用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

摘要

裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。

摘要

一种结构转化的裂解性噬菌体，具有广泛的Staphylococcus aureus菌株宿主范围，并结合了青霉素结合蛋白（PBP 2a）抗体偶联的乳胶微珠，已被用于构建一种生物传感器，旨在区分耐甲氧西林（MRSA）和甲氧西林敏感（MSSA）的S. aureus菌种^1,2。该裂解性噬菌体通过与水-氯仿界面接触转化为噬菌体球状体。噬菌体球状体单层通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett, LB）技术转移至生物传感器表面³。所构建的生物传感器采用带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D）进行检测，以评估细菌与噬菌体之间的相互作用。细菌与球状体的结合导致MRSA和MSSA菌株均出现共振频率降低和耗散能量升高。在细菌结合后，这些传感器进一步暴露于青霉素结合蛋白抗体乳胶微珠中。经MRSA检测的传感器对PBP 2a抗体微珠产生响应，而经MSSA检测的传感器则无响应。该实验差异实现了对耐甲氧西林与敏感型S. aureus菌株的明确区分。无论结合态还是游离态的噬菌体均能抑制表面及水悬浮液中的细菌生长。一旦裂解性噬菌体转化为球状体，其仍保持强烈的裂解活性，并表现出高效的细菌捕获能力。噬菌体及其球状体可用于耐药微生物的检测与灭菌。其他应用可能包括噬菌体治疗及抗菌表面的开发。

引言

耐甲氧西林菌株 金黄色葡萄球菌 已被认为是导致原发性感染和医院内暴发的重要因素 ^4-8常见的耐甲氧西林检测方法，如纸片扩散法、苯唑西林琼脂筛选试验或肉汤微量稀释法，均依赖特定的培养条件以增强耐药性的表达。这些条件的调整包括使用苯唑西林、在30或35 °C而非37 °C下孵育，以及在培养基中添加氯化钠。此外，为确保这些技术的准确检出，需要24小时的较长孵育时间，而非通常的16至18小时。具有适当准确性的快速检测技术>96%）的敏感性水平用于鉴定耐甲氧西林耐药性，包括自动化微量稀释技术，例如 Vitek GPS-SA 卡、Rapid ATB Staph 系统和 Rapid Microscan Panel 系统，这些方法在 3–11 小时内出具结果 ^9-11. 晶体MRSA鉴定系统是一种基于识别生长情况的快速方法 S. aureus 在含2% NaCl和每升4 mg苯唑西林的条件下，使用氧敏感型荧光传感器进行检测。据称，在培养4小时后，敏感性范围为91%至100% ^12-14这些表型方法在准确性上受到普遍存在的、具有异质性耐药特性的菌株的影响，因此，目前公认最可靠的检测甲氧西林耐药性的方法是针对mecA基因的PCR或DNA杂交技术。 ¹⁵然而，该技术需要纯化的DNA，且对多种混合物（杂质）极为敏感，其中包括细胞碎片¹⁶.

此外，这些技术需....

方案

1. 准备工作

1. 获取模式菌株 S. aureus ATCC 12600 S. aureus ATCC 27690 和 枯草芽孢杆菌 ATCC 6051。耐甲氧西林菌株 S. aureus - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌5、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌13、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌26、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌34、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌45、 B. anthracis 斯特恩, 鼠伤寒沙门氏菌 LT2 志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 13882；裂解性噬菌体 12600
2. 获取与PBP 2a抗体偶联的乳胶微珠。
3. 按所述方法制备NZY培养基 ²¹.
4. 获取磷酸盐缓冲液（PBS）。
5. 准备去离子水作为朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett，LB）单层膜沉积的亚相。

2. 噬菌体的扩增与滴定

1. 在2 L三角瓶中，将5 ml过夜培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600菌液（3.6 × 10⁸ 菌落形成单位（CFU）/ml....

结果

噬菌体对所有测试的S. aureus菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株）均表现出裂解活性，噬菌斑点试验结果证实了这一点。噬菌斑大小通常在5至15 mm之间。对其他测试菌株未发现裂解活性（表1）。

S. aureus ATCC 12600 在 37 °C 条件下于摇床培养箱中的 NZY 培养基内正常生长情况如图 1A所示（以空心圆圈标记的曲线）。细菌数量从 3.2 × 10⁶ 增加至 4.0 × 10⁸ CFU/mL。图 1A（以实心圆圈标记的曲线）显示了将 2.0 × 10⁶ PFU/mL 游离噬菌体与相同浓度的S. aureus ATCC 12600 同时加入后共培养的结果。固定在金表面的噬菌体表现出与悬浮状态噬菌体相当的裂解活性（图 1A，以倒三角标记的曲线）。当携带噬菌体的金片首次用于 24 小时生长实验后，经 .......

讨论

众所周知，噬菌体可作为细菌病原体的生物传感器探针²⁸。本研究证明，噬菌体与PBP 2a抗体联用，能够解决一个长期存在的难题：快速区分抗生素耐药菌株与敏感菌株。

然而研究发现，普通的未经修饰的葡萄球菌噬菌体不适合用于QCM设备的细菌检测，即使它们能够结合细菌。噬菌体的尾部过长，导致声波无法“触及”结合在噬菌体尾部末端的细菌。这种情况导致了“缺失质量”效应²⁹，即使电镜图像（图3A和3B）显示存在显著的结合，仍无法检测到共振频率和耗散的变化。这一问题通过用球状体替代完整的噬菌体得以轻松解决，球状体是经氯仿-水处理修饰后的噬菌体。该处理使噬菌体转变为具有短而粗且无柔性的尾部，但仍保持完全功能（图2D、2E和2F）。当生物传感器中使用球状体替代噬菌体后，QCM-D设备可轻松检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。

当噬菌体颗粒以适当的方向结合到金表面时，其受体可与宿主细菌发生接触。如果带有噬菌体的固体表面与干燥的细菌层发.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P4417
分光光度级氯仿	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	154733	（99.8% A.C.S.）
己烷-无水	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州	29609-0	(95%)
乙醇	Pharmco产品公司，康涅狄格州布罗克菲尔德	64-17-5	190 证明
<强>仪器设备
PBP 2a 抗体偶联乳胶微球	日本东京，德卡精工株式会社	MRSA-Screen 检测
S. aureus ATCC 12600 S. aureus ATCC 27690 和 枯草芽孢杆菌 ATCC 6051 来自	美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）；
MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45 B. anthracis 斯特恩, 鼠伤寒沙门氏菌 LT2 志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 13882；裂解性噬菌体 12600	阿拉巴马州奥本市奥本大学的菌种保藏中心
离心	贝克曼库尔特	Optima L-90K 超速离心机
KSV 2200 LB 膜天平	KSV Chemicals，芬兰
光学显微镜光学系统	CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frö隆德，瑞典	E4
扫描电子显微镜（SEM）	JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪	JEOL-7000F 扫描电子显微镜
透射电子显微镜（TEM）	JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪	JEOL，JEM 2010
Stericup，预灭菌	默克密理博公司，比勒里卡，马萨诸塞州	SCGPU05RE	0.22 μm，GP Express PLUS 膜
生物测定皿	NUNC A/S，丹麦	240835	尺寸（毫米），245 × 245 × 25
移液器	Gilson，Pipetman，法国	P100、P200、P1000
C24 恒温振荡培养箱	新不伦瑞克科学公司，康涅狄格州	经典 C24
镀金石英片	阿拉巴马州奥本大学		自制
培养皿	Fisher Brand，美国	0875713	100 mm × 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
培养用生长瓶	康宁公司，纽约	4995	PYREX 250 ml 锥形瓶
光学光谱仪	Genesys 20. Thermo Spectronic，美国	4001
等离子清洗机	Harrick Plasma，美国	PDC-32G
Millipore 水纯化系统	Millipore	Direct-Q
成像椭偏仪	美国 Accurion	纳米膜_ep3se
软件	Q-Sense AB，瑞典	QSoft，QTools