Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.
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Artículo de método
Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular
En este artículo
Resumen
Resumen
Se cree que el cultivo de células en 3D en andamios apropiados imita mejor el microambiente in vivo y aumenta las interacciones célula-célula. La construcción celular 3D resultante a menudo puede ser más relevante para estudiar los eventos moleculares y las interacciones célula-célula que experimentos similares estudiados en 2D. Para crear cultivos 3D efectivos con alta viabilidad celular en todo el andamio, las condiciones de cultivo, como el oxígeno y el pH, deben controlarse cuidadosamente, ya que pueden existir gradientes en la concentración de analito en toda la construcción 3D. En este trabajo describimos los métodos de preparación de nanosensores sol-gel biocompatibles sensibles al pH y su incorporación en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) junto con su posterior preparación para el cultivo de células de mamíferos. Los andamios sensibles al pH se pueden utilizar como herramientas para determinar el pH microambiental dentro de una construcción celular en 3D. Además, detallamos la entrega de nanosensores sensibles al pH al entorno intracelular de células de mamíferos cuyo crecimiento fue soportado por andamios PLGA electrohilados. La ubicación citoplasmática de los nanosensores sensibles al pH se puede utilizar para monitorear el pH intracelular (pHi) durante la experimentación en curso.
Introducción
Una estrategia clave en la ingeniería de tejidos es el uso de materiales biocompatibles para fabricar andamios cuya morfología se asemeje al tejido que va a reemplazar y que además sea capaz de soportar el crecimiento y la función celular1,2. El andamio proporciona soporte mecánico al permitir la unión y proliferación celular, al mismo tiempo que permite la migración celular a través de los intersticios de una construcción celular 3D. El andamio también debe permitir el transporte masivo de nutrientes celulares y no inhibir la eliminación de desechosmetabólicos 3.
El electrospinning ha surgido como un método prometedor....
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Protocolo
Resumen
La sección 1 describe la preparación de nanosensores sensibles al pH y la caracterización de la respuesta de los nanosensores al pH utilizando espectrometría de fluorescencia y su tamaño utilizando SEM.
La sección 2 describe la preparación de andamios de polímero electrohilado y la caracterización de su morfología y tamaño utilizando SEM. La sección 2 también describe la preparación de andamios autoinformados, que son andamios electrohilados con la inclusión de los nanosensores sensibles al pH. Los andamios autoinformados resultantes se caracterizan mediante SEM para evaluar si se han producido cambios morfo....
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Resultados
La distribución de tamaños de los nanosensores sensibles al pH preparados se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), donde se midió la población de nanosensores observados y se encontró que presentaban dimensiones en el rango de 240-470 nm (Figura 1A). El logro de un diámetro estrecho y razonablemente pequeño es consistente con el uso del método de Stöber para la preparación de nanopartículas. Se ha encontrado que el uso de un entorno de pH básico durante la síntesis de nanopartícu.......
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Discusión
La ingeniería tisular aspira a crear sustitutos biológicos que puedan usarse tanto in vivo como modelos de tejido in vitro y en la terapia de reemplazo tisular para reparar, reemplazar, mantener o mejorar la función de un tejido u órgano en particular. Los sustitutos sintéticos se han utilizado durante muchos años para reemplazar o ayudar a reparar los tejidos, pero a menudo fallan debido a una mala integración con el tejido huésped y / o una infección, lo que finalmente conduce al rechazo o a una cirug.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Se agradece la financiación del BBSRC (número de subvención BB H011293/1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol | Fisher | 32221 | |
| Dimetilformamida anhidra (DMF) | Sigma | 270547 | |
| hidróxido de amonio al 50% (v/v) solución acuosa | Alfa Aesar | 35574 | diluido al 30% (v/v) con agua pura |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(y-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxitetrametilrodamina, éster de succinimidilo (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Fosfato de sodio monobásico (0,2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Fosfato de sodio dibásico (0,2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Tripsina/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Fuente Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamina | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Gas nitrógeno | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Microscopio confocal | Leica TCS-SP | equipado con láseres de argón y criptón y una lente de inmersión en agua 63X 0.9NA | |
| Luz UV | UVLS28 UVP, EE. UU. | ||
| Placa agitadora | SB161-3 Jencons-PLS Medidor de | ||
| pH | Jenway modelo 3510 | ||
| Evaporador rotativo | Buchi Rotary Evaporador Centrífuga R200 | ||
| (nanosensores) | Hermle Z300 | ||
| Centrífuga (cultivo celular) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicador | FB11021 Fisherbrand | ||
| Chapa | |||
| placa de cultivo celular de 35 mm | Iwaki | 3000035 | |
| jeringa de 10 ml | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Células de fibroblastos | Colección Europea de Cultivos | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Formiato de piridinio | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Azul tripán | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich 320331 |
Referencias
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al.
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Reimpresiones y permisos
