Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyde oksidatif stres durumuna karşı hücresel redoks durumunda bir değişikliğe neden olabilir. Bu durum, moleküllerin (yağ, DNA, protein) oksidasyonuna neden olur ve hücre ölümüne yol açar. Oksidatif stres de etkiler, diyabet, retinopati, nörodejenerasyon ve kanser gibi çeşitli patolojik koşulların ilerlemesi. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde değil, aynı zamanda bütün organizmaların bağlamında sadece oksidatif stres koşulları araştırmak için araçlar tanımlamak önemlidir. Burada, bu tür çalışmalar gerçekleştirmek ve in vivo oksidatif stresi ölçmek için bir protokol mevcut in vivo sisteminde yararlı olarak Zebra balığı embriyo düşünün. "I) oksidatif stres nitel ölçümü için" bütün embriyo ROS-algılama yöntemi "ve ii): floresan ROS prob ve zebra balığı transgenik floresan hatlarının yararlanarak, in vivo oksidatif stresi ölçmek için iki farklı yöntem geliştirmekoksidatif stres kantitatif ölçümleri için, tek hücreli bir ROS algılama yöntemi ". Burada, oksitleyici maddeler ve fizyolojik ya da genetik yöntemlerle dokularda oksidatif stresi artırarak bu işlemlerin etkinliğini göstermektedir. Bu protokol, ileri genetik ekranlar için müsait olan ve bu tür nörolojik bozukluklar ve kanser gibi oksidatif stresle ilgili patolojiler hayvan modellerinde ROS adresi neden-sonuç ilişkilerini yardımcı olacaktır.

Introduction

Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, protein karboksilasyon ve lipid oksidasyon haline neden ve sonuçta hücre ölümüne 1. yol açar. Oksidatif stres seviyelerinin artması yaşlanma ve farklı patolojik durumların 2'nin ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stres vardiyabet, kalp-damar hastalıkları 3,4 vasküler değişikliklerden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı nöronal dejenerasyon önemli bir rol oynar ve Parkinson hastalığı 5. Ayrıca, oksidatif stres kanser ilerlemesini ve metastatik olayları 6,7 yöneten kritik bir faktör olarak kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, enflamasyon ve immün yanıtları ortaya ve diğer destek oksidatif stres 8 olabilir.

Veya nitrojen (RNS; reaktif nitrojen türleri); canlı hücreler olarak, pro-oksidatif oksijen türleri (ROS reaktif oksijen türleri) türetilir. (H 2 O 2) ve hidrojen peroksit - (O 2) ROS superoksit anyon (. OH) hidroksil radikali içerir. Birincil RNS nitröz oksit (NO). Olduğunu. İkinci reaktif türlerin bir dizi betwee kendiliğinden etkileşimleri ile üretilebilirn ROS ve RNS veya ücretsiz metaller 9 iyonların. H 2 O 2 Fe2 + hidroksil radikalleri meydana ile reaksiyona sokulması sırasında, - örneğin, süperoksit anyon peroxynitrate (ONOO) oluşturmak için azot oksit ile reaksiyona girer. ROS ve RNS nedeniyle çok biyomoleküller ile tepkimeye yetenekleri için, fizyolojik redoks durumuna 10 bakımı için tehlikeli bir tehdit olarak kabul edilir. Korumak için redoks durumu hücreleri, anti-oksidan moleküllerini ve detoksifiye edici enzimler, bir dizi ile donatılmıştır. . 11 - süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glütatyon peroksidaz ve Peroxiredoxins esas H2O 2, OH ve Oono de dahil olmak üzere pro-oksidatif türlerden hücresel koruma sağlayan, anti-oksidan enzimatik-cephanelik oluşturmaktadır. Ayrıca C vitamini ve E, polifenoller ve CoEnzymeQ10 (CoQ10) gibi anti-oksidan moleküller ROS ve tehlikeli DE gidermek için kritik öneme sahip12,13 türevleri üzerinde. Bununla birlikte, ROS ve RNS, ya da anti-oksidan sisteminde bir fonksiyon bozukluğu, aşırı üretimi oksidatif stres 14 doğru hücresel redoks durumunu değiştirir.

Onların olumsuz çağrışım yanı sıra, ROS farklı kökenli hücrelerde çeşitli fizyolojik roller oynayabilir. Hücreler normalde böyle konak savunma ve yara onarımı 15-17 gibi normal biyolojik olaylara aracılık için sinyal molekülleri olarak ROS üretir. Reaktif türlerin normal sinyalizasyon faktörleri, büyüme faktörleri, ve kalsiyum seviyeleri 18,19 hücre içi dalgalanmalara tepki olarak bu NOx (NADPH oksidaz) ve XO (ksantin oksidaz) gibi hücre içi enzimlerin hücrelerinde üretilir. Bu ROS diferansiyel örneğin p53 ya da ATM-kinaz, DNA hasarı 20 için cevabın bir ana regülatör olarak, hücresel bileşenler olarak önemli bir nükleer faktör aktivitesini modüle edebilir olduğu bildirilmiştir. Benzer ROS kuvvetle inci aracılık ederek hücresel sinyalizasyonu etkileyebilire oksidasyon ve sinyal iletimi 21 arasında önemli bir düzenleyici olarak oluşturulan protein tirozin fosfatazlar (PTP), inaktivasyonu. Ayrıca, proteomik göre yöntemler RNS aynı zamanda spesifik protein modifikasyonları ve moleküler sinyallemesinin değişikliklerden sorumlu olduğunu göstermektedir. S-RNS nitrothiols (SNO) içine değiştirerek ve bu enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda 22,23 gibi patolojik durumları ile birlikte moleküler yolları tetikleme sistein tiyol grupları ile reaksiyona girmektedir.

Hücre kültürü deneyleri sadece kısmen in vivo etkili faktörlerin sayıda yeniden beri, hayvan modellerinde 24,25 redoks çalışmalar gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Bunu başarmak için, zebra balığı oksidatif stres dinamiklerini 26 incelemek için uygun bir omurgalı hayvan modeli olarak kabul edilmiştir. Zebra balığı çeşitli avantajları omurgalı dev sırasında hücresel ve genetik olayları incelemek için izin veren yeni bir model sistemelopment ve hastalık. Embriyolarının büyük kümeler deneysel ihtiyaçları için haftalık oluşturulur ve mevcut olabilir. Ayrıca Zebra balığı embriyolarının olağanüstü optik netlik, hem de kendi küçük boyutu, bütün organizmalar 27 tek hücre görüntüleme ve dinamik bir izleme sağlar. Son on yılda, zebra balığı mutantlar önemli sayıda kanser ve genetik hastalıklar 28-31 gibi insan patolojik durumları modellemek için oluşturulan edilmiştir. En önemlisi, transjenik soylarda çok sayıda genetik ve biyolojik manipülasyonlar 32 arasında geniş olanaklar sağlamak için hazırlanmıştır. Örneğin, transgenik dokuya özgü zebra balığı hatları düzenli olarak in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır. Bu hatlar, in vivo olarak, tek hücreleri tanımlamak için yeteneği, hem de bu ihtiva anatomik yapısını sunan seçilen bir promoterin kontrolü altında bir floresan proteini ifade eder.

Çeşitli toksikolojik çalışmalar zaten t kullanmışo ilaç keşfi ve oksidatif stres 33-35 alanında için bir hayvan modeli olarak, bu omurgalının uygunluğunu gösteren, redoks homeostazı ile ilgili kimyasalların in vivo etkisini değerlendirmek için zebra balığı. Bazı floresan probları Zebra balığı larvaları 36,37 oksidatif stresi izlemek için test edilmiş olsa da, Zebra balığı dokulardaki oksidatif stres düzeyleri ve yaşam hücreleri algılamak ve ölçmek için hiçbir kurulmuş tahliller vardır. Burada zebrafish embriyoların canlı hücreler oksidatif stres in vivo ölçümü için bir prosedür tarif eder. Görüntüleme araçları, FACS, flüoresan probları ve pro-oksidatif koşullar her zebra balığı embriyolar ve dokularda oksidatif türlerinin saptanması ve miktarının belirlenmesi için basit bir deney oluşturmak için birleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması

  1. Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları "Instant Ocean" 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır.
  2. Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. Küçük tüpler içine netlik ve kısım için çözüm kontrol edin. Ay boyunca -20 ° C'de saklayın ve kullanımda alikotları çözülme. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca 950 x g'de santrifüje metilselüloz. Alikotların donma-erime döngülerinden kaçınmak.
  3. Tricaine / etil 3-aminobenzoat m, 50 ml hazırlamak100 ml su içinde, 200 mg tricaine eritilmesi ve Tris-HCl, 1 M (pH 9) ile pH 7.0 'ye ayarlanması ile etansülfonat tuzu (stok çözelti). En fazla 30 gün boyunca 4 ° C'de, bu stok saklayın. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın.
  4. Zebra balığı embriyolar oksidatif stres yaratmadan
    1. Genel oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: H 2 O 2 stok çözeltisi (hidrojen peroksit, 100 mM) eklenmesi ile oksidan, çözelti 50 ml olun balık su. 2 mM ile 100 uM arasında bir nihai konsantrasyon 2 H O 2 kullanın. Kısa bir süre kullanımdan önce bu çözüm hazırlayın. Oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. Bu çözüm saklamayın. DİKKAT: H 2 O 2, tehlikeli ve solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Yanıcı maddelerle temasında yangına neden olabilir. Davlumbaz altında işlemek ve uygun pers giymekÖnal koruyucu ekipman.
    2. Mitokondri türevi oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir 2 ml rotenone 3.9 mg çözülmesiyle bir oksidan stok çözeltisi (5 mM) olun. Karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm tutun.
      1. Çözümü kullanmak için hazır hale getirmek için balık suda 10 ml rotenone stok solüsyonu çözülür. 5-50 uM arasında bir konsantrasyonda rotenon kullanın. 100 uM daha yüksek konsantrasyonlarda rotenon kullanmayın. Uygun konsantrasyonlarda, bu oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. DİKKAT: Rotenone zehirli ve tehlikelidir. Uygun önlem ifadeleri göre tutun.
    3. Gen tarafından oksidatif strese neden knock-down: Knock-down nrf2a gen ifadesini Zebra balığı embriyolarının morfolinodur mikroenjeksiyon tarafından önceden Timme-Laragy A. ve diğerleri, 2012 38 tarafından bildirilen..
    4. Oxid Inducedoku hasarı sonrası stres Ative:. önceden Niethammer ve ark, 2009 39 tarafından açıklandığı gibi 72 hpf Zebra balığı embriyolarının kuyruk yüzgecinin bir yara marjı oluşturur.
  5. Tek hücre ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlanması:
    1. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi) 'de genel ROS-duyarlı molekül prob eritin: Genel ROS tespiti için çözümü. Bu çözüm, kısa bir süre kullanımdan önce hazırlanmış olmalıdır.
    2. Mitokondri tarafından uyarılan özgü saptama ROS Çözüm: kullanımdan hemen önce, DMSO, 5 mM stok çözelti yapma ile bir mitokondriyal ROS duyarlı probu çözülür. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla HBSS içinde stok çözeltisi çözülür.
      NOT: ROS-algılama çalışma çözümleri ışık ve oksijen maruz kalma ve kendi stok çözümleri kaçının. Kullanılarak ışık tüpü korumakbir alüminyum folyo. Saklamak veya HBSS'de çözülmüş yeniden kullanımı sondalar etmeyin. Bir ay boyunca -20 ° C 'de stok çözelti saklayın.
      DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar ve DMSO'yu tutun.
  6. Bütün montaj ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlayın: bir çalışma çözeltisi (: 2,5-5 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (DMSO içinde stabilize edilmiş) genel ROS duyarlı probu stok çözeltisi içinde çözündürülür. Işık ve oksijen maruz kalmaktan kaçınınız. Işıktan tüp koruyun. Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın. Bu çözümü saklamak veya yeniden kullanmayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar taşıyınız.
  7. PBS 1x 15 ml cenin sığır serumu 10 mi eklenerek Durdurma Solüsyonu 25 ml olun. Steril çözüm tutun. 4 ° C 'de, bu çözüm Mağaza ROS algılama yöntemi - Bu çözüm sadece tek bir hücre için gereklidir.
  8. 28 ve at Zebrafish hava inkübatör ayarlayın# 176; C.
  9. Tek hücre ROS-saptama yöntemi boyunca 4 ° C'de santrifüj ayarlayın.

2.. Yetişkin Balıkların Çiftleşme ve Zebra balığı Embriyolar Seçimi

  1. Set-up yetişkin zebrabalıkları çifti standart protokollere göre 40 haçlar. Spesifik deneysel ihtiyaçlarına uygun olarak, uygun transjenik çizgi seçin.
  2. Yumurta toplamak ve balık su / embriyo orta ile 90 mm çanak içine koyun. Embriyolar geliştirmek ve istenilen gelişimsel aşamada büyüyecek kadar 28 ° C'de yumurta tutmak (örneğin, 48 hpf, 72 hpf; hpf: saat sonra döllenme).
  3. Embriyoların geliştirilmesi için ekran. Tüm döllenmemiş yumurta veya az gelişmiş embriyolar dışlamak.
  4. 50 ml su içinde balık tricaine (stok çözelti) içinde 1 ml ilave etmek suretiyle embriyolar anestezisi.
  5. Stereomicroscope altında Tg floresan embriyolar seçin.

Oksidan Agent ile Embriyoların 3. Tedavisi

  1. 48 saat arasında en az 30 embriyolar kullanınpf ve 72 farklı durum başına HPF. Tricaine çıkarmak için taze balık iki kere su ile embriyolar yıkayın.
  2. Üç yemeklerin içine floresan embriyolar Split. En fazla 30 embriyo / çanak koymak.
  3. Yıkama çözeltisini çıkarın ve oksidan, çözelti 10 ml ya da kontrol çözeltisi gibi balık su 10 ml ekleyin.
  4. 28 ° C'de 1 saat 10 dakika boyunca inkübe embriyolar Kuluçka süresi, belirli dokularda indüklendiği oksidatif stres düzeyine göre değişir. Oksidatif stres etkilenen hücreleri ilerleyici hücre ölümünü geçmesi gibi kısa dönemler iyisidir.
  5. Dönen tarafından HBSS ve yıkama embriyoları içeren yeni bir çanak içine embriyolar transfer. 28 ° C'de önceden sıcak HBSS

4.. Tüm Dağı ROS Algılama Yöntemi

  1. Oksidan tedaviden sonra embriyolar toplayın ve küçük bir tüp içinde en fazla 10 embriyolar koydu. HBSS ile mümkün olduğu kadar yıkayın. Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpü koruyun.
  2. ROS için algılama çözeltisi 1 ml ilave edilirHer bir tüp.
  3. Işık maruz kalmasını önlemek için 28 ° C'de 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe embriyolar.
  4. Inkübasyon süresi boyunca bütün embriyo analizi için bir cam slayt hazırlar. Bir "depresyon" cam slayt metilselüloz 300 ul koyun ve bir pipet ile cam yüzeye yayılır. Metilselüloz bırakırken kabarcıkları kaçının.
  5. İnkübasyon süresi sonunda, hemen ROS algılama çözüm kaldırmak ve 2 ml HBSS ile iki kez yıkayın. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek embriyolar yıkayın. Pipet veya vorteks etmeyin.
  6. Kadar cam Pasteur pipet içine aspire embriyolar. Pipet açılışına yakın ve yavaşça pozisyon embriyolar metilselüloz içine bunları çıkarın. Ince naylon hattı ile uygun embriyolar yönlendirmek.
  7. Tedavi edilen embriyolar ile embriyo kontrol floresan karşılaştırın. Tüm embriyolar aynı kullanarak görüntülü böylece Alternatif olarak, flöresanlı bir stereomikroskop veya konfokal mikroskop parametrelerini saptamakgörüntüleme ayarları.

5.. Tek Hücre ROS-algılama Yöntemi

  1. 3.5: aşama başlatın. Her durum için en az 35 embriyo var emin olun.
  2. Yeni bir çanak içine embriyolar aktarın. Balık suya mümkün olduğunca kaldırın. Buz soğukluğunda PBS 1x 10 ml ve Proteaz İnhibitörleri Kokteyl 400 ul ekleyin. Elle forseps ile embriyolar dechorionate ve ince bir iğne ile yumurta sarısı çuval çıkarın. Not: sarısı çuval Çıkarma aşağıdaki FACS analizi için temiz örnekleri sağlar. Bu adım, FACS alet uygun bir biçimde yok edilebilir.
  3. Aktarım de-yolked, 24 oyuklu çoklu gözenekli plakanın içine embriyolar (15 embriyo / çukur) ve tüm balık suyu çıkarmak.
  4. HBSS 300 ul, 30 ul kolajenaz P, her bir oyuğa 50 ul tripsin-EDTA ekleyin.
  5. Sıkı bir pipet (1.000 ul) ile hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı embriyolar homojenize.
  6. 20 dakika boyunca 28 ° C'de inkübe edilir ve her 5 dakikada pipetleme örnekleri homojenize edilmiştir.
  7. Doku DISR edinbileşik mikroskobunda homojenat bir kısım gözlemleyerek uption. Pipetleme tek hücre süspansiyonu kolaylaştıracak. Fazla 30 dakika boyunca embriyolar inkübe etmeyin.
  8. Durdurma Solüsyonu 200 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. Hafifçe pipetleme karıştırın.
  9. Dar bir tabana sahip önceden soğutulmuş bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. Buz üzerinde tüp tutun ve ışık maruz kalmaktan kaçının.
  10. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj
  11. Hafifçe pipetleme buz HBSS ile üst faz ve yeniden askıya hücreleri çıkarmak.
  12. Hücrelerin sayısı ve sizin tüm örneklerde hücrelerin aynı numara olduğundan emin olun. Az 2 x 10 6 hücre kullanmayın.
  13. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri
  14. Süpernatantı ve ROS duyarlı probu içeren buz gibi soğutulmuş HBSS 1 ml pelet askıya.
  15. Karanlıkta 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. Oksidatif stres seviyesine göre inkübasyon süresi değişebilir ve tProbun o hassasiyeti.
  16. Bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Buz üzerinde tüpler tutmak ve FACS analizden önce ışık maruz kalmaktan kaçının.
  17. Bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) hücreleri sıralar. Tg doku floresan (örneğin, GFP) ve ROS tespiti (örneğin, belirli mitokondriyal ROS-duyarlı sondalar, genel ROS-duyarlı problar) için kullanılan moleküler prob uyarma / emisyon spektrumları uygun set dalga boyları.
  18. Her bir durum için, aynı FACS ayarlarını uygulayarak, aynı deneysel oturumdaki tüm örneklerini ölçmek. Farklı biyolojik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak floresan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Her bir durum için en az iki analiz çoğaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C'de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz.

Hidrojen peroksit (2 H O 2), genel hücre ROS oluşturan bir madde olarak, ve rotenon, belirli bir mitokondriyal ROS sürücü olarak: ilk yaklaşım olarak, spesifik ihtiyaçlarına göre iki farklı reaktif maddeler kullanılır. Rotenone Deregülasyonlar oksidatif stres 41 uyarıcılarına olan ETC, karmaşık I'in bir inhibitörüdür.

İkinci yaklaşımda ise, biz bir Zebra balığı embriyo kuyruk yüzgecinin bir yara oluşturularak ROS toplanmasına neden39. Alternatif olarak, oksidatif stres koşulları morfolinodur enjeksiyonu ile oksidatif stresin 38 sitotoksik etkilerine karşı primer hücresel savunma Nrf2 antioksidan tepki yolunu aşağı vurma tarafından zebrabalıkları dokularda teşvik edilebilir.

Oksidatif stres zebrafish embriyolar indüklenir sonra, reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesidir aktivasyonu üzerine floresan (örn. oksidasyon) olmak genel veya özel mitokondriyal ROS duyarlı problar kullanılarak ölçülebilir.

Tedavi embriyolar bütün montaj ROS algılama yöntemi ile ya da Şekil 1 'de özetlendiği gibi, tek bir hücre-ROS algılama yöntemine göre analiz edilebilir. Yöntemleri arasında seçim oksidatif stres kalitatif ya da kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için ihtiyaç dayanır. Her iki yöntemin temsil edici sonuçları Şekil 2'de temsil edilmektedir Şekil 3.

Tüm Dağı ROS-algılama Yöntemi

Şekil 2, oksidatif stres in vivo görüntüleme için bütün montaj ROS algılama yönteminin uygulanmasını göstermektedir. Özel olarak, bu yöntem, eksojen pro-oksidan tedavi yanı sıra yara yaralanma ya da gen silinmesi üzerine daha fazla fizyolojik koşullar tarafından üretilen "düşük" oksidatif stres tarafından oluşturulan "güçlü" oksidatif stres hem de takip uygulanmıştır.

Oksitleyici türlerin fizyolojik düzeylerinin 72 hpf canlı zebrafish embriyo kuyruk fin bir mikro yaralanma ya da geniş bir yara üretilmesi ile uyarılmaktadır. Bu yaralanma sonrası, 2 H O 2 yara 39. sonra yara kenar 20 dakika ile birikir olduğu gösterilmiştir. Yara kenar da oksidatif stresin birikimi görselleştirmek için, embriyolar, genel ile kuluçkalanmıştırROS-duyarlı prob ve 39 yaralama sonra 20 dakika görüntülü. Yaralı kuyrukları ile sağlam kuyruk yüzgeçleri karşılaştırarak, bu yara kenar (Şekil 2A) de flüoresan probun bir birikimi ayırt etmek mümkündür. Spesifik olmayan zayıf ışıklı sinyal her iki durumda da kuyruk dokusu çevresinde saptanır.

Yara kenar da ROS duyarlı probunun özel birikimi, 2 H, yara O 2 seviyeleri doğrulamak amacıyla bir farmakolojik yaklaşım ile düşürüldü. Bu yara kenar H 2 O 2 birikimi duox-engelleyici VAS2870 39 için son derece duyarlı olduğu gösterilmiş olduğundan, embriyolar yaralama önce bu inhibitör ile ön-muamele edilmiştir. ROS duyarlı floresan sondası karşılaştırılması, VAS ön-muamele edilmiş embriyolar ve ilgili kontroller gelen sinyal, ROS birikimi (örneğin, 2 H O 2 bağımlı olduğunu gösterir) (Şekil 2B).

Buna ek olarak, rotenon ile zebra balığı embriyolar işlenmesiyle zebra balığı dokularda oksidatif türlerin yüksek düzeyde oluşturulur. Rotenone ile tedavi edilen kontrol embriyoları ve özellikle ROS türlerin tespit etmek için genel bir ROS duyarlı probu ile inkübe edildi. Daha sonra, sonda yıkanmış ve embriyolar bir floresan-stereo bir mikroskop altında görüntülendi. Oksidatif stres embriyolar (Şekil 2C) bütün vücutta tespit edilmiştir. Yüksek büyütme görsel sonda başarıyla (Şekil 2B) metabolize edilir anatomik bölgelerini gösterir. Floresan görüntüleri (alt paneller) ROS-pozitif hücrelerini işaret ederken Parlak alan görüntüleri (üst panel), anatomik yapıları ayırt. Floresans görüntüleri ile gösterildiği gibi, esas olarak muamele edilmiş embriyoların sonuçları ile kontrol karşılaştırılmasıyla elde edilir oksidatif stres algılama, niteliksel bir rapor bulunmaktadır.

Tek Hücre-ROS Tespit Yöntemi

Şekil 3 raporlar temsilcisi FACS araziler ve tek hücre ROS algılama yöntemi uygulanarak oksidatif stres ölçümü. Bu yöntem, protokolde belirtildiği gibi pro-oksidan koşullarına tabi tutulur ve şekil açıklama ayrıntılı edildi zebra balığı hücrelerinde oksidatif stres seviyesini ölçmek için adapte edilmiştir. Tarif edildiği gibi, oksidatif stres ROS-duyarlı molekül probu ile tek bir hücre içine ayrışmış zebra balığı dokuları inkübe edilerek ölçülmüştür. Ayrışma işlemi ve FACS kendisi hücre hasarına neden olabilir, bu numunelerin analizi sadece "canlı hücreler" oksidatif stres ölçülmesi için kabul edilir olması gerekir. Bu duruma göre, ayrışmış hücreleri "canlı hücre" fiziksel parametrelerin (Şekil 3A) gösteren hücrelerin kısmını seçerek ve (Şekil 3B), ölü hücreleri hariç ile analiz edilir. Bu nedenle, numuneler için nicelendiriliroksidatif stresin ROS duyarlı prob floresansla ve bu GFP (Şekil 3C) için pozitif olarak endojen floresans için uygun. ROS duyarlı probu için negatif bir kontrol numunesi, taşıma ve teknik işlemleri ile uyarılan oksidatif strese değerlendirmek amacıyla dahil edilmelidir (Şekil 3C; paneli: Kontrol -). Bağıl FACS arsa ölçümü farklı biyolojik çoğaltır (Şekil 3D-E) ölçümlerini gösteren histogramlar gösterdi.

Hidrojen peroksit tedavileri üzerine oksidatif stres düzeyi miktarının yanı sıra, bu yöntem nrf2a morphants ve ilgili kontrol (Şekil 3F) bizim bu tür fizyolojik koşullar altında oksidatif stres seviyesini ölçmek için uygulanmıştır.

Ayrıca, mitokondriyal RO bizim bu tür özel ROS duyarlı prob ile tek hücre ROS algılama yöntemi birleştirerekS-duyarlı sondalar, belirli mitokondri hedefli bir pro-oksidan tedavileri (Şekil 3G) bağlamında, oksidatif stres ölçülmesi de mümkündür.

Şekil 1

Şekil 1.. Zebra balığı embriyolarının ROS seviyelerini ölçmek için yöntemin şematik figür. Zebra yetişkin uygun yetiştirme tankları kesilmişlerdir. Döllenmiş yumurta sonra tabaklar içine toplandı ve embriyo tam oksidatif stres. Indüksiyonu ilaç tedavileri veya genetik veya fiziksel saldırılar ile ya da, farklı şekillerde elde edilebilir geliştirmesine imkan vermek için 28 ° C'de saklanır. Alternatif olarak, genetik mutant analiz durumunda, bu inkübasyon atlayın ve ileriye taşımak mümkündür. Bu noktada, iki farklı yöntem, aşağıdaki yöntemi izlemek mümkündür. "Yiyecek m göreseviyesini arttırır ROS algılama "yöntemi (sol), zebra balığı embriyolar hemen bir flüoresan ROS duyarlı bir prob (1) ve daha sonra floresan veya konfokal mikroskobu (2) ile analiz ile inkübe edilir. "Tek hücre ROS algılama" yöntemi (sağ) olarak, zebra balığı embriyolar (1), bir flüoresan ROS duyarlı probu (2) ile birlikte inkübe edildi ve floresan tespit ve miktar tayini (3) için FACS ile analiz tek hücrelere ayrıştırılırlar. "Bütün montaj-ROS tespiti" yöntemi öncelikle Nitel analiz, kalitatif ve oksidatif stres düzeyleri kantitatif ölçümleri hem "tek hücreli göre" yöntemi hibe olarak yaşayan embriyolar oksidatif stres olarak algılanmasını sağlar iken.

Şekil 2,
72 hpf Şekil 2. Bütün montaj ROS-algılama yöntemi Temsilcisi sonuçları. A) Zebra balığı embriyolar tabi tutulduÖnceden ark Niethammer tarafından açıklandığı gibi yaralama için., 2009 39. Temsilcisi konfokal görüntüler yaralı kuyruk yüzgecinin yara marjı pro-oksidatif türleri (ROS) birikimini (ok) göstermektedir. Oksidatif türleri genel ROS probu ile tespit edilmiştir (CellROX, 2.5 uM) 20 dakika sonra yara yapılmıştır. Ölçek çubuğu 20 mikron. B) 72 hpf Zebra balığı embriyolarının yara marjı gösteren Temsilcisi konfokal görüntüler. Yara yapılmıştır önce embriyolar, 90 dakika boyunca VAS2870 (20 uM) veya DMSO ile işlemden geçirildi. Yara sonra 20 dakika; ROS genel bir ROS duyarlı probu (2.5 uM CellROX) ile tespit edilmiştir. Zebra balığı embriyolarının rotenone açtığı oksidatif stresi gösteren ölçek çubuğu 20 mikron. C) Tüm vücut görüntüsü. Oksidatif stres, kuvvetli şekilde Panel D'de gösterilen embriyoların) kaudal bölgesinde saptanır. Rotenone esas Skel etkileyen mitokondriyal ETC güçlü bir inhibitörü olanZebra balığı diğerleri kas hücreleri. Ölçek çubuğu, 180 mikron.

Şekil 3,
Şekil 3,. Tek hücreler ROS-saptama yöntemi temsil edici sonuçları. A) zebrafish embriyo tipik bir örneğini gösteren Örnek FACS arsa tek hücrelere ayrışmış. Canlı hücreler FSC-H ve SSC-H parametreleri ile göre R1 bölgede Geçitli. SSC-H: 539 (Gerilim), 1.0 (AmpGain) Modu: doğrusal; FSC-H:. Zebra balığı embriyolarının tipik bir örneği gösteren E00 (Gerilim), 2.1 (AmpGain) B) Temsilcisi FACS arsa tek hücrelere ayrışmış. FACS analizinden önce, numune, Propidium iyodür ile inkübe edilmiş olan (PG, 1 ug / ml) 5 dakika boyunca. Ölü hücreler PI floresan (FL2-H kanal) ile göre R2 bölgeye Geçitli. FSC-H: E00 (Voltaj), 2.1 (AmpGain) Modu: doğrusal, SSC-H: 539 (Gerilim), 1.0 (AmpGain) Modu: liyakın. Gerilim Kanallar: FL-2:. Gösteren 613 Log C) Temsilcisi FACS araziler pro-oksidan tedavi (H 2 O 2) ve ilgili kontrollere tabi Zebra balığı embriyolar ayrışmış. Endotel hücreleri GFP kanalı tarafından görüntülenmiştir. FACS araziler UL ve UR ​​oksidatif stres (ROS) tarafından etkilenen tüm hücreleri temsil eder. Negatif hücreler alt çeyrek (LL ve LR) üzerine çizilir. Tg (Kdrl: GFP) 48hpf de s843 zebra balığı embriyolar, 10 dakika için bir kontrol olarak, H2O 2 (2 mM) ve H2O ile inkübe edildi. Protokolde tarif edildiği gibi FACS analizinden önce, embriyolar işlenir. Oksidatif stres etkilenen hücreler genel bir ROS duyarlı flüoresan probun (, 2.5 uM CellROX) kullanılarak tespit edilir. ROS duyarlı probu ile inkübe olmayan bir numune, negatif kontrol olarak dahil edilmiştir. Ilgili kontrol ile pro-oksidan işlemine tabi örnek karşılaştırıldığında, hücrelerin sayısı, üst çeyrek (UL + UR) üzerine çizilen yüksektir. FACS müktesebataşağıdaki gibi enfraruj ayarları vardı: Gerilim kanalları: FL-1: 582 Log; FL-4:. H 2 O 2 ile tedavi edilen embriyolar ve ilgili kontrol oksidatif stres etkilenen hücrelerin yüzdesini (UL + UR) gösteren 410 Log D) Histogram. Ölçümler C'de gösterilen örnekler ile ilgilidir. Oksidatif stres etkilenen hücreler genel bir ROS duyarlı flüoresan probun (, 2.5 uM CellROX) kullanılarak tespit edilir. Sonuçlar, H2O 2 ile tedavi edilen embriyolar ve ilgili kontrol oksidatif stres (ROS +) etkilenen endotel hücrelerinin yüzdesini (GFP +) gösteren SD. E) Histogram ± n = 2 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır. Ölçümler C'de gösterilen örnekler ile ilgilidir. Sonuçlar, n = 2 nrf2a morphants oksidatif stres (ROS +) etkilenen hücrelerin yüzdesini (nrf2a MO) gösteren SD. F) Histogram ± farklı biyolojik tekrarlanmış ve ilgili kontrol ortalamasıdır24 hpf (ctrl MO). 72 hpf DMSO), 10 uM) ve ilgili kontrolleri (Ctrl;. Sonuçlar muameleye tabi tutulan embriyolarda mitokondriyal oksidatif stres etkilenen hücrelerin yüzdesi (SD Rotenone arası G) Histogram ± n = 2 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır. Bir hücre içine embriyo ayrıldıktan sonra, mitokondriyal oksidatif stres (mitokondriyal ROS +), bir mitokondriyal spesifik sonda (, 5 uM MitoSOX) ile ölçüldü. Sonuçlar ± SD n = 3 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritik Adımlar

Burada tarif zebra balığı embriyolar oksidatif stres saptanması için prosedür, iki farklı yöntem ihtiva eder. Tek hücre ROS-saptama yöntemi (Şekil 1), daha özel niceliksel ölçümlerini sağlar iken bütün montaj ROS-saptama yöntemi, esas olarak ROS-nitel olarak saptanması için bir deneydir. Her iki yöntem de Zebra balığı embriyolarının üzerinde in vivo ROS-algılama değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yol sunar. Ancak, her ikisi bazı kritik adımlar mevcut.

Yöntem I İlgili Kritik Adımlar

Bütün montaj ROS-tespiti için ilk yöntem kolayca canlı embriyolar (Şekil 2) tüm dokularda oksidatif stres tespit etmek için büyük bir avantaja sahiptir. Embriyo dokularına prob 1) geçirgenlik, 2) prob toksisite ve 3) th: Ancak dikkat edilmesi gereken ve deneyin sonucunu etkileyebilecek üç önemli kritik yönleri vardırDüşük ROS konsantrasyonu e prob duyarlılık.

Ilk yönü, özellikle yöntemin 42'nin in vivo uygulanması ile ilgilidir. ROS duyarlı prob "hücre geçirgenliği" özelliği, bu tayinin gerçekleştirilmesi için gerekli bir özelliktir. İdeal olarak, suda çözünen kimyasallar canlı Zebra balığı embriyolarının teslimat için optimum olan; Bununla birlikte oksidatif stres tespiti için reaktifler çoğu su içinde çözünmez. Bu nedenle, genellikle DMSO (dimetil sülfoksit) içinde çözünür olan problar kullanılması önerilir.

ROS prob konsantrasyonu ile bağlantılı embriyo üzerinde olası toksik etkileri vardır. Yan etkiler, normal doku hasarı (örneğin, nekroz) ya da prob hızlandırılmış metabolizması ile temsil edilmektedir. Hydroethidine prob neden embriyo ölümü ile zebra balığı embriyoların uzun inkubasyon (gün) ise yüksek dozlarda 5 - (and-6) N-karboksi-2 ', 7'-Dichlorofluorescein diasetat sonuçlarıbağırsaktaki (yayınlanmamış veriler) içindeki floresans on özgü birikimi. Bu sorunu aşmak için bu probu ile inkübasyon sırasında embriyoların izlemek için önemlidir. Aynı prob ile çeşitli konsantrasyonlarda ve inkübasyon zamanlarında testleri de yararlı olacaktır. Optimum inkübasyon süresi sağlar yüzeysel dokular hasar görmeden moleküler prob teslim ve oksidasyon. Kimyasal probları (0.5-10 uM) ile inkübasyon süreleri genellikle 10-30 dakika aralığında sabit olabilir ve 1 saat geçmemelidir. Bu durum iç embriyonik doku ile sınırlı olduğunda oksidatif türlerin miktarı fizyolojik seviyelere yakın ya da özellikle kurmak oldukça zor olabilir. Bir bütün olarak organizmanın bir ROS algılama kimyasal probu ile inkübe edildiği zaman, prob esas olarak oksitlenmiş ve floresan haline olduğu Gerçekten de, en yüzeysel dokuların (örneğin, deri, gözler ve kalp) bulunmaktadır. Daha sonra, prob giderek, iç organlara teslim karaciğer veya ettik edilirssels. Bunun bir sonucu olarak, ROS-algılayıcı prob ile zebra balığı embriyoların inkübasyon için uygun bir zaman bütün dokularda oksidatif stres tespit etmek önemlidir.

Bu yöntemi kullanarak, son olarak, bu dokularla ifade edilen oksidatif stres seviyesine probun hassasiyetini dikkate almak önemlidir. Ticari olarak temin edilebilen sensörlerinden en ince duyarlılık için karakterize edilmiş ve bu özel uygulamalar için uygun prob ampirik olarak tespit edilmesi gerektiği anlamına gelir değildir. Tüm ROS-duyarlı problar genellikle oksidatif stres, yüksek seviyelerde tespit, ancak çoğu oksidatif stres düzeyleri 43 minimal kaymalar duyarlı değildir.

Bu dezavantajı sınırlamak ve, daha detaylı ve kesin analiz izin vermek için bu oksidatif stres tek hücre tespitine dayanan ikinci yöntemi uygulamak için önerilmektedir.

Yöntem II İlgili Kritik Adımlar

Single-hücre ROS-algılama yöntemi bazı kritik adımlar sunuyor. Bunlar esas olarak tahlile ilişkili ROS duyarlı prob tipi) 1) embriyonik hücre ayrışma etkinliği ile ve 2 ile belirlenir.

Tek hücre içine embriyo ayrışma 44 flow sitometri aracılığı Zebrafish hücre analizi için önceki protokollerle uyarlanan ve şiddetle tüm prosedürü sonucunu etkilemeye iki kritik yönlerini sunar olmuştur. İkinci bir ayrışmış hücrelerin geri kazanımı ile ilgilidir ise ilk yönü embriyo ayırmak için kullanılan bir yöntem ile ilgili.

Bir hücre içine embriyo ayrışma esas ayrışma reaktiflerin konsantrasyonu (örneğin, tripsin ve kolajenaz P) tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, bu doku ayrışma etkinliği inkübe embriyolar ve gelişim aşamasında sayısına bağlı olduğu kabul edilmelidir. Erken gelişim aşamalarında Zebra balığı embriyolar (24 HPF-48 hpf) çünkü 45 büyüme ilerici dokuların larvaları (96 hpf-120 hpf) daha ayrışma maddlere daha mantıklı. Böylece, ayrışma prosedürde ayarlamalar 72 HPF farklı gelişim aşamalarında zebra balığı embriyolar ile çalışan gerekmektedir. Reaktiflerin azaltılmış konsantrasyonu, sadece kısmen embriyolar ayrışmaktadır sırasında reaktiflerle aşırı inkübasyon, hücre ölümüne neden olur. Doğru dokuları parçalamak için önemli olduğu gibi, bu tek hücre toplamak ve korumak için aynı derecede önemlidir. Önemli bir husus hücreleri doku bölünmesi sonrası elde edilir ki sıcaklıktır. Bu dokuların ya da taşıma işlemleri mekanik parçalama sekonder oksidatif stresi azaltmak amacıyla santrifüj sırasında buz üzerinde ya da 4 ° C'de hücreleri korumak için önemlidir.

Ilgili probu ile ilgili ikinci bir kritik adım, ilgi spesifik bir doku üzerinde yapılan incelemeler ile bağlantılıdır. Bir hücre popul algılamak için kolay yoluZebra balığı lenmesi son yıllarda 46,47 kurulmuştur transgenik hatları geniş tarafından sunulmaktadır. Bununla birlikte, seçilen transgenik hattın floresan ROS-algılayıcı prob ile uyumlu olmalıdır. Bu arka plan doku floresan ile düşük fakat prob tarafından yayılan belirli, floresan sinyali arasındaki çapraz konuşma önlemek için çok önemlidir.

Bu Protokol Uygulamaları

Her iki yöntem in vivo oksidatif stresi ölçmek için kolay ve uygun maliyetli bir testte sunuyoruz göz önüne alındığında, çeşitli koşullar için bu protokolü uygulamak mümkündür:

Farklı Genetik (örneğin patolojik) Koşullarında Oksidatif Stres Ölçümleri

Oksidan ve antioksidan genleri kolayca morpholinos (kayıp fonksiyon-) ya da mRNA (kazanç fonksiyon-) enjeksiyonu ile Zebra balığı embriyolarının modüle edilebilir. Gen devirerek ve microin son zamanlarda bildirdi deneylerizebra balığı embriyolarının başlıklı mRNA Projeksiyon gelişimi esnasında oksidatif stres hücrelerin korunması ile antioksidan Nrf2a ve Nrf2b genler için farklı roller kurulmuştur. Gen ekspresyon modülasyon yaklaşımları nöronal hücrelerin 38,48 hipoksi yanıt ve oksidatif strese memeli ve zebrafish arasında evrimsel korunmuş ekseni değerlendirildi. Buna ek olarak, oksidatif stres çalışma için büyük bir fırsat birkaç zebra balığı mutant hatları tarafından sunulmaktadır. Örneğin, zebra balığı ducttrip (DTP) mutant bir patolojik durum ile ilgili olarak oksidatif stresin karakterizasyonu için ilginç bir örneğini temsil eder. DTP mutant (ahcy) geni ve karakterizasyonu Ahcy aktivitesinin kaybı ROS seviyelerini 49 etkileyerek karaciğer dejenerasyonu neden olduğunu ortaya çıkarmıştır, S-adenozilhomosisteine ​​hidrolaz için bir eksiklik taşımaktadır. Eşdeğeri, bir kaybı-fonksiyonali Zebrafish mutant Nrf2 fh318 taşıyantranskripsiyon faktörü Nrf2 geninin n mutasyon, düşük omurgalıların 50 bu antioksidan genin koruyucu rolünü araştırmak için önemli bir ilgi ile kabul edilmiştir.

İlaç Bileşiklerin tarafından tetiklenmiş Redoks Devlet Ölçümleri

Küçük ilaçlar ile Zebra balığı embriyolarının tedavisi oksidatif stresi inhibe veya aktive edebilirsiniz. Biz son zamanlarda CoQ10 tedavi 51 tarafından kurtarıldı olabilir oksidatif stres kaynaklı Zebra balığı embriyolarının bu statin tedavisini göstermektedir. Alternatif olarak, insan RYR1 ilgili miyopatiler için zebra balığı hayvan modelinde oksidatif stresin analiz kası hastalığı 52 için potansiyel bir terapötik yaklaşım olarak antioksidan ilaç NAC (N-asetil sistein) rolünün altını çizmiştir.

Küçük molekülleri ve bunların oksidatif özelliklerini karakterize etmek için İlaçların Büyük Ölçekli taranması

Zebra balığı iyi kurulmuş bir hayvan modbüyük kimyasal tarama için el. Ciddi Parkinson hastalığı 53 gibi memeli nörodejeneratif hastalıklarda etkilenir dopaminerjik nöronların hayatta kalma, zebra balığı modülatörleri olarak tanımlanan antioksidanlar gerçekleştirilen küçük moleküllerin yeni bir kimyasal tarama. Bu yöntem, in vivo olarak, yeni pro-ya da anti-oksidan moleküllerin taranması için de kullanılabilir.

Önemi ve Sınırlamalar

"Bütün montaj" ve "tek hücreli" ROS-algılama yöntemlerinin hem önem basit laboratuar tekniklerini ve temel ekipmanları kullanarak oksidatif stres vivo ölçümleri gerçekleştirmek için yeteneğine dayalıdır. ROS-tespit probları ile bir arada bir hayvan modeli olarak zebrafish uygulama sadece oksidatif stres vahiy değil, aynı zamanda tek bir doku düzeyinde yaşayan bir organizma ve miktar bağlamında kendi algılanmasını mümkün kılar. Önemli olarak, bu analizler olabilir,ticari olarak temin edilebilen araçları ile gerçekleştirilen ve gerçekleştirilecek özel uzmanlık gerektirmez. Buna ek olarak, her iki yöntem de zaman alıcı işlemleri değildir ve örneklerin büyük kümeler için uygun bir süre ile uygulanabilir. Hep birlikte bu pratik avantajlar, özellikle önemi bu yöntemler in vivo oksidatif stres analizini geliştirmek için yapmak.

Bununla birlikte, bu deneyler, aynı zamanda bazı sınırlamalar göstermektedir. Genel olarak, şu anda piyasada mevcut en ROS-duyarlı sondalar canlı hücrelerde oksidatif stres seviyelerinin ince kalitatif ve kantitatif analiz için değerli değildir. Flüoresan bazlı tahliller 54 Özellikle de, ancak son zamanlarda özgüllükleri ile ilgili kaygılar ortaya edilmiştir - (. O 2) yaygın olarak kullanılan hydroethidine ve MitoSOX probları süperoksid algılama için tasarlanmıştır. Benzer bazı raporlar özel H 2 için diklorofloresandiasetat diasetat'ın (DCFH-DA) hakkında şüpheler ileri 2 55,56 algılama. Ayrıca, bu redoks-aktif fluoresan probları kısmen non-spesifik aktivasyonunun (örneğin doku otomatik floresans) ile karakterize edilen ve oksidasyon sonrasında geri değildir. Floresan prob ROS tarafından oksitlenir kez geri floresan olmayan azaltılmış duruma gelemez. Dolayısıyla zamansal çözünürlüğe sahip ROS dalgalanmalar tespit tür kimyasal prob 43 uygulanmasıyla sınırlıdır.

Bu alanda hatırı sayılır bir sınırlaması özel bir RNS tespiti için sensör eksikliği ile temsil edilmektedir. Son zamanlarda, proteomik göre yöntemler RNS nitroso-stres biyolojik aktif olarak kabul edilir ve protein oksitlenme / nitrasyon (örn., anti-SNO-sistein, anti-3-özgü antikorlar kullanılarak imüno deneyleri ile değerlendirilebilir protein modifikasyonları neden olduğunu göstermiştir nitrotirosin) 22,23. Ancak, tüm bu deneyler, oksidatif stre sadece dolaylı ölçümleriss RNS tarafından tetiklenen ve vakaların çoğunda onlar canlı hücreler veya Zebrafish embriyolar canlı için geçerli değildir, yani, hücresel özler gerektirir.

Konvansiyonel prob için geçerli bir alternatif genetik olarak kodlanmış redoks duyarlı floresan proteinleri ile temsil edilir. Bu grubun önemli maddeler: yeşil floresan protein, rxYFP ve cpYFP, ​​sarı floresan protein ve hiper prob, belirli bir H 2 O 2-duyarlı floresan sonda 57 türetilmiş iki türetilmiş roGFP. Floresan proteinleri tarafından oluşturulan bu işlenmiş redoks problar her flüoresan bazlı rasyometrik quantifications izin vermek ve kimyasal sondalar göre (saniye dakikaya kadar) daha yüksek zamansal çözünürlüğe olanak 58. In vivo ifade eden hiper zebra balığı transjenik çizgi ile gösterildiği gibi, bu biyosensör uygulanması da mümkündür endojen H 2 O 2 seviyeleri 39,59 gerçek zamanlı algılama için. Bengenetik olarak kodlanmış sensörleri ile zebrafish mplementing oksidatif stresi araştırmak için optimal bir sistem sunmaktadır, ancak bir transgenik hayvan hattı ve uygun görüntüleme araçları kurma gerektirir. Burada yer zebrabalıkları oksidatif stres saptanması için prosedür, genetik yöntemlerine göre daha az doğru olmakla birlikte, hızlı ve pro-oksidatif türlerin yüksek seviyelerinin in vivo tespiti için bir birinci tahlil sağlar. Bireysel reaktif oksijen ve / veya azot türlerinin doğru ölçüm anda bu araştırma alanının bir sınırı vardır. Gelecekte, önümüzdeki nano redoks sensörleri bu sorunu çözmek için yardımcı olabilir. Nanoparçacık ve nanotüp göre, redoks-sensörlerinin başarılı bir uygulama çeşitli in vitro çalışmalarda test edilmiş, ancak şimdi 60 kadar in vivo tahlilleri gibi kullanılamaz edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 89, Zebra balığı embriyolar endotelyal hücreler redoks durum analizi oksidatif stres algılama, FACS (fluoresan ile etkin hale hücre sıralayıcı) moleküler problar
Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter