Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Samira Samtleben; Juliane Jaepel; Caroline Fecher; Thomas Andreska; Markus Rehberg; Robert Blum

doi:10.3791/50317

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Artículo de método

Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

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DOI:

10.3791/50317

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7 de mayo de 2013

Samira Samtleben¹ , Juliane Jaepel¹^,² , Caroline Fecher¹ , Thomas Andreska¹ , Markus Rehberg³ , Robert Blum¹

¹Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, ²Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, ³Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

En este artículo

Resumen

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad Ca^{2 +} Tintes indicadores en el lumen del RE.

Resumen

Visualización de la dinámica de calcio es importante para entender el papel del calcio en la fisiología celular. Para examinar la dinámica del calcio, fluorescentes Ca ^{2 +} indicadores sintéticos se han vuelto populares. Aquí demostramos TED (= carga de colorante inducida dirigido-esterasa), un método para mejorar la liberación de Ca ^{2 +} colorantes indicadores en el lumen del retículo endoplasmático de diferentes tipos de células. Hasta la fecha, el TED se utilizó en líneas celulares, células gliales y neuronas in vitro. Bases TED en eficiencia, recombinante orientación de una actividad de alto carboxilesterasa al lumen ER usando vectores construcciones que carboxilesterasas expresos (CES). Los últimos vectores TED contienen un elemento central de CES2 fusionado a una proteína fluorescente de color rojo, lo que permite simultánea de imágenes de dos colores. La dinámica de calcio libre en el ER se obtuvieron imágenes en un solo color, mientras que la estructura ER correspondiente aparece en rojo. Al comienzo del procedimiento, las células son transducidas con un lentivirus. Posteriormente, las células infectadas unare sembraron en cubreobjetos para finalmente permitir imágenes de células vivas. Entonces, las células vivas se incuban con el éster de acetoximetilo (AM-éster) de forma de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores, por ejemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. La actividad esterasa en los unirá ER frente cadenas laterales hidrófobas de la forma de AM de la Ca ^{2 +} indicador y un colorante fluorescente / Ca ^{2 +} complejo hidrófilo se forma y atrapado en el lumen del RE. Después de colorante de carga, las células se analizaron en un microscopio de barrido láser confocal invertido. Las células se sometieron a perfusión continua con soluciones de Ringer-como y la dinámica del calcio ER son directamente visualizada por time-lapse. La liberación de calcio desde el RE se identifica por una disminución en la intensidad de fluorescencia en las regiones de interés, mientras que la recarga de la tienda de calcio ER produce un aumento en la intensidad de fluorescencia. Por último, el cambio en la intensidad de fluorescencia con el tiempo se determina mediante el cálculo de Delta F / F _0.

Introducción

Con el fin de resolver las respuestas fisiológicas del calcio ER, hemos desarrollado una nueva estrategia para mejorar la captura de tintes sensibles calcio sintéticos en la sala de emergencias. El método permite la monitorización en tiempo real, directa, sin interrupciones del libre ER calcio en presencia de calcio extracelular.

Función y señalización de calcio ER

Señales de calcio se encuentran en diferentes tipos de células, por ejemplo células de músculo, neuronas y células gliales y su gama de funciones de la mediación de la contracción del músculo a una participación en la transmisión sináptica en ....