Summary
这个协议的细节设计，从全血具有强大的可重复性一滴测量人体中性粒细胞的趋化作用的试验。这种方法绕过了必要的中性粒细胞的分离和需要测定的准备时间仅几分钟。微流控芯片使中性粒细胞的趋化作用的重复测量随着时间的推移在婴儿或小型哺乳动物，其中样品体积是有限的。
Abstract
中性粒细胞在抵御感染和它们的数量在血液中发挥至关重要的作用，经常测量在诊所。在血液中较高的中性粒细胞计数通常持续感染的指标，而低中性粒细胞计数是一个警告标志的感染风险较高。为了实现其职能，中性粒细胞也必须能够有效地从那里度过大部分生命的血液移动，进入组织，在感染发生。因此，在嗜中性粒细胞的迁移能力的任何缺陷可以提高风险的感染，即使在中性粒细胞是存在于血液中的相应的数字。但是，衡量在诊所中性粒细胞迁移能力是一项艰巨的任务，这是费时，需要大量的血液，和专家知识。为了解决这些限制，我们设计了一个强大的微流体检测中性粒细胞的迁移，这需要未处理血单个液滴，circum气孔的必要性嗜中性粒细胞分离，并且容易量化的简单的显微镜。在该测定中，嗜中性粒细胞直接从血液滴，迁移通过小通道朝趋化因子的来源。为了防止通过同一信道的红血细胞的颗粒流，我们实现了机械过滤器具有直角转弯，其选择性地阻挡红细胞的前进。我们通过从手指刺和静脉血采集的血液滴比较中性粒细胞迁移的验证实验。我们还比较了这些全血（WB）的来源与中性粒细胞纯化样品中性粒细胞迁移，发现三个来源之间保持一致的速度和方向。此微流体平台将使人类中性粒细胞迁移的研究在临床和研究环境，以帮助增进我们的健康和疾病中性粒细胞功能的理解。
Introduction
嗜中性粒细胞贩卖起着决定的许多炎症性疾病，包括动脉粥样硬化1，细菌感染或败血症2的进度和分辨率的关键作用，以及烧伤3。对于健康和疾病状况做出的巨大贡献，中性粒细胞计数的标准血液分析通常被认为在临床和科研实验室的一部分。然而，尽管是一种最普遍的测试，中性粒细胞计数在感染和败血症的诊断价值已频频质疑4。例如，在烧伤病人的中性粒细胞的一项研究发现，嗜中性粒细胞计数和中性粒细胞迁移的功能不相关;标志着单独的中性粒细胞计数是不是免疫状态3的准确指标。虽然越来越多的难以衡量，中性粒细胞功能的能力提出了更有价值的各种条件。
T“>重要的是，许多嗜中性粒细胞缺陷是短暂的，不会被永久的遗传缺陷，已经在很大程度上忽略了诊所，直到最近的区分触发。在烧伤的情况下，中性粒细胞迁移能的过程中被监控病人的治疗，炎症状态或感染3的指标。目前在实验室（Boyden小室，邓恩室，微量法）使用传统迁移实验不能转换成临床上，因为它们需要大量的血液和繁琐费时嗜中性粒细胞分离技术（ 表1）。这些测定也不能用来监测在小的实验室动物，如小鼠的嗜中性粒细胞趋化性的瞬时变化，由于血液所需的嗜中性粒细胞隔离的体积只允许有一个样品甚至常常需要汇集血液从多个动物为一个单一的测定，例如，涉及的研究米在多个时间点ultiple条件和治疗方法可以使用目前的趋化实验可能需要上千小鼠。这限制了基础生物学研究是可以做到的，了解的损伤，感染的情况下免疫功能的复杂动态或烧伤经常研究在小鼠模型5。以满足对嗜中性粒细胞功能测定法是快速，健壮，同时要求最小的血液量，我们已经开发了直接从一个小液滴的全血测定中性粒细胞趋化性的微流体装置。它是已知的许多因素中的全血，血清，包括6和血小板7，影响嗜中性粒细胞的功能。因此，它是有益的，该全血的微流体测定最大限度地减少样品处理测量的变化趋当与体外测定8维持体内微环境中的中性粒细胞。这种方法降低时间从采血到使用传统技术时中性粒细胞迁移实验，以短短几分钟内（ 表1）。全血的微流体平台产生用于实验的长度的稳定的线性趋化梯度，没有移动部件，并且不需要外部压力源（ 例如注射器泵）。在全血中的微流体设备的设计中的关键特征是红细胞（RBC）的过滤梳机械地过滤进入设备的迁移通道的RBCs的掺入。这个过滤梳的右转弯防止需要排阻过滤，这将可能由红细胞堵塞，因此到达在WB的积极迁移阻断中性粒细胞趋化梯度。全血的微流体装置的一个12或24孔板的掺入促进人或鼠中性粒细胞趋化性的Si多种介质的筛分multaneously。
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Protocol
1，微流控设备制造
- 使用标准光刻技术，制作了1000级洁净室的母模晶片。图案的第3μm的薄环氧系负光刻胶层，根据来自制造商的说明来定义迁移通道。图案的第二50微米厚的层来定义小区负载和趋化因子的腔室。
- 使用图案化的晶片投聚二甲基硅氧烷（PDMS）的设备。大力混合的PDMS（20克）与引发剂（2克），使用塑料叉子在大型塑料托盘称重5分钟。
- 小心倒出的PDMS模具上。
- 通过将模具与浇注PDMS在真空干燥器中进行1小时脱气PDMS。
- 烘烤并在烘箱中设定为65℃固化至少3小时的PDMS微流体装置
- 冲出来用冲床具有1.5毫米的尖端直径中央WBLCs。
- 使用punc则为切出整个环形装置她的为5.0毫米的尖端直径。
- 使用胶带甜甜圈设备去除水中的微粒。
- 冲洗12孔板，用去离子水，然后用干燥的氮气。放置板在60℃的烘箱中持续5分钟。
- 氧等离子体处理的12孔板的两倍;再次单独为35秒，然后用另一个35秒的甜甜圈设备。
- 小心将设备中使用镊子板的孔中。
- 烘烤板与上热板设定为80℃下进行10分钟的连结装置。
2，微流控检测制剂
- 氧等离子体处理后，立即素的微流体装置时，该设备是亲水性的毛细管作用可促进在器件中的小通道的起动。
- 将5微升的fMLP [原液10微米]与5微升纤维连接蛋白[原液1毫克/毫升]和490微升的HBSS创建趋化解决方案。
- 慢慢的移液管＆＃160;趋化溶液成WBLC，使用凝胶加载提示（ 图1A）。移液管的额外20微升围绕该装置的外部的趋化。
- 放置板在干燥器中15分钟。通过将真空施加到该装置，将溶液滴入侧通道的装置和移位的空气扩散通过所述PDMS的。
- 从干燥器中取出板和显微镜下确认设备通道的润湿性。看着泡变小趋化解决方案进入室内。没有泡沫应该是经过真空处理装置内的存在。
- 洗WBLC和装置外部彻底除去过量的趋化溶液。这个步骤产生趋化从每个焦点趋化室（FCC的）到设备中心渐变。
- 补一个1毫升的注射器用PBS，加30 G钝针尖注射器。轻轻地插入在注射器的针尖到圆环孔的中心。轻轻推100μl的PBS中成孔以使PBS的形式在设备的顶部的液滴。
- 倾斜板和移液管1ml的PBS周围装置，以使液体收集在井的底部。吸出液体，然后重复过程总的3倍使用（而不是使用缓冲介质，如果分离的嗜中性粒细胞会在介质上加载）新鲜的缓冲溶液9。
- 每个媒体以及填补，直到设备的顶部下液体被淹没。让设备静置15分钟，使梯度达到稳定。实验结果和有限元模拟的理论数据表明，在这些设备中的梯度稳定长达24小时，小分子（ 例如 ，的fMLP）和最多为大分子量（ 例如 IL8）一个数天。
- 用凝胶加载提示，慢慢吸取2微升血液（或孤立的中性粒细胞）到每个全血洛阿鼎室（WBLC）（ 图1A）。
3，样品制备
人类嗜中性粒细胞从毛细血管血
- 收集毛细血管血液从健康志愿者，谁是没有免疫抑制剂的手指刺。所有病人的样本，并以书面的知情同意书获得，并通过批准的麻省总医院和施赖纳斯机构审查委员会的程序。
- 对于扎手指采血，洗手用水和肥皂和干燥的皮肤。加入1 ml HBSS + 0.2％HSA和10微升的Hoechst染色（32.4微米）到肝素的血液收集管（1.65 USP/50微升血液）准备anti-coagulant/stain原液。使用SurgiLance安全柳叶刀（2.2毫米深，22 G）刺破手指，擦干血第一滴，收集50微升的血液在Eppendorf管中含有股票抗凝血剂和赫斯特荧光染料溶液（10微升），轻轻混合。
人类嗜中性粒细胞从静脉血
- 画出加入10ml外周血，静脉血入含有33美国药典肝素管。
- 加入50微升的静脉血媒体和赫斯特染色如前所述。孵育血液和Hoechst的染色10分钟，以允许核荧光染色。 1小时内采血运行示例。
中性粒细胞分离从全血 - 阳性对照
- 分离中性粒细胞，使用无菌技术，从使用羟乙基淀粉10毫升静脉全血样品中分离嗜中性粒细胞（6％重量/体积）密度梯度后跟一个阴性选择磁珠分离试剂盒按照制造商的协议。
- 嗜中性粒细胞重悬的最后等分试样在concentr通报BULLETIN 4000个/μl在1X HBSS + 0.2％的人血清白蛋白。细胞保持在37°C，直到准备好运行实验。
4，显微镜和图像分析为中性粒细胞趋化测量
- 设置biochamber温度至37℃，湿度为80％，和CO 2为5％。
- 开始使用时间推移成像在显微镜（10X或更高的放大倍率）立即成像。
5，统计分析
- 每个样本中手动追踪至少50中性粒细胞。
- 计数结束时进入FCC的细胞（ 图2）。
- 计算嗜中性粒细胞的速度在使用ImageJ（NIH）（ 图2）WBLC和FCC之间的信道。
- 通过计数细胞，通过分叉的数量，并计算细胞的转向FCC和细胞退出次的数量之间的比率量化嗜中性粒细胞的方向性E设备。细胞是不定向不遵循趋化梯度，因此迁移朝向FCC和出口流道（ 图2）相等的数字。
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Representative Results
全血（WB）中性粒细胞的趋化性试验，通过测量中性粒细胞朝着渐变的fMLP（ 动画S1）的积累验证。结果证实，红细胞通过的过滤梳困而嗜中性粒细胞（蓝色）能够积极地迁移出的全血（ 图3A和电影S1）。由全血的微流体装置所形成的稳定的线性趋化梯度（绿色）用FITC-标记的葡聚糖（ 图3A中的插图）的确定和测量的荧光水平随着时间的推移。在这些设备中所产生的梯度是稳定长达24小时为小分子和最多一周较大的分子量。洗涤协议的效率通过在FCC成像本地化的荧光信号与在WBLC没有信号或周围的设备验证。该设备被旁边用来评估来自不同BL在中性粒细胞迁移的差异OOD来源。
使用该新型WB趋化平台获得的结果表明，从WB的手指刺液滴中性粒细胞，从静脉WB，或从静脉血中分离具有一致的速度（20±2毫米/分钟，蓝线）和相似的总迁移细胞迁移（ 38±所有血源（ 图3B），10个/小时，阴影条）。我们还能够量化的方向性或中性粒细胞正确地按照趋化梯度的能力。分岔掺入使我们能够量化嗜中性粒细胞迁移的定向沿趋化梯度朝向FCC与嗜中性白细胞迁移的随机下化学激活和退出设备相比，全血装置的设计。嗜中性粒细胞从所有三个血源迁移迁移与0.9（9细胞向FCC对每一个退出设备单元）的一个方向性指标。
图1示意图环形装置。 A）趋化是引到设备和梯度沿运移通道向着焦点趋化室（FCC的）形成。十六FCC的环绕每个WBLC。洗涤后，将细胞趋化仅保留在FCC，并以线性梯度沿迁移通道形成。红血细胞（RBC）的过滤梳防止红细胞堵塞通道和阻断嗜中性粒细胞活性的迁移。看电影S1 B）中性粒细胞积极迁移出的全血和积累在FCC，他们的速度，方向性和数字可以准确量化。 请点击此处查看大图版本这个数字。
图2原理图和对世行设备细胞计数方案概述。 嗜中性粒细胞积极地迁移出的2微升全血（WB）加载到全血装载腔（WBLC）过去的红血细胞的过滤梳并进入装置的入口处。小区的方向性是基于在分叉的小区的决定测定。定向中性粒细胞会跟随趋化梯度领导对焦点趋化室和非定向细胞不会遵循梯度和会随机要么向出口通道或FCC迁移与平等分配。最终细胞计数是由在FCC计数细胞计算在每个时间点。files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
图3：从全血（WB）液滴测量中性粒细胞趋。 A）WB（1微升）被装入全血装载腔（WBLC）。嗜中性粒细胞（蓝色）沿形成对FCC，B中的迁移通道的fMLP趋化梯度），中性粒细胞从世行的扎手指滴，从静脉白平衡，或者从静脉血中分离迁移相一致的数字（酒吧）和速度（蓝色迁移线）。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1为使用全血的微流体平台与一个侧通道的微流体装置和传统的Boyden小室中的中性粒细胞趋化性的协议的比较。的时间和试剂，以完成每个协议步骤的量是不同的方法来测量的中性粒细胞趋化性进行比较。全血的微流体平台降低了95％到运行该测定所需要的总时间，以及血液所需的体积> 99％。
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Discussion
在这项工作中，我们开发了一个微流体平台，从血液滴（2微升）测量嗜中性粒细胞的趋化性。红细胞从积极的中性粒细胞迁移的芯片上的机械过滤规避了繁琐的细胞分离方法如密度梯度10，正选择11或阴性选择12，这很容易通过激活嗜中性粒细胞引入伪像。红细胞的机械过滤区分我们的技术与其他微流控芯片，用于探测中性粒细胞迁移。例如，从本实验室13和以往的作品比比等人在芯片上8利用选择素，用于分离从全血样品中，前趋化性测定嗜中性粒细胞。上选择素表面分离后，嗜中性粒细胞的迁移发生在缓冲溶液中。在这些条件下，除去血清对嗜中性粒细胞趋化性的任何影响。此外，选择素是已知的通过啮合的特异性受体激活细胞，因此可以改变在体外趋化性的测量。该机械分离通过在我们的设备的RBC过滤梳不改变由本装置测量的中性粒细胞的状态。我们的设备有利于速度和细胞积累数目以及细胞方向性的鲁棒的测量。
在这项研究中，我们已经表明，从健康志愿者的嗜中性粒细胞从毛细血管全血，一滴静脉血，并从静脉血中分离迁移具有相似的速度和方向迁移14。嗜中性粒细胞的方向性的测量是重要的炎症性疾病，如烧伤3,15和创伤16，其中的方向性是已知的被削弱。减值，并在刺激中性粒细胞可迁移远离损伤部位，并可能造成伤害健康组织。该设备目前的局限性编辑在本文是在设备上细胞富集是不可能的，因此，细胞计数依赖于它们被发现的天然全血的比例。这可能在从在诸如中性粒细胞，其中嗜中性粒细胞计数低条件显著数量的细胞获得趋化测量存在问题。在我们的设备的另一个潜在的问题是由红细胞或其他细胞同时迁移的迁移细胞的空间位阻。在我们的实验中，嗜中性粒细胞能挤被困在RBC过滤梳的匝数，而不改变它们的迁移速度过去的RBCs。此外，趋化因子的浓度和效力是在诱导细胞迁移极为重要的。排查法与其他条件具有不同的趋化运行程度的剂量 - 反应曲线也可能是重要的。处理和加工更不稳定的趋化因子，如脂类介质也是至关重要的，所以它是非常重要的首要设备紧接WB负荷。最后，同样重要的是全血不吸世界银行设备之前凝结。如果这是不可能立即执行该测定下列采血血液必须存储在肝素的摇杆。样品装载应慢慢来，小心，不要引入过大的压力进入白平衡设备。
在未来，我们的设备可以用来测量在烧伤或创伤患者中性粒细胞功能的扰动不从患者的天然血清，这可能起着嗜中性粒细胞功能障碍17的关键作用除去嗜中性粒细胞。该设备还可以用于在未来以筛选潜在亲分辨率疗法，这些患者恢复正常的嗜中性粒细胞的功能。最后，这个装置还可以被设计为从其它游走细胞如单核细胞，巨噬细胞和T细胞的趋化测量。
总之，我们已经开发出一种诺夫升法测量的中性粒细胞趋化直接从全血的液滴。全血的微流体装置的一个12或24孔板的掺入同时有利于将多个条件筛选。该设备将有利于炎症的分辨率来治疗烧伤和其他炎症性疾病的介体的发展。在未来，这种设备将被用来测量扰动随着时间的推移中性粒细胞趋化功能的患者样本和小鼠模型，其中样本量有限的。
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Disclosures
有没有利益冲突披露。
Acknowledgments
来自美国国立卫生研究院支持（授予GM092804，DE019938）和烧伤的Shriners医院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
