Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para medir el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra. Este procedimiento permite la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) tanto en tejidos embrionarios completos como en poblaciones unicelulares. Este protocolo llevará a cabo análisis cualitativos y cuantitativos.

Resumen

Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden causar un cambio de estado redox celular hacia condiciones de estrés oxidativo. Esta situación provoca la oxidación de moléculas (lípidos, ADN, proteínas) y conduce a la muerte celular. El estrés oxidativo también afecta a la progresión de varias condiciones patológicas tales como la diabetes, retinopatías, la neurodegeneración, y el cáncer. Por lo tanto, es importante definir herramientas para investigar las condiciones de estrés oxidativo no sólo a nivel de células individuales, sino también en el contexto de organismos enteros. En este sentido, consideramos que el embrión de pez cebra como un útil sistema vivo en llevar a cabo este tipo de estudios y presentar un protocolo para medir in vivo de estrés oxidativo. Aprovechando fluorescentes sondas ROS y líneas fluorescentes transgénicos de pez cebra, se desarrollan dos métodos diferentes de medir el estrés oxidativo in vivo: i) un "todo embrión método ROS-detección" para la medición cualitativa de estrés oxidativo y ii) una "una sola célula método de detección de ROS "para mediciones cuantitativas de estrés oxidativo. En este documento, se demuestra la eficacia de estos procedimientos, aumentando el estrés oxidativo en los tejidos por agentes oxidantes y métodos fisiológicos o genéticos. Este protocolo se presta para pantallas adelante genéticos y ayudará relaciones dirección de causa-efecto de ROS en modelos animales de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, tales como trastornos neurológicos y cáncer.

Introducción

El estrés oxidativo se define específicamente como una condición que resulta de un estado redox celular desequilibrada. Las complejas reacciones redox que ocurren de manera rutinaria dentro de las células determinan el estado redox celular. Las reacciones redox consisten en todas las reacciones químicas que consisten en la transferencia de electrones entre los átomos de las moléculas biológicas que producen la reducción y la oxidación de moléculas (es decir, reacciones redox). Estas reacciones son catalizadas por especies electrónicamente activadas (es decir, especies pro-oxidantes), que se caracterizan por una inestabilidad estructural extrema y la....

Protocolo

1. Preparación de Instrumentos y Working Solutions

1. Preparar la solución de agua los peces. Hacer una solución madre disolviendo 2 g de sales marinas 'Instantánea Océano' en 50 ml de agua destilada. Añadir 1,5 ml de existencias de peces de agua a 1 l de agua destilada para preparar listo para utilizar peces de agua (sales marinas 60 microgramos / ml concentración final). Autoclave listo para el uso del agua de pescado antes de su uso. Esta solución se utiliza como medio de embrión de pez cebra.
2. Preparar metilcelulosa para montaje embrión. Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 50 ml de agua estéril peces. Facilitar la disolución mediante el us....

Resultados

Al aplicar el método aquí descrito, se puede medir fácilmente y detectar el estrés oxidativo (y los niveles de ROS) en tejidos de embriones de pez cebra. Después de cruzar el pez cebra adultos, se recogen los huevos y se dejan desarrollar a 28 ° C a 72 h después de la fertilización (HPF). Con el fin de inducir el estrés oxidativo, se proponen dos enfoques diferentes: 1) el tratamiento de los embriones con fuertes reactivos pro-oxidantes o 2) la promoción de la formación de ROS después de la lesión tisular.

Discusión

Pasos críticos

El procedimiento para la detección de estrés oxidativo en embriones de pez cebra en el presente documento se describen comprende dos métodos diferentes. Todo el método de montaje de ROS-detección es principalmente un ensayo cualitativo para la detección de ROS-, mientras que el método de detección de ROS celular única permite mediciones cuantitativas más específicos (Figura 1). Ambos métodos ofrecen una forma rápida y fácil de evaluar vivo ROS-detección.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de peróxido de hidrógeno	SIGMA	516813	NO ALMACENAR DILUICIONES
Solución salina equilibrada de Hank 1x	GIBCO	14025
Metilcelulosa	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Mezcla de sal marina	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Csonda genérica sensible a las ROS: CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Sonda sensible a las ROS específica de las mitocondrias: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	disuelve un vial con 13 μ l de DMSO
Hidroetidina	INVITROGEN	D23107
Rotenona	SIGMA	R8875	Prepare 5 mM solución madre en DMSO.
Dimetilsulfóxido	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Bencil-7-(2-benzoxazolil)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirimidina	EnzoLifeScience	BML-EI395	disuelve el polvo en DMSO; diluito en agua de pescado
Yoduro de propidio	Sondas moleculares (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	Sondas moleculares (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref	: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Colagenasa P	ROCHE	11213857001	Disuelva el polvo a 100 mg/ml en HBSS estéril. Almacene las alícuotas a -20 ° C
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	GIBCO	10010-056
Suero fetal bovino	GIBCO	10082-147
Cóctel Completo de Inhibidores de la Proteasa Comprimidos	ROCHE		Disolver un comprimido en 1 ml de agua
0,5% Tripsina-EDTA (10x), rojo sin fenol	GIBCO	15400-054	Prepare 1x solución de trabajo antes de usar
Microscopio compuesto	Microscopio
con iluminación fluorescente	Nikon	AZ100
Software	ZEISS	AxioCamMRm
para la adquisición de imágenes de fluorescencia	ZEISS	ZEN 2011
Clasificador de células activadas por fluorescencia	BD FACSCalibur
Centrífuga	Tubos Eppendorf	5417R
FACS	BD	342065
Placa Multipocillo	BD Falcon	353047
Placas de Petri esterilizadas, no tratadas 90 mm	VWR	391-1915
Microscopio confocal	Leica	Leica SP5

estereoscópico ZEISS Cámara