Summary
Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt
Abstract
Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.
Introduction
Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine "Spitze" Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende "Stiel" Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße 1 umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum.
Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben 2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt4 Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden.
In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa 5 P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen 5 untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde 6 gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung.
Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch 7) durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.
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Protocol
Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.
1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale
- Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere.
- Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen.
- Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 2x PBS bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Lassen Sie jedes Auge für 10 fix - 15 min, dann kalt 2x PBS auf Eis übertragen für 5 - 10 min. Am besten ist es Enukleationen und anschließende Fixierung staffeln, um sicherzustellen, der Grad der Fixierung ist gleich für jedes Auge.
2. Dissektion Postnatale Murine Retinas
- Transfer-Augen in eine Petrischale mit 2x PBS mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung und unter einer disse erweiternfesselndes Mikroskop.
- Entfernen Sie das Fett um die Augen mit einer Pinzette und Schere.
- Pierce der Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden rund um die Hornhaut und Iris und entsorgen.
- Legen Zange zwischen Netzhaut und Lederhaut und entfernen Sie die Lederhaut kümmert sich nicht um die Netzhaut zu reißen. Die Aderhaut Schicht kann auch entfernt werden, aber, wenn es die Gefahr einer Schädigung der Netzhaut, die während dieser Stufe wird die Aderhaut kann wie es sich nicht signifikant auf die Qualität der Immunfärbung gelassen werden.
- Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette.
- Entfernen Sie die hyaloids Schiffe durch das Sammeln von ihnen zusammen in der Mitte des Auges mit feinen Pinzette dann schnell ziehen weg von der Mitte der Netzhaut (alternativ snip an der Basis der hyaloid Schiffe mit einer feinen Schere).
- Spülen Sie die schalenförmigen Netzhaut mit PBS in einer sauberen Petrischale.
- Stellen 4 bis 5 radiale Einschnitte erreicht etwa 2/3 des Radius der Netzhaut durch Federkraft scissors zur Schaffung eines "Blütenblatt" Form.
- Abziehen PBS mit einer Pasteurpipette auf die Netzhaut zu glätten, und dann entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück Löschpapier.
- Langsam Pipette Kälte (-20 ° C) Methanol tropfenweise auf die Oberfläche der Netzhaut bis völlig bedeckt und dann mit zusätzlichen Flut Methanol. Dies wird dazu beitragen, um die Netzhaut zu fixieren und Permeabilisierung erleichtern. Die Netzhaut wird weiß.
- Transfer zu einem 2-ml-Röhrchen mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung zu erweitern.
- Lassen Netzhaut in kaltem Methanol für mindestens 20 min, bevor Sie mit Immunfärbung. Von den Antikörpern verwendet hier nur VE-Cadherin nicht erfolgreich auf Methanol festen Netzhaut verwendet werden. In diesem Fall Netzhaut müssen gerade gehen Immunfärbung nach Schritt 9.
- Falls erforderlich, kann Netzhaut in Methanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu mehrere Monate vor dem Färben.
3. Immuno / isolectin Färbung des Retinal Vascuschaftsgesetzgeber
- Entfernen Sie vorsichtig / Methanol abgießen und vorsichtig abspülen Netzhaut kurz in PBS (in diesem Stadium die Netzhaut ist immer noch in der gleichen 2-ml-Röhrchen aus Schritt 11 oben).
- PBS entfernen und Deckel Netzhaut mit 100 ul Perm / Blocks-Lösung (PBS + 0,3% + 0,2% Triton BSA) + 5% des entsprechenden Serums (siehe Tabelle 1) und leicht schütteln für 1 Stunde.
- Entfernen Perm / Sperren und Inkubation Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 ° C mit 100 ul ausgewählten Primärantikörper (siehe Tabelle 1) und / oder IsolectinB4, alle durch Verdünnen in Perm / Blocks vorbereitet.
- Entfernen Antikörper / isolectin und waschen Netzhaut 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
- In einigen Fällen, z. B. nach einer Färbung mit IsolectinB4-Alexa488 oder einem direkt konjugierten primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, nicht erforderlich, und Netzhaut kann direkt angebracht werden (Schritt 7). Bei einem nicht konjugierten primären Antikörper in Schritt 3 verwendet wurde, dann wurden 100 ul der entsprechenden fluorescent sekundären Antikörper (verdünnt 1/200 in PBSTX) zugegeben und links nach Inkubation bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur über Nacht.
- Entfernen sekundären Antikörper und waschen Netzhaut 4 x 15 min in 2 ml PBSTX.
- Übertragen Netzhaut auf Objektträger mit einem breiten Bohrung Kunststoff Pasteurpipette und entfernen Sie überschüssiges PBSTX mit saugfähigen Gewebe. Berg Netzhaut durch Zugabe von 50 ul verlängern Deckfluessigkeit auf einem Deckglas und sanft Position über die Netzhaut.
- Die Objektträger zu Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C, so dass sie flach und vor Licht geschützt sind, damit das Verlängern Deckfluessigkeit eingestellt.
- Bild Netzhaut mit einem konfokalen Mikroskop oder eine Epifluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antikörpern in der oben angegebenen Protokoll können Endothelzellen gesehen mit anti-CD31 Immunfärbung und Unterstützung pericytes sehen sind unter Verwendung von Antikörpern gegen NG2 (Abbildung 3) oder Desmin (Abbildung 4). Anti-Desmin-Färbung gut zur Visualisierung Finger Fortsätze der Perizyten und Bestimmen, ob sie eng mit den Endothelzellen verbunden. Im Gegensatz dazu beschreibt anti-NG2 Färbung der Kerne jedes pericyte, was nützlich ist, wennQuantifizieren der Anzahl von Zellen pericyte auf das Gefäßsystem. Dies würde durch Zählen Anzahl der Zellen pro Gesichtsfeld mit hoher Leistung (z. B. 60X) Ziel durchgeführt werden. Bei Bedarf können alternative Kombinationen von Antikörpern verwendet werden (siehe Tabelle 1) werden, zum Beispiel, ist ein Anti-Kollagen IV gut zur Visualisierung vaskulären Basalmembran. Retina, die für Endothelzellen gefärbt wurden für die Funktionen von Angiogenese, wie den Verlauf der Blutgefäße von der Mitte zum Rand der Netzhaut, die vaskuläre Dichte und Behälter Verzweigung Frequenz analysiert werden.
Abbildung 1. Aussehen eines Neugeborenen Netzhaut unmittelbar nach Dissektion und Zugabe von Methanol. Dieses Bild ist aufgenommen mit einem Zeiss Stemi SV6 und Axiocam HR c Kamera.
Abbildung 2. Immunfärbung von whole mount Netzhaut (Alter P7) mit Isolectin B4-Alexa488 (grün) (A), sind anti-alpha Glattmuskelaktin-Cy3 (rot) (B) oder fusionierten (C). Diese Bilder mit einer Zeiss AxioImager genommen und Axiocam HRm Kamera über ein 5fach Ziel. Beachten Sie die wechselnden Muster von Arterien und Venen. Arterien sind durch die Kapillarwirkung Freizone, die unmittelbar umgibt sie erkannt und sind mit glatten Muskelzellen, die positive Färbung (rot) für alpha Glattmuskelaktin beschichtet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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3 Doppel Immunfärbung whole mount Netzhaut (Alter P6) mit Anti-CD31 primären Antikörper (detektiert mit Anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Alexa488, grün, A);. Und anti-NG2 primären Antikörper nachgewiesen mit Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa 594 (rot, B). Diese konfokalen Bilder wurden mit einem 60x Objektiv kombiniert Laser-Scanning-Bilder von 13 z Scheiben, die jeweils 0,47 um Dicke. Eine Überlagerung von Bildern in C zeigt CD31-positive Endothelzellen (grün) und NG2-positive Perizyten (rot). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Figur 4 Doppel-Immunfärbung whole mount Netzhaut (Alter P6) mit Anti-CD31 primären Antikörper (detektiert mit Anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Alexa488, grün, A);. Und Anti-Desmin primären Antikörper nachgewiesen mit Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa 594 (rot, B). Diese konfokalen Bilder wurden mit einem 60x Objektiv kombiniert Laser-Scanning-Bilder von 21 z Scheiben, die jeweils 0,24 um Dicke. Eine Überlagerung von Bildern in C zeigt CD31-positive Endothelzellen (grün) und Desmin-positiven Perizyten (rot). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
| Primärer Antikörper | Gebrauchsverdünnung | Blocking-Lösung (Serum + Perm / Block) | Sekundäre Antikörper |
| Anti-NG2 (Chondroitinsulfat Proteoglycan) 1:250 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti-Kaninchen Alexa 594 | |
| Anti-GFAP | 1:500 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti-Maus Alexa 488 |
| Anti-Desmin | 1:500 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti-Kaninchen Alexa 594 |
| Anti-Collagen IV | 1:200 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti-Kaninchen Alexa 594 |
| Anti-Endoglin | 1:100 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti Ratte Alexa 594 |
| Anti-CD31 | 1:500 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti Ratte Alexa 488 |
| Anti-VE-Cadherin | 01.10 | 5% Ziegen-Serum | Ziege anti Ratte Alexa 594 |
| Anti-ALK1 | 01.25 | 5% Esel-Serum | Esel anti Ziege Alexa 594 |
| Anti-ASMA-Cy5 | 1:100 | <td> Perm-Block nurN / A |
Tabelle 1. Beispiele für primäre Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung der ganze Berg Netzhaut.
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Discussion
Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration PBS hergestellt ist wichtig, weil dies verursacht eine kleine Menge des Wasserverlustes aus dem Auge und reduziert die intra-Orbital-Druck, der Dissektion erleichtert. Eine gute Vorbereitung der Netzhaut ist aus mehreren Gründen wichtig. Zuerst wird die Integrität des Gefäßsystems. Zweitens, wenn die hyaloid Gefäßsystem nicht gut entfernt es reduziert die Effizienz der Antikörper-Färbung, was zu hohen Hintergrund und verringerte Auflösung. Dieses Problem kann auch auftreten, wenn die PFA Fixierzeit der Netzhaut ist zu lang. Allerdingsvor der Färbung, ist die langfristige Lagerung bis zu mehreren Monaten in Methanol in der -20 ° C Gefrierschrank geeignet vor isolectin Färbung und für die meisten der Antikörper in Tabelle 1. Obwohl isolectin Färbung ist selten problematisch, es Fleck Makrophagen neben Endothelzellen. Für eine gute Immunfärbung whole mount Netzhaut, ist die Wahl der Antikörper kritisch und die Färbeprotokoll müssen entsprechend der Antikörper Spezifität und Konzentration, die von Charge zu Charge variieren kann, wenn polyklonale Antikörper verwendet werden, angepasst werden. Hohe Hintergrund kann in der Regel durch eine Senkung Antikörper-Konzentration, die Erhöhung Waschzeit oder das Hinzufügen von mehr Waschmittel zu den Waschschritten reduziert werden. Antikörper werden bei der Ankunft aliquotiert und wie vom Hersteller angegeben. Für diejenigen, die bei -20 ° C gelagert werden, wird eine Arbeitsgruppe Aliquot in den Kühlschrank, um wiederholte Zyklen von Einfrieren Auftauen vermeiden gehalten. Wenn hellem fluoreszierenden Flecken auf der gefärbten Probe erscheinen, vor allem, wenn dies auch vorhandenin der Region um das Gewebe legt diese ausgefällte Aggregate Antikörper vorhanden sind, sollte in allen nachfolgenden Experimenten durch Zentrifugieren des Antikörpers für 10.000 rpm für 5 min vor der Verwendung entfernt werden. Einige der Antikörper derzeit von unseren Laboratorien verwendet werden, sind in der Materialliste mit der entsprechenden Verdünnung (Tabelle 1). Die Wahl eines kompatiblen Kombination von Antikörpern ist sehr wichtig, um unerwünschte Kreuzreaktion zwischen primären und sekundären Antikörper zu vermeiden. Die Zellproliferation kann durch Injektion von Mäusen mit einer Lösung von BrdU etwa zwei Stunden vor dem Ernten des Gewebes überwacht. Das Thymin-Analogon proliferierenden DNA eingebaut und kann unter Verwendung eines spezifischen anti-BrdU-Antikörper, wie dies zuvor 8 beschrieben.
Jeder Netzhaut ist sehr zerbrechlich, kann aber für verschiedene vaskuläre Marker durch Behandlung des Gewebes während der Arbeit sanft durch das Protokoll gefärbt werden. Eine Reihe von Kontrollen sind enthaltenjedes Experiment zu zeigen Spezifität der Färbung. Unbehandelte Netzhaut wird zeigen den Grad der Autofluoreszenz im Gewebe, die minimal sein sollte. A kein primärer Antikörper-Kontrolle ermöglicht Bestimmung der unspezifischen Bindung des sekundären Antikörpers an das Gewebe. Netzhaut, die versehentlich beim Präparieren zerrissen nützliche Gewebe, Kontrollen durchzuführen. Nach der Montage wird Fluoreszenzfärbung für mehrere Tage erhalten, solange die Objektträger bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. Imaging durch Epifluoreszenzmikroskopie wird durch die Verwendung eines apotome, die sich entfernt von Fokuslicht verbessert. Alternativ stellt der konfokalen Mikroskopie genaue zellspezifischen Bildgebung (3 und 4).
Diese Methode hat viele mögliche Anwendungen. Es kann an Mäusen, in denen wichtige Gene, die Angiogenese regulieren erschöpft sind, einschließlich Arbeit, die induzierbare verwendet Cre-loxP Genetik 8-10 angewendet werden. Alternativ retinalen Angiogenese kannverhört folgende medikamentöse Behandlungen geliefert entweder systemisch oder intra-okular ihre pro-oder anti-angiogenen Effekte 11 zu untersuchen. Es ist auch möglich, die Vorteile der transgenen Werkzeuge zur Verfügung zu nehmen und GFP oder RFP transgenen Mäusen zu den wichtigsten Elementen des retinalen Gefäßsystems 11,12 visualisieren. (Beachten Sie, dass Fixation mit 4% PFA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur anstelle von Methanol für Schritt 2.12 des Protokolls vor der Bildgebung endogene GFP oder RFP in Netzhaut aus transgenen Mäusen verwendet.) Darüber hinaus, um die molekulare Signalisierung studieren Mechanismen, ist es sinnvoll, die mRNA-Expression spezifischer Gene in der Netzhaut Plexus mit in-situ-Hybridisierung 13 sichtbar zu machen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust und der British Heart Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
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