulära svaren på skada, reparation och förnyelse. Larver VNCs dissekeras och knivhuggen, varefter de filmas med time-lapse mikroskopi eller fastställts för fluorescens immunfärgning att visualisera glia och neuroner, apoptos eller celldelning. Fortskridandet av lesionen över tiden kan mätas. Denna metod åtföljs av avsiktligt utvecklad mjukvara för kvantitativ och statistisk analys av cellantalet ändras vid skada och under reparation.
Vi knivhögg 96-timmars AEL larver (och dessa var antingen fast eller få utvecklas vidare), en utvecklingsstadium före övergången till puppa och sedan vuxen fluga. Vid 96 h, VNCs är tillräckligt stora för stickande, de är i mitten av tredje stadiet steg och därför inte genomgår förpuppning ännu, och nervsystemet redan fullt fungerande liknar annonsenUlt. Det kan vara möjligt att sticka något senare i larver och den exakta tidpunkten måste väljas för att passa frågeställningen. Beroende på de adresserade frågor, är det i allmänhet nödvändigt att odla VNCs en tid att observera de cellulära svaren på skada. En tid efter 120 tim AEL pupation startar, en period då CNS är nyskapad och är därmed bäst undvikas. Således tidsfönstret för stickande plus kultur i larven är ganska begränsad. Använda larver fortfarande har en stor teknisk fördel jämfört med vuxna: medan, på samma sätt som vuxna, är det nervsystemet redan fullt fungerande, analyserar svaret på skadan betydligt enklare och snabbare i larver.
Vid jämförelse av storleken och morfologin hos hjärnan och VNCs dissekerade och odlades i en skål till VNCs som dissekeras på motsvarande senare tidpunkt utan odling i en skål, förefaller det som om utvecklingen är långsammare i kultur än in vivo. I andra avseenden,utveckling bedriver normalt i kultur bevaras vävnad integritet och celler lever visar flera svar. Sår expansion, neuropile reparation och glia spridning ske inom 22 timmar efter huggande. Detta visar att cellulära svar på skada ske i kultur och det finns troligen inget behov av att behålla explantaten längre än en dag. Om längre sikt odling önskas kan protokollet kräva ytterligare optimering som att använda en insats odlingsplatta 5.
Det är viktigt att identifiera god kvalitet prover från degenererande sådana. Optimera detta protokoll tar lite skicklighet och oundvikligen degenerering kommer att ske i vissa exemplar. VNC kan få en "blomkål" utseende som återspeglar en uppdelning av vävnad integritet (figur 5B). Degeneration är också erkänts av vakuolisering av VNC oberoende av stickande, som kan vara närvarande i intakta, icke-stabbed prover (figur 5C
I detta protokoll, vi drog fördel av ett protein fälla linje av flugor att visualisera neuropile parallellt med visualisering av gliaceller processer med hjälp av traditionella GAL4-UAS-system. Dessa verktyg kan också kombineras med andra system binära uttryck som LexA 19 och Q-systemet 20, som är oberoende av GAL4. Detta skulle göra det möjligt att analysera samspelet t.ex. mellan axoner och gliaceller processer, som svar på skada. Genom att ytterligare kombinera det med andra genetiska verktyg som reportrar för dendriter 21 eller kalciuminflödet 22, ger denna metod en stor möjlighet att analysera cellbiologi bakom skadan respons av gliaceller, neuronala axoner och dendriter i CNS. Slutligen kan detta förfarande kombineras med standard genetik, mutationer och över-uttryck av gener, för att testa genfunktion i svar på skada och regenerering.
Detta protokoll har framgångsrikt lett till upptäckten av en gen nätverk bakom den regenerativa glia svar på CNS-skada 11. Med tanke på den evolutionära bevarande av genfunktion, reda ut dessa cellulära händelser och funktioner gen i frukt-flugor kommer sannolikt att ge betydande insikter i förståelsen av mammalian CNS svar på skada och förnyelse.
Disclosures
Ingen intressekonflikt deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Mei Ann Lim för kritisk läsning av manuskriptet och andra medlemmar av vårt labb för sina diskussioner under loppet av detta arbete. Detta arbete har finansierats av Yamada Science Foundation och Royal Society Korta stipendier besök och EU Marie Curie internationellt inkommande stipendium GRR till KK, och BBSRC projektbidrag (BB/H002278/1) och Wellcome Trust utrustning (073228/Z/03/Z) till AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
