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方法文章

用于从未处理全血中测量中性粒细胞趋化性的微流控平台

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DOI：

10.3791/51215

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2014年6月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Medical School, 3Shriners Burns Hospital, 4Harvard University School of Engineering and Applied Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种旨在通过一滴全血测量人中性粒细胞趋化性的实验方法，具有高度的可重复性。该方法无需分离中性粒细胞，且实验准备时间仅需几分钟。微流控芯片技术使得在样本量有限的婴儿或小型哺乳动物中，能够随时间重复测量中性粒细胞的趋化性。

摘要

中性粒细胞在抵御感染中发挥着至关重要的作用，其血液中的数量在临床中经常被检测。血液中中性粒细胞计数升高通常提示存在活动性感染，而计数降低则是感染风险增加的警示信号。为了发挥功能，中性粒细胞还必须能够有效地从其主要停留的血液中迁移至发生感染的组织中。因此，即使血液中中性粒细胞数量正常，任何影响其迁移能力的缺陷都可能增加感染风险。然而，在临床中检测中性粒细胞迁移能力是一项具有挑战性的任务，耗时较长，需要大量血液样本，并依赖专业操作知识。为克服这些局限性，我们设计了一种可靠的微流控中性粒细胞迁移检测方法，仅需一滴未经处理的血液，无需分离中性粒细胞，且可在普通显微镜下轻松定量。在该检测中，中性粒细胞直接从血滴出发，经由微小通道向趋化因子源迁移。为防止红细胞以颗粒流形式通过相同通道，我们采用了带有直角弯道的机械过滤结构，选择性阻断红细胞的前进。我们通过比较指尖采血和静脉血样本中中性粒细胞的迁移情况对该检测方法进行了验证。同时，还将这些全血（WB）样本与纯化中性粒细胞样本的迁移行为进行比较，发现三者之间的迁移速度和方向性具有一致性。该微流控平台将有助于在临床和科研环境中研究人类中性粒细胞的迁移行为，从而推动我们对中性粒细胞在健康与疾病状态下功能的理解。

引言

中性粒细胞迁移在决定多种炎症性疾病（包括动脉粥样硬化1、细菌感染或败血症2以及烧伤损伤3）的发展和消退过程中起着关键作用。由于中性粒细胞在健康与疾病状态中具有重要作用，其计数是临床和科研实验室常规血液分析中的常见项目。然而，尽管这是最常用的检测之一，中性粒细胞计数在感染和败血症诊断中的价值却经常受到质疑4。例如，一项针对烧伤患者中性粒细胞的研究表明，中性粒细胞计数与其迁移功能之间并无相关性，说明仅凭中性粒细胞计数并不能准确反映免疫状态3。尽管中性粒细胞功能能力的测定更为困难，但在多种疾病状态下，其功能评估被认为具有更高的临床价值。

重要的是，许多中性粒细胞功能缺陷是暂时性的，并非由永久性遗传缺陷引起，这一区别在临床上长期被忽视，直到最近才受到关注。在烧伤损伤的背景下，可在患者治疗过程中监测中性粒细胞的迁移，作为炎症状态或感染的指标3。目前实验室中使用的传统迁移检测方法（如Boyden小室、Dunn小室、微移液管检测）由于需要大量血液以及繁琐耗时的中性粒细胞分离技术，无法应用于临床环境（Table 1）。这些检测方法也无法用于监测小动物（如小鼠）中性粒细胞趋化性的短暂变化，因为分离中性粒细胞所需的血量通常仅允许采集单个样本，甚至常常需要将多只动物的血液合并才能进行一次检测。例如，一项涉及多个条件、多种处理及多个时间点的研究，若采用现有的趋化检测方法，可能需要数千只小鼠。这限制了在小鼠模型中开展有关损伤、感染或烧伤背景下免疫功能复杂动态机制的基础生物学研究5。

为满足对快速、可靠且所需血量极少的中性粒细胞功能检测方法的需求，我们开发了一种微流控装置，可直接从小体积全血样本中检测中性粒细胞趋化性。已知全血中的多种因素，包括血清6 和血小板7，影响中性粒细胞功能。因此，全血微流控检测的优势在于最大限度减少样本处理步骤，以维持 体内 中性粒细胞微环境在测量趋化性变化时的影响 体外 检测8该方法将从采血到中性粒细胞迁移实验所需的时间从传统技术所需的数小时缩短至仅需几分钟（表1）。全血微流控平台可在整个实验过程中产生稳定的线性趋化因子梯度，无活动部件，且无需外接压力源（即 注射泵）。全血微流控装置设计的关键特征是整合了一种红细胞（RBC）过滤梳，可机械阻挡红细胞进入装置的迁移通道。该过滤梳的右转弯结构避免了需要采用尺寸排阻过滤方式，后者很可能被红细胞堵塞，从而阻碍趋化因子梯度到达全血中正在主动迁移的中性粒细胞。将全血微流控装置整合至12孔或24孔板中，可实现对人或小鼠中性粒细胞趋化作用的多种介质进行同步筛选。

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方案

1. 微流控器件的制备

  1. 在1,000级洁净室中，采用标准的光刻技术制备主模具晶圆。根据制造商的说明，对第一层3 µm厚的环氧基负性光刻胶进行图形化，以定义迁移通道。对第二层50 µm厚的光刻胶进行图形化，以定义细胞加载腔和趋化因子腔。
  2. 使用已图形化的晶圆浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件。将PDMS（20 g）与引发剂（2 g）在大型塑料称量盘中用塑料叉剧烈混合5分钟 。
  3. 小心地将PDMS倒入模具中。
  4. 将带有已浇注PDMS的模具置于真空干燥器中脱气1小时。
  5. 将PDMS微流控器件置于65 °C的烘箱中加热固化至少3小时 。
  6. 使用尖端直径为1.5 mm的打孔器冲出中央的白细胞（WBLCs）。
  7. 使用尖端直径为5.0 mm的打孔器将整个环形器件冲出。
  8. 使用粘性胶带去除环形器件上的颗粒物。
  9. 用去离子水冲洗12孔板，然后用氮气吹干。将该板置于60 °C烘箱中加热5分钟。
  10. 对12孔板进行两次氧气等离子体处理；第一次单独处理35秒 ，第二次与环形器件一起再处理35秒。
  11. 使用镊子小心地将器件放置在板的各孔中。
  12. 将带有键合器件的板置于设定为80 °C的加热板上，加热10分钟。

2. 微流控实验准备

  1. 在氧等离子体处理后立即对微流控芯片进行引液，此时芯片呈亲水性，毛细作用有助于促进芯片内微小通道的引液。
  2. 通过混合5 µl趋化剂溶液来制备 fMLP [储存液 10 µM] 加 5 µl 纤连蛋白 [储存液 1 mg/ml] 和 490 µl HBSS
  3. 缓慢移液 将趋化溶液加入WBLC中，使用加样枪头（gel loading tip）图1A）。移液 额外的 20 µl 装置外部周围趋化因子的
  4. 将培养板置于干燥器中15分钟。通过向装置施加真空，使溶液注入装置的侧通道，同时排出的空气通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）扩散排出。
  5. 从干燥器中取出培养板，在显微镜下确认装置通道的润湿情况。观察趋化因子溶液进入腔室时气泡逐渐缩小的过程。真空处理后，装置内不应存在任何气泡。
  6. 彻底清洗白细胞（WBLC）和装置外部，以去除多余的趋化因子溶液。此步骤可在每个局部趋化室（FCCs）与装置中心之间形成趋化因子浓度梯度。
    1. 填充一个1-ml 注射器中装入PBS，安装30 G钝头针尖。轻轻将注射器针尖插入环形孔中心，缓慢推注100 µl 将PBS注入孔中，使PBS液滴形成于装置表面。
    2. 倾斜平板并用移液器加入1 ml 在装置周围加入 PBS，使液体汇集于孔板底部。吸除液体，并重复此过程，共进行 3 次。 使用新鲜的缓冲液溶液（如果分离的中性粒细胞将被加载到培养基中，则使用培养基代替缓冲液）9.
  7. 向每个孔中加入培养基，直至装置顶部完全浸没于液体中。让装置静置15分钟。 以使梯度稳定。实验结果与有限元模拟的理论数据表明，这些装置中的梯度可稳定维持长达24小时 小分子例如，fMLP）以及数天时间以应对较大分子量（例如，IL8）
  8. 使用凝胶上样枪头，缓慢移取 2 µl 血液（或分离的中性粒细胞）加入至每个全血加样室（WBLC）中（图 1A).

3. 样品制备

来自毛细血管血的人类中性粒细胞

  1. 采集健康志愿者指尖毛细血管血，志愿者不得使用任何免疫抑制剂。所有患者样本均通过麻省总医院（MGH）和Shriners机构审查委员会批准的程序获得，并取得书面知情同意。
    1. 进行指尖采血时，先用清水和肥皂洗手并擦干皮肤。配制抗凝剂/染色工作液：在肝素采血管中加入1 ml HBSS + 0.2% HSA以及10 µl Hoechst染料（32.4 μM），用于50 µl 血液抗凝。使用SurgiLance安全采血针（2.2 mm深度，22 G）刺破指尖，弃去第一滴血，收集50 µl血液至含有抗凝剂和Hoechst荧光染料溶液（10 µl）的离心管中，轻轻混匀。
  2. 将血液与Hoechst染料在室温下孵育10 min ，以完成细胞核的荧光染色。血液采集后1小时内完成样本检测。

从静脉血中分离人中性粒细胞

  1. 抽取10 ml 外周静脉血至含有33 USP肝素的试管中。
  2. 将50 µl 静脉血加入培养基和Hoechst染料中，操作如前所述。将血液与Hoechst染料孵育10 min ，以实现细胞核的荧光染色。在采血后1小时内完成样本检测。

从全血中分离中性粒细胞 - 阳性对照

  1. 分离中性粒细胞时，采用无菌技术，使用羟乙基淀粉（6% w/v）密度梯度法，随后按照生产商的说明书使用阴性选择磁珠分离试剂盒，从 10 ml 静脉全血样本中分离中性粒细胞。
  2. 将最终的中性粒细胞分装样品重悬于 1X HBSS + 0.2% 人血清白蛋白中，浓度为 4,000 个细胞/µl 。实验前将细胞置于 37 °C 环境中保存。

4. 中性粒细胞趋化测量的显微镜观察与图像分析

  1. 将生物培养室的温度设置为 37 °C，湿度设置为 80%，CO2 浓度设置为 5%。
  2. 立即在显微镜下使用延时成像技术开始成像（放大倍数为 10X 或更高）。

5. 统计分析

  1. 在每个样本中手动追踪至少50个中性粒细胞。
  2. 随时间统计进入FCC的细胞数量（图 2）。
  3. 使用ImageJ（NIH）计算WBLC与FCC之间通道内中性粒细胞的迁移速度（图 2）。
  4. 通过统计通过分叉点的细胞数量，并计算转向FCC的细胞数与离开装置的细胞数之间的比值，来量化中性粒细胞的方向性。无方向性的细胞不遵循趋化梯度，因此向FCC和出口通道迁移的细胞数量大致相等（图 2）。

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结果

通过测量中性粒细胞向 fMLP 梯度迁移的积聚情况，验证了全血（WB）中性粒细胞趋化实验的有效性（补充视频 S1）。结果证实，红细胞被过滤梳结构截留，而中性粒细胞（蓝色）能够主动从全血中迁移出去（图 3A 和 补充视频 S1）。利用 FITC 标记的葡聚糖确认了全血微流控装置形成的稳定线性趋化因子梯度（绿色）（图 3A 插图），并随时间测量了荧光强度。这些装置中产生的梯度对于小分子可稳定维持达 24 小时，对于较大分子量物质则可维持长达一周。通过成像观察到荧光信号局限于 FCC 区域，而在 WBLC 或装置周围无信号，从而验证了洗涤程序的效率。随后，利用该装置评估了不同血液来源的中性粒细胞迁移能力差异。

使用新型全血趋化平台获得的结果显示，来自指尖采血的全血、静脉全血或从静脉血中分离出的中性粒细胞均表现出一致的迁移速度（20 ± 2 mm/min，蓝色线条），并且来自所有血液来源的总迁移细胞数量相似（38 ± 10 个细胞/小时，阴影柱状图）（

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讨论

在这项研究中，我们开发了一种微流控平台，可用于从一滴血液（2 µl）中检测中性粒细胞的趋化迁移。芯片内通过机械过滤方式将红细胞与正在迁移的中性粒细胞分离，从而避免了使用密度梯度等繁琐的细胞分离方法。10阳性选择11，或称阴性筛选12，这些方法容易因激活中性粒细胞而引入假象。红细胞的机械过滤使我们的技术区别于其他用于研究中性粒细胞迁移的微流控芯片。例如，我们实验室此前的工作13 和 Beebe 等. 8 利用芯片上的选择素从全血样本中分离中性粒细胞，用于后续趋化实验。在选择素表面完成分离后，中性粒细胞在缓冲液中进行迁移。在此条件下，消除了血清对中性粒细胞趋化作用的任何影响。此外，已知选择素可通过结合特异性受体激活细胞，从而可能改变 体外 趋化性测量。我们设备中的红细胞过滤梳通过机械方式分离，不会改变中性粒细胞的状态，从而确保设备测量结果的准确性。该设备可稳健地测量细胞速度、细胞累积数量以及细胞运动方向性。

本研究显示，来自健康志愿...

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披露

不存在需要披露的利益冲突。

致谢

美国国立卫生研究院（资助号 GM092804、DE019938）和烧伤儿童医院基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
器件制备
SU-8MicrochemY131273
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Ellsworth AdhesivesSylgard 184 1.1 lb. Kit
标准载玻片Fisher Scientific1254951 × 3 英寸
玻璃底培养板MatTekP12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core，尖端直径 5.0 mmTed Pella, Inc.15081
Harris Uni-Core，尖端直径 1.5 mmTed Pella, Inc.15072
微流控实验准备与分析
凝胶加样枪头Fisher Scientific02-707-139
注射器Fisher Scientfic309602
钝头针，30 G ½ 英寸Brico Medical SupplyBN3005
真空采血管，肝素抗凝Becton Dickinson
HBSSSigma-Aldrich
人血清白蛋白Sigma-AldrichA5843-5G在 HBSS 中终浓度为 0.2%
纤连蛋白Sigma-AldrichF0895-1MG
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
SurgiLance 安全采血针，2.2 mm 深度，22 GSLN240
Hoechst 染色剂Life TechnologiesH3570
阳性对照
HetaSepSTEMCELL Technologies Inc.7906
EasySep 人中性粒细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies Inc.19257
等离子清洗仪March InstrumentsP-250
Lindberg/Blue M 恒温烘箱Thermo Scientific13-258-30C
不锈钢精密镊子Techni Tool758TW458
Bel-Art Scienceware 耐化学腐蚀真空干燥器Fisher Scientific08-594-15A
Dataplate 数字加热板Alpha MultiservicesPMC 720
Nikon TiE 倒置显微镜Nikon - Micro Video Instruments Inc.MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd 物镜Nikon - Micro Video Instruments Inc.MRH20101
Lumen 200 配 2 米光导，适用于 NikonNikon - Micro Video Instruments Inc.500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA 窄带 32 mm 激发滤光片 - 25 mm 发射滤光片Chroma - Micro Video Instruments Inc.31013v2
Retiga R 2000 冷却 CCD 相机，1,600 × 1,200 像素Qimaging - Micro Video Instruments Inc.RET-2000R-F-M-12-C

参考文献

  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
  4. Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
  5. De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
  6. Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
  7. Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
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  13. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
  14. Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
  15. Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
  16. Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
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