Summary
El transistor orgánico electroquímico está integrado con células vivas y se utiliza para controlar el flujo de iones a través de la barrera epitelial intestinal. En este estudio, un incremento en el flujo de iones, relacionados con la alteración de las uniones estrechas, inducida por la presencia de la EGTA quelante de calcio (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-tetra acético ácido), se mide.
Abstract
El tracto gastrointestinal es un ejemplo de tejido de barrera que proporciona una barrera física contra la entrada de patógenos y toxinas, mientras que permite el paso de iones y moléculas necesarias. Una violación de esta barrera puede ser causada por una reducción en la concentración de calcio extracelular. Esta reducción en la concentración de calcio causa un cambio conformacional en las proteínas implicadas en el sellado de la barrera, lo que lleva a un aumento del flujo paracelular. Para imitar este efecto los quelantes de calcio ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', se utilizó ácido acético N'-tetra (EGTA) en una monocapa de células conocidas para ser representativa del tracto gastrointestinal. Ya existen diferentes métodos para detectar la interrupción de la barrera de tejido, tales como ensayos de inmunofluorescencia y de permeabilidad. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo y costoso y no es adecuado para mediciones dinámicas o de alto rendimiento. Métodos electrónicos para la medición de tejido de barreraintegridad también existe para la medición de la resistencia transepitelial (TER), sin embargo, estos son a menudo costoso y complejo. El desarrollo de métodos rápidos, baratos y sensibles se necesita con urgencia como la integridad de los tejidos de barrera es un parámetro clave en el descubrimiento de fármacos y el diagnóstico de patógenos / toxina. El transistor de electroquímica orgánica (OECT) integrada con el tejido barrera de la formación de células se ha mostrado como un nuevo dispositivo capaz de monitorizar dinámicamente la integridad del tejido barrera. El dispositivo es capaz de medir las variaciones minutos en flujo iónico con resolución temporal sin precedentes y sensibilidad, en tiempo real, como un indicador de la integridad del tejido de barrera. Este nuevo método se basa en un dispositivo simple que puede ser compatible con las aplicaciones de cribado de alto rendimiento y fabricado a bajo costo.
Introduction
El epitelio gastrointestinal es un ejemplo de tejido de barrera, que controla el paso de moléculas entre los diferentes compartimentos del cuerpo. El epitelio se compone de células columnares alargados unidos entre sí por complejos de proteínas que proporcionan una barrera física 1 contra patógenos y toxinas, mientras que permite el paso del agua y los nutrientes necesarios para sostener el cuerpo. Esta selectividad es debido a la polarización de las células epiteliales, lo que crea dos dominios de membrana diferentes: la parte apical de las células expuestas a la luz y la parte basal de las células ancladas en los tejidos subyacentes 2,3. Las uniones estrechas (TJ) son complejos de proteínas presentes en la parte apical de las células epiteliales y son parte de un complejo más amplio conocido como la unión apical 4. Flujo de iones a través del tejido de barrera puede ir ya sea a través de la transcelular (a través de la célula) o a través de un paracelular (entre dos células adyacentes) vía. La suma de losel transporte a través de ambas vías se conoce como la resistencia transepitelial. La unión apical es responsable de la regulación de los iones y moléculas que pasan a través de la barrera de 5,6 a través de una abertura específica y función de cierre. Una disfunción o alteración de estos complejos de proteínas es a menudo relacionado con la enfermedad 7-11. Además, muchos agentes patógenos / toxinas entéricos son conocidos para dirigirse específicamente a este complejo, entrando así al cuerpo y que conduce a la diarrea, muy probablemente como consecuencia de la desregulación masiva de flujo de iones / agua a través de la barrera 12-14. Tejido barrera también puede ser modificado cambiando el microambiente extracelular. Cadherina es una proteína crítica para la adhesión célula-célula, y está implicado en la formación de la unión apical. El calcio es necesario para la conformación estructural correctos de cadherina, y una disminución en el calcio extracelular se ha demostrado que resulta en la destrucción de la unión célula-célula y una abertura posterior de lavía paracelular entre las células 15. En este estudio, EGTA (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-ácido acético TETRA), un quelante de calcio específico, fue utilizado para inducir una brecha en el tejido de barrera, ya que tiene ha demostrado que tienen un efecto rápido y drástico en paracelular flujo de iones a 16,17. Este quelante de calcio se utiliza en una monocapa confluente y diferenciada de la de la línea celular Caco-2. Cultivaron en insertos de cultivo de células, esta línea celular se sabe que se desarrollan las características del tracto gastrointestinal y se utiliza ampliamente por la industria farmacéutica para probar la absorción de fármacos 18,19.
Métodos para monitorear la integridad del tejido barrera son abundantes. Estos métodos son a menudo óptico, basándose en la tinción de inmunofluorescencia de proteínas particulares que se sabe que en la unión apical 20, o basándose en la cuantificación de una molécula de trazador fluorescente que es normalmente impermeable al tejido barrera21,22. Sin embargo, los métodos de etiquetado libre (es decir, sin un fluoróforo / cromóforo) son preferibles como el uso de una etiqueta puede incurrir en artefactos, ya menudo aumenta el costo y tiempo de ensayo. Supervisión eléctrica, libre de marca de tejido barrera ha surgido recientemente como un método dinámico de supervisión 23. Por ejemplo recientes avances tecnológicos en la espectroscopia de impedancia eléctrica han permitido el desarrollo de un aparato de exploración disponibles comercialmente 24,25 que pueden medir la resistencia transepitelial (TER), una medición de la conductancia de iones a través de la capa de células.
La electrónica orgánica ha creado una oportunidad única para interconectar el mundo de la electrónica y la biología 26,27 28,29 mediante el uso de polímeros conductores que pueden conducir tanto a portadores electrónicos e iónicos. Una nueva técnica para detectar infracciones en el tejido barrera utilizando la OECT 30-32 se introdujo recientemente. Este dispositivo se ha validado con las técnicas existentes nosed para evaluar integridad de la barrera de tejido, incluyendo inmunofluorescencia, ensayos de permeabilidad utilizando Lucifer amarillo y espectroscopia de impedancia usando el Cellzscope. En el caso de todos los compuestos tóxicos ensayados, la OECT se encontró para operar con una sensibilidad igual o mejor, y con el aumento de la resolución temporal, en comparación con las técnicas anteriores. En este dispositivo, de PEDOT: PSS, un polímero conductor que se ha demostrado ser estable y biocompatible 33,34, se utiliza como el material activo en el canal del transistor. La OECT está compuesta de drenaje y fuente electrodos a cada lado de un canal de polímero conductor. Este se coloca entonces en contacto con un electrolito, que forma una parte integral del dispositivo. Un electrodo de puerta se sumerge en el electrolito (Figura 1), y cuando se aplica una tensión de puerta positivo en la puerta, de cationes del electrolito son forzados dentro del canal, desdopado así el polímero conductor y que resulta en un cambio en la fuente-drenaje actual. El device es por lo tanto extremadamente sensibles a los cambios minutos en flujo iónico debido a la amplificación por el transistor. Una capa de células cultivadas en un inserto de cultivo celular se colocó entre el electrodo de puerta y del canal de polímero conductor. La presencia de una capa de células intactas actúa como barrera para los cationes de entrar en el polímero conductor, por lo tanto, en presencia de una monocapa intacta, la corriente disminuye de drenaje (Figura 2: transición de la región de A a B). En la presencia de un compuesto tóxico, el tejido de barrera perderá progresivamente su integridad, dejando que los cationes entran en la película de polímero y aumentando la corriente de drenaje (Figura 2: región C). Con esta técnica, la brecha en el tejido de barrera es visto por la modulación de la corriente de drenaje, que corresponde a la modulación del flujo a través de la monocapa. Este dispositivo es capaz de medir pequeñas variaciones en el flujo iónico con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad en tiempo real. Este Wil tecnologíal ser de interés en el campo de la toxicología de las pruebas de drogas, el diagnóstico de enfermedades o la investigación básica como el modelo de barrera puede ser adaptado fácilmente. Este método también ayudará a reducir la experimentación con animales, ya que permite la validación de los modelos in vitro para sustituir a los ensayos in vivo.
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Protocol
1. PEDOT: PSS Preparación de la solución
- Para 50 ml de PEDOT: PSS, añadir glicol de etileno (aumenta la conductividad) en una relación en volumen de 1:4 (glicol de etileno a PEDOT: PSS), 0,5 l / ml de ácido dodecilbencenosulfónico (DBSA) como un agente tensioactivo, y 10 mg / ml de 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GOPS) como un agente de reticulación para promover la adhesión del polímero a la realización de la lámina de vidrio.
2. OECT Fabricación (Figura 3)
- Definir los contactos de fuente y drenaje de oro térmicamente evaporados a través de la litografía del despegue:
- Girar fotorresistente abrigo en un portaobjetos de vidrio limpio normal a 3.000 rpm durante 30 seg. Dimensiones de vidrio son en 3 x 1 pulg
- Definir patrones mediante fotolitografía. Las dimensiones pueden ser modificadas, sin embargo las dimensiones mencionadas aquí, se mostró a conducir a la sensibilidad óptima. A continuación, utilice un desarrollador.
- Evaporar 5 nm y 100 nm de cromo y oro, respectivamente.
- Despegue la fotoprotección en una acbaño de Etone durante 1 hora, dejando el sustrato con la fuente y el drenaje área de contactos de Au solamente.
- La longitud deseada de la PEDOT: PSS canal es 1 mm. Esto se logra mediante el estampado utilizando una técnica de desprendimiento de parileno-C (Pa-C):
- Cargue 3,5 g de Pa-C en la configuración del recubrimiento. Uniformemente evaporar 2 micras de parileno-C en la parte superior del sustrato de Au con contactos.
- Patrón del canal mediante fotolitografía:
- Haga girar fotoprotector abrigo a 3.000 rpm durante 30 segundos.
- Utilice una máscara para iluminar canal y de contacto dorada de 20 segundos a los rayos UV, la resina fotosensible expuesta será soluble en el revelador.
- Utilice desarrollador para abrir el área del canal en el fotorresistente.
- Etch la Pa-C en el área del canal por un paso de plasma 15 min (O 2 (50 sccm) y CHF 4 (3 sccm) de plasma a 160 W) con el fin de abrir el canal y el contacto de oro.
- Depositar el PEDOT: PSS solución mezcla de capa de la vuelta al500 rpm durante 45 segundos. Hornear durante 30 segundos a 110 ° C.
- Peel-off de la Pa-C para revelar el PEDOT: PSS canal del sustrato debajo. Este canal debe superponerse ligeramente con la UA contactos establecidos en el Protocolo 1.
- Muestras Hornear durante 1 hora a 140 ° C bajo condiciones atmosféricas.
3. Conjunto de dispositivo
- Hacer PDMS mediante la mezcla de dos soluciones (por lo general suministrados juntos en un kit) en una relación de 1:10 de solución de curado en solución de base. Hornear durante 1 hora a 120 ° C.
- Diseña bien mediante el uso de una perforadora y cortar un cuadrado alrededor del área deseada.
- Pegar un PDMS bien en la parte superior del canal, para dar lugar a una zona de canal de aproximadamente 6 mm 2. Asegúrese de que los contactos de fuente y drenaje no están cubiertos.
- Hacer un soporte de plástico con un agujero en él (se puede utilizar el soporte para la inserción del cultivo celular) y luego pegarlo en la parte superior de los PDMS. Deje que se seque durante la noche.
- Pruebe el bien para el escape de cargar previamente con water.
- Suelde los cables eléctricos en el contacto de origen y de drenaje con estaño.
4. Cultivo Celular
- Preparar medios de cultivo celular como sigue:
- En DMEM, añadir 1% de glutamina, 10% suero bovino fetal, 0,5% de penicilina-estreptomicina, y 0,1% de gentamicina.
- Esterilizar el medio de cultivo celular usando un dispositivo de filtro estéril.
- Mantener células Caco-2 entre el paso 49 y 68 a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2, en medios de cultivo celular.
- Divida las células una vez por semana usando tripsina y la semilla a 1,5 x 10 4 células / inserción.
- Cambie medios de cultivo celular dos veces por semana durante 3 semanas.
5. Mediciones con OECT
- Conectar un alambre de Ag / AgCl a un SourceMeter para su uso como el electrodo de puerta. Sumergir la punta en medios de cultivo celular, que se utiliza como electrolito, como se ilustra en la Figura 1a.
- Conecte los cables de la fuente y el drenaje de tél SourceMeter (configuración de doble canal).
- Aplicar un pulso cuadrado de voltaje positivo (V GS) entre la puerta y la fuente (utilizado como electrodo de referencia: tierra). Un voltaje constante negativa entre el drenaje y la fuente (V DS) se aplica y se mide corriente correspondiente (I DS).
- Utilice una recopilación de datos programa en ejecución PC. Parámetros OECT inscritos en un programa de adquisición personalizado deberían ser las siguientes: V DS = -0.2 V, V GS = 0,3 V, V GS a tiempo = 2 seg, fuera de tiempo = 28 seg.
- Lectura de corriente de fuente-drenaje (I DS) y la corriente de puerta (I GS). Llevar a cabo la medición durante varios minutos para asegurar una señal de línea de base estable.
6. La integración de las células con OECT para la Medición
Nota: Antes del experimento, la integridad de la capa de células puede ser verificada mediante la medición de TER con un dispositivo de espectroscopia de impedancia. TER de cada 3 semanas de edad inse células Caco-2rt debe estar por encima de 400 Ω. cm 2.
- Durante el tiempo libre de la medición OECT: Retire el electrodo de puerta del electrolito, incorporar el inserto de cultivo celular, y vuelva a colocar el electrodo de puerta interior del inserto de cultivo celular.
- Llevar a cabo una medición de línea de base con las células durante varios minutos para asegurar una señal estable. Esta línea de base se utilizará como para el cálculo del valor normalizado correspondiente a una monocapa intacta (0).
7. Preparación y Presentación de los compuestos tóxicos
- Preparar una solución 1 M de EGTA en agua DI, primero ajustando el pH de la solución a 7,4 con Tris base.
- Añadir la solución EGTA en el volumen adecuado para obtener la concentración deseada (por ejemplo, entre 5 mM y 100 mM) teniendo en cuenta el volumen. La EGTA debe ser añadido en la cámara basal durante el tiempo libre.
- Medir de forma continua durante 90 min como en el Protocolo 5. Si la medición es being lleva a cabo a temperatura ambiente, la estabilidad de las células no se mantendrá constante después de 90 min.
- Al final de la carrera, rayar la capa de células para dar lugar a una destrucción completa de la capa de barrera y medida durante 15 minutos, este punto se podría hacer mediante la eliminación del filtro y sumergir el electrodo de puerta en los medios de comunicación. Esta línea de base se utilizará como para el cálculo del valor normalizado correspondiente a una monocapa destruido.
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Representative Results
Durante la primera etapa de la medición, la corriente de drenaje puede variar un poco, pero en la mayoría de los casos, debería permanecer estable (Figura 2, apartado a). Si la señal no es estable, el transistor debe ser desechado y sustituido. Esta comprobación de la estabilidad también asegura que las pérdidas iniciales en la conductividad del dispositivo no afectan a la medición posterior. Después de varios minutos de medición, el inserto con las células que forman el tejido de barrera se coloca en la parte superior del canal. La corriente de drenaje debe disminuir inmediatamente (Figura 2, apartado b.). Si la corriente de fuga no disminuye, esto podría implicar que las células no se han formado correctamente una barrera, o fueron dañadas durante la manipulación y el filtro deben ser desechados y reemplazados. Mediante la adición de un compuesto tóxico para el tejido de barrera, la modulación de la corriente de drenaje debe aumentar progresivamente o inmediatamente, dependiendo del compuesto utilizado y de la concentración (Figura 2,sección c.).
Los datos fueron recolectados a través de una SourceMeter y un programa de adquisición personalizada. De este programa se obtuvieron diferentes parámetros, que se ejecuta en un programa de análisis de datos para obtener la mitad de la modulación correspondiente a cada impulso de puerta. El medio de modulación corresponde al valor de la corriente a la mitad del pico (Figura 4). Los valores de mediados de modulación obtenidos durante la detección de una monocapa intacta se normalizaron a 0, mientras que la modulación mediados obtenido después de la cero se normalizaron a 1. Los resultados normalizados se utilizan para comparar los datos de diferentes dispositivos (Figura 5). De estos datos la respuesta a la dosis de las concentraciones de diferencia de compuesto tóxico con el tiempo puede ser visto.
Figura 1. Esquema de un Electroquímica Orgánica transistor integrado con inserto de cultivo celular a) desde una vista lateral. B) Vista superior del canal (gris) y de contacto) dimensiones (de color amarillo sobre un portaobjetos de vidrio con una longitud de canal de 6 mm y ancho de canal de 1 mm . Esta cifra ha sido modificado desde Jimison 30.
.. Figura 2 Visión general de la medición in situ de la fuga de corriente de respuesta a impulsos de puerta cuadrados a través del tiempo Las condiciones de medición son las siguientes: V DS = -0.2 V, V GS = 0,3 V, V GS a tiempo = 2 seg, fuera de tiempo = 28 seg. A) Corresponde a la OECT operados antes de la integración con las células, lo que garantiza la estabilidad del dispositivo. B) Corresponde a la integridadración de las células formadoras de tejido de barrera, asegurando de nuevo una señal estable antes de comenzar las pruebas de compuesto tóxico. c) corresponde a la adición de EGTA a las células de los tejidos barrera, tenga en cuenta la evolución de la señal en el tiempo.
Figura 3. Procesos de fabricación de la OECT. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. OECT drenar la respuesta actual a un único impulso de puerta cuadrada. Mida Ment condiciones son las siguientes: V DS = -0.2 V, V GM = 0,3 V, en el tiempo = 2 seg, tiempo de desactivación = células 28 seg. A) respuesta transitoria OECT antes (línea discontinua) y después (línea azul), la adición de tejido barrera que forman V GS crecido en un filtro. b) OECT respuesta transitoria después de la adición del compuesto tóxico en un tejido de barrera (línea naranja) y sin barrera de tejido (línea discontinua).
Figura 5. Típico resultado normalizado Desde la OECT. La respuesta normalizada de la OECT sobre introducción del dispositivo (círculo vacío), la capa de células (cruz de color negro), EGTA 5 (círculo azul oscuro) y 10 mM EGTA (círculo cian) introdujo en t = 0, se midieron durante un período de 50 min.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Esta técnica proporciona un nuevo método para integrar un transistor electroquímica orgánica con células vivas para medir la integridad del tejido de barrera. Las principales ventajas de esta técnica son la rapidez y sensibilidad, sino también el bajo coste del dispositivo para el control dinámico de tejido de barrera.
Como este método utiliza células vivas, un punto crítico es que asegúrese de usar una monocapa, lo que representa una capa de barrera intacta. Los parámetros de la barrera deben ser definidos durante la caracterización de la línea celular. Por lo tanto, es crucial para no dañar la capa de células cuando el electrodo de puerta se sumerge en el electrolito en la parte superior de la capa de células.
Otro punto importante es la fabricación del dispositivo; ninguna fuga debe ocurrir entre el borde de los PDMS y el soporte de plástico para evitar la variación de volumen de líquido. Con el fin de obtener resultados reproducibles, debe prestarse atención también a la soldadura del alambre, como sequemar el electrodo de oro que puede reducirse el / ningún contacto con el canal de polímero conductor y tan pobre / no señal.
Para facilitar el análisis y obtener mejores resultados de unos minutos de retraso entre cada paso del experimento se debe permitir que el dispositivo se estabilice entre los pasos. Como se observa una variación de la señal de dispositivo a dispositivo, se requiere la normalización de los resultados para poder comparar los resultados de cada experimento. Sin embargo, en el futuro la producción a mayor escala del dispositivo permitirá una mayor reproducibilidad dispositivo-dispositivo.
La principal limitación de la técnica es el formato, como por el momento sólo una muestra se puede medir. Esto será resuelto pronto por el desarrollo de un sensor de multiacquisition y en el futuro la creación de un formato de placa de 96 pocillos. Esto abrirá el camino para que esta técnica para su uso en el cribado de alto rendimiento de tejido barrera. En paralelo, los dispositivos planos también están en desarrollo to permitir mediciones ópticas y electrónicas simultáneas.
En resumen, un nuevo dispositivo que puede ser fabricado a bajo costo que es capaz de monitorizar libre de etiquetas de tejido barrera ha sido desarrollado. Este dispositivo presenta una mayor sensibilidad y resolución temporal más alta que los métodos existentes. La integración de los modelos in vitro con dispositivos como la OECT puede ser una gran alternativa a la experimentación con animales para descubrir drogas y toxicología.
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Disclosures
Este proyecto es apoyado por el FP7-PEOPLE-2009-RG, Marie Curie Proyecto No. 256367 (CELLTOX) y la propuesta del Consejo Europeo de Investigación ERC-2010-STG No 258966 (IONOSENSE), así como una subvención conjunta por el Conseil Regional de Provenza-Alpes-Costa Azul y CDL Pharma para ST. Damos las gracias a George Malliaras útil para los debates relacionados con el diseño y la función OECT.
Acknowledgments
Los autores de este trabajo no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clevios pH 1000 | Heraus Clevios | ||
| AZ9260 resin | Cipec Specialties | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique Dutscher | 51705 | |
| 24-well Cell culture plate BD Falcon | Dominique Dutscher | 51705 | |
| Stericup-GPT PES 0.22 μM | Dominique Dutscher | 51246 | |
| Advanced DMEM Marque GIBCO | Fisher Scientific | E3434T | |
| FBS Heat Inact. | Fisher Scientific | E3387M | |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | E3470C | |
| GlutaMAX | Fisher Scientific | E3524T | |
| Trypsin 0.05% EDTA | Fisher Scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%, | Sigma Aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | Harvard Apparatus | ||
| Photoresist | Cipec Specialties |
References
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