In vitro metode til at observere E-selectin-medierede interaktioner mellem Prostata cirkulerende tumorceller afledt fra patienter og humane endotelceller

Summary

Vores rapport beskriver en unik metode til at visualisere og analysere CTC / EF interaktioner i prostatakræft under fysiologiske flow.

Abstract

Metastase er en proces, hvor tumorceller kaste fra den primære tumor intravasate blod vaskulære og lymfesystemet, derved at få adgang til ekstravasere og danne en sekundær niche. Ekstravasation af tumorceller fra blodet vaskulære system kan undersøges ved hjælp af endotelceller (EC'er) og tumorceller opnået fra forskellige cellelinjer. Indledende undersøgelser blev udført ved hjælp af statiske forhold, men det er veldokumenteret, at ECS opfører sig anderledes under fysiologiske flow. Derfor er forskellige flow chamber samlinger i øjeblikket anvendes til at studere kræft celle interaktioner med EC'er. Aktuelle flowkammer forsamlinger tilbyder reproducerbare resultater ved hjælp af enten forskellige cellelinjer eller væske ved forskellige shear stress. Men for at observere og studere interaktioner med sjældne celler såsom cirkulerende tumorceller (CTCs), skal gøres til den konventionelle flowkammer samling visse ændringer. CTCser en sjælden cellepopulation blandt millioner af blodlegemer. Derfor er det vanskeligt at opnå en ren population af CTCs. Forurening af CTCs med forskellige typer af celler, der normalt findes i omløb er uundgåelig hjælp til stede berigelse eller udtynding teknikker. I denne rapport beskriver vi en unik metode til fluorescens label cirkulerende prostatacancerceller og studere deres samspil med ECS en selvstændig samlet flow kammer system. Denne teknik kan anvendes yderligere til at observere interaktionen mellem prostata CTCs og helst protein af interesse.

Introduction

Metastase er en kompleks flertrinsproces, der forbliver dårligt forstået. Den E-selectin/selectin ligand akse har vist sig at spille en vigtig rolle i tumormetastase ved at fremme primære adhæsive interaktioner mellem det vaskulære endotel celler og cancerceller ^1,2. Endotel (E)-selectin er et transmembrant protein, der udtrykkes af aktiverede endotelceller, mens forskellige E-selectin ligand (r) udtrykkes af tumorceller ^3. Talrige in vitro-fremgangsmåder med succes er blevet anvendt til at modellere E-selectin/selectin ligand interaktioner mellem tumorceller og endotelceller (EC'er) ^1.. At studere disse interaktioner er forskellige flowkammer systemer, der anvendes til at simulere blod kar-systemet. Blandt strømningskammeret samlinger er parallel-plade-strømningskammeret (PPFC), sammenholdt med EC'er rutinemæssigt anvendes som en in vitro model, der simulerer in vivo shear stress. I dennemetode EC'er dyrkes på en 35 mm skål og efter opnåelse et monolag, er EC'er knyttet til PPFC og forskydningsspænding baserede eksperimenter udføres.

Men PPFC og andre nuværende systemer præsentere mange begrænsninger til at studere klæbende interaktioner mellem cirkulerende tumorceller (CTCs) afledt fra patienter og ECS, primært fordi CTCs er en sjælden population af celler, skur fra den primære tumor, der cirkulerer blandt millioner af blodceller (1 CTC per 10 ⁹ celler i blodet) ^4.. Derfor, i modsætning til ubegrænset udbud af dyrkede cellelinier, lavt CTC tæller føre til meget få og sjældne CTC / EF interaktioner, der kræver ordentlig flow kanal bredde at registrere interaktioner for afspilning analyse. Derudover, da patientens afledte CTCs er et urent befolkning, derfor en identifikation markør er forpligtet til at spore CTCs i specifikke. For at løse dette problem, har vi udviklet en ny metode til at identificere prostatacancer (PSA) CTCs ved at udnytte det faktum, at næsten alle disse CTCs ekspres prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) på deres celleoverflade ^5,6. I denne rapport har vi brugt prostata cancer cellelinie, MDA PCa2b (MDA), at demonstrere potentialet nytte af vores nye system til at studere prostata CTC interaktioner med ECS sidst at forstå den mekanisme af metastaser.

Vores metode kan anvendes til forskellige shear baserede eksperimenter, der simulerer in vivo vaskulære system ^7-9. Udover behandlingen PCa CTC / EF interaktioner, kunne strømmen kammer system nemt tilpasses til analyse af perifert blod mononukleære celler eller tumorceller interaktioner med EC'er. Den lette demontering og samling af flowet kammeret, en mikroobjektglas III ^(0,1) (herefter benævnt mikroobjektglas), giver mulighed for dyrkning EC'er under perfusion og stimulerende EC'er med forskellige cytokiner at inducere PRotein udtryk. Desuden dyrkes EC'er rekombinante proteiner, såsom E-og P-selectin kan overtrækkes på mikroobjektglasset og interaktioner med tumorceller kan observeres under laminare strømningsbetingelser ^10.

Protocol

1.. Dyrkning HUVEC'er om Microslides for at observere CTC-endotel Interactions

1. Under vævskultur hætte, først skylles mikroobjektglas, kanalbredde på 1 mm med PBS. Forsigtigt belægge mikroobjektglas med 200 pi 50 mg / ml fibronectin (opløst i PBS) under anvendelse af en 1 ml-Luer-lock sprøjte.
2. Dæk mikroobjektglas med låget og holde det inde i vævskultur hætte i 30 min. Langsom dispensering af væsken i mikroobjektglas forhindrer bobledannelse i kanalen.
3. Perfuse 200 pi varm (37 ° C) HUVEC vækstmedium (M199 medier, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml heparin, 100 ug / ml endotelcellevækstfaktor og L-glutamin) over mikroobjektglasset og inkuberes i 20 min ved RT. Under perfusion, forberede HUVEC celle suspension.
4. Skyl HUVEC'er med PBS, og der tilsættes 0,05% trypsin-EDTA i 1-2 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge HUVEC'er i 2 ml vækstmedium ved 180 xg i 5 min.
5. Måle koncentrationen i cellen ved hjælp af en neubaUER hæmocytometer og forberede 10 ⁷ HUVEC celler/100 pi vækstmedium. Derefter forsigtigt fjerne mediet fra indløbet af mikroobjektglas ved hjælp af en 200-ul pipettespids.
6. Bring mikroobjektglas til øjenhøjde og med en 1-ml luer-lock sprøjte forsigtigt perfuse 200 pi forberedt koncentration af HUVEC'er ind i kanalen. Forsigtighed er påkrævet ved dette trin for at forhindre bobledannelse. Hvis bobler, holde perfusion til en lidt længere tid, før bobler ind udløbsrenden.
7. Sæt et lige volumen (~ 80 ul) af HUVEC-medier i både indløb og udløb af mikroobjektglas. Dette forhindrer strømmen af ​​celler i begge retninger.
8. Dæk dias og holde det i inkubatoren (37 ° C) i 1,5 time.

2.. Udarbejdelse af Flow Afdeling Assembly for Overnight HUVEC Kultur på et mikroobjektglas

1. Placer en steril 20 ml sprøjte, kvindelige og mandlige luer-stik, slanger og en sprøjtepumpe i inkubatoren for 15 kmn.
2. For minimalt dødvolumen bruge slangen med indvendig diameter på 0,04 inches. Mindre rørdiameter forhindrer bobledannelse.
3. Fyld 20 ml sprøjte med varm (37 ° C) HUVEC medier (12 ml). Fastgør slangen med stikkene på sprøjten. Fjern bobler. Forbind denne samling til mikroobjektglas.
4. Udfylder indløb mikroobjektglas med HUVEC medier. Bring fyldt 20 ml sprøjte fastgjort til konnektoren ved siden af ​​mikroobjektglas. Forsigtigt fastgøre stikket til mikroobjektglas.
5. Bring opsætning i rugemaskine og tilslut den til sprøjtepumpe, fastsat til 10 ul / min shear rate. Lad cellerne O / N i inkubatoren ved 37 ° C.
6. Næste dag, skille opsætningen ved at fjerne stikket er fastgjort til indløbet af mikroobjektglas.
7. At opregulere E-selectin-ekspression på EC'er, forberede frisk vækstmedium indeholdende IL-1β ved 10 ng / ml i 4 ml medium. Aspirer medierne i en 10 ml sprøjte. Fjern than medier fra indløb mikroobjektglas og tilslut sprøjten til diaset.
8. Indstil sprøjtepumpen på 10 ul / min forskydningshastighed i 4 timer i inkubatoren.

3.. Af anti-PSMA (J591-488) mærket prostatakræftceller

1. Under IL-1β inkubation af HUVEC'er, forberede anti-PSMA J591-Alexa488 mærket PCA celler. Tilføj 0,05% trypsin-EDTA til MDA celler i 1 min. Udsæt ikke celler til trypsin i længere tid, da det kan påvirke glycopeptiderne er til stede på celleoverfladen. Enzym celledissociationsbuffer reagens kan også anvendes i stedet for trypsin. Centrifuger ved 200 x g i 5 min.
2. Resuspender MDA cellepelleten i 1 ml H / H-buffer (Hanks balanceret salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM _CaCl2). Tilføj anti-PSMA J591-Alexa488 antistof ved 20 mg / ml i 30 minutter ved RT i et mørkt sted. Resuspender cellerne under inkubationen.
3. Efter 30 minutter centrifugeres cellen opløsning ved 800 xg i 5 min. ASPIsats, og pellet resuspenderes i 1 ml H / H-buffer. Tæl mærkede MDA celler og bringe den endelige koncentration til 1x10 ⁶ celler / ml. Fyld en 5 ml sprøjte med J591-488 mærkede MDA celler og fjerne boblerne.

4.. Af anti-PSMA (J591-488) mærket CTCs Beriget fra PCA Patienter

1. Indsaml 7,5 ml blod fra patienter med prostatakræft i en blå kasket rør (indeholdende natriumcitrat). Forsigtigt fortyndet blod 1:01 i 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Tilføj 5,3 ml Ficoll-Paque plus i en 50 ml konisk rør. Lag fortyndede blod oven på Ficoll-Paque. Centrifuger ved 400 x g i 30 minutter.
3. Pre-coat alle rørene eller tips kommer i kontakt med CTCs med 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCI _2/4 mM _MgCl2 (R / S-puffer) for at forhindre ikke-specifik binding af CTCs til overfladerne. Oprethold 4 ° C temperatur medier og buffere, der kommer i kontakt med CTCs.
4. Indsaml perifert blod mononukleære celler (PBMC'er)-fraktionindeholder CTCs fra grænsefladen i en anden 50 ml konisk rør, der indeholder 30 ml R / S buffer. Centrifuger ved 400 x g i 8 minutter.
5. Pellet resuspenderes og vaskes igen i R / S buffer ved 400 xg i 8 min. Efter centrifugering pellet resuspenderes i H / H buffer. Tilføj anti-PSMA J591-488-antistof ved 20 mg / ml i 30 minutter ved RT i et mørkt sted.
6. Efter 30 minutter centrifugeres PBMC'erne indeholder J591-488 mærkede CTCs ved 800 xg i 5 min. Resuspender i H / H buffer. Fyld en 1 ml sprøjte (præ-overtrukket med R / S-buffer) med prøven.

5.. Udarbejdelse af Microscope, Sprøjtepumpe og Flow Chamber Assembly

1. Tænd for omvendt mikroskop og indstil Kohler belysning ved 10X mål. Bring sprøjtepumpen på samme niveau som prøven scenen af mikroskopet og sæt den til 1 dyn / cm ² forskydningsspænding (~ 10 ul / min.)
2. Åbn Zeiss AxioVision software. Vælg det mål på computerskærmen. Opret en nymappe under værktøjer mulighed i softwaren.
3. Åbn smarte eksperimenter mulighed i AxioVision og justere indstillingerne til at optage korte 30 sek videoer i 30 min.
4. For levende fluorescerende video, skal du indstille billedet indstillinger-12 msek Eksponering, 2 x 2 bin 5 Gain. Disse parametre bidrage til at nå videoer tæt på video frame rate (~ 23 frames per sekund) med Zeiss MRM kamera.
5. At visualisere fulde bredde af flowet kanal ved 10 X mål på computerskærmen, skal du bruge en C-mount-adapter (0,63 xf/60 mm Interface).
6. Tænd lampen kviksølv.
7. Anbring sprøjten og stik indeholdende celler på sprøjtepumpen.
8. Bring IL-1β stimuleret HUVEC'er fra inkubatoren. Tilslut stikket til den fyldte indløb kanal mikroobjektglas indeholder HUVEC'er.
9. Tilslut udløbskanalen med konnektoren fastgjort til slangen. Sæt slangen i en skål eller 15 ml konisk rør til opsamling af gennemstrømningen.
10. Start Infusividere gennem mikroobjektglas på 10 ul / min. Overhold samspillet mellem endotelceller og mærkede MDA celler eller mærkede CTCs stammer fra patienter under 488 nm filter på epifluorescensmikroskop.
11. Start optagelse eksperimentet som 30 sek korte videoer. Under afspilning analyse, måle rullende hastighed. Rolling hastighed måles ved at dividere den tilbagelagte afstand af cellerne over tid.

6.. Immunfarvning af mikroobjektglasset

1. Fjern medier fra ind-og udløb af mikroobjektglas efter perfusion MDA celler på IL-1β-stimulerede HUVEC'er i 10 min.
2. Ved hjælp af en 200 gl tip, løber varm (37 ° C) PBS indeholdende calcium og magnesium i indløbet af mikroobjektglasset i 5 min. Vip mikroobjektglas bruge låget som en prop på bænken. Hold mikroobjektglas i en skrå stilling for alle de inkubationerne under immunfarvning.
3. Lave HUVEC'er ved perfusion varm 2% formaldehyd i indløbet
4. Tilføj triton-X 100 (0,1%) i 5% BSA i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
5. Skyl to gange med PBS i 5 minutter hver. Blok med 5% BSA i PBS i 30 minutter.
6. Inkuberes med primære antistof gede-anti-VE-cadherin (1:100) i 2,5% BSA O / N ved 4 ° C.
7. Næste dag, vaskes to gange med PBS i 5 minutter hver. Tilføj sekundær æsel anti-ged 647-antistof i 45 min. Vaskes to gange med PBS i 5 minutter hver.
8. Inkuberes ved RT med humaniseret J591-Alexa488 konjugeret antistof i 1 time.
9. Vaskes to gange med PBS i 5 minutter hver. Tilføj DAPI i 5 min. Vask med destilleret vand i 5 min.
10. Tilføj PBS (eller Mowiol for langsigtet opbevaring). Visualiser mikroobjektglas under konfokal mikroskop.

Representative Results

Figur 1 viser en O / N-kulturen af et monolag af EC'er på mikroobjektglas. Skalering på figur 1A viser, at 100% af mikroobjektglasset er synlig ved hjælp af 5X mål, mens 70% er synlig ved hjælp af et 10X objektiv (figur 1B). For E-selectin medierede interaktioner, celler rullende på kanterne ikke anset som gør mere end 70% af den mikroobjektglas tilgængelig for video-optagelse og afspilning analyse. Det er vores erfaring, i første omgang dette set-up samling brug for nogle praksis at kultur et monolag ECS ​​under forskydningsspænding. Efter etablering af EF-vækst på mikroobjektglas, vi mærkede MDA, prostatacancerceller. Specificiteten af ​​J591-488 anti-PSMA antistoffet blev testet ved hjælp af MDA celler spiket i rask donor blod og mærket med fluorescerende mærket anti-PSMA J591-488 monoklonalt antistof. Ingen PSMA immunfarvning blev observeret i PBMCer (data ikke vist). For at udelukke den mulighed, at J591-488 binding og internalisering alters rullende adfærd, vi mærkede MDA celler med J591-488 og sammenlignet den rullende adfærd med umærkede MDA celler ved forskydningsspændinger spænder 1-10 dyn / cm ^2. Boksen plot viser fordelingen af ​​de rullende hastigheder både umærkede og J591-488-mærkede MDA celler på IL-1β-stimulerede EC'er på forskellige shear stress. Ingen signifikant forskel blev observeret i de rullende hastigheder på 1 og 5 dyn / cm ^2, p = 0,634 og p = 0,601, (figur 2). Ved højere forskydningsspænding på 10 dyn / cm ² blev en statistisk signifikant forskel observeret mellem de rullende hastigheder umærket og J591-488-mærkede MDA-celler (p <0,05). Tidligere undersøgelser viser, at ved højere forskydningsspænding (> 3 dyn / cm ²⁾ betingelser, færre tumorceller klæbe og roll on ECs forhold til lavere forskydningsspænding betingelser ^11,12. Derfor er undersøgelser analyserer samspillet mellem tumorceller og ECS ​​udført ved lavere forskydningsspændinger. Thos, vores data tyder på, at CTCs kan mærkes med J591-488, og at fluorescerende mærkning af CTCs påvirker ikke signifikant den rullende adfærd i en bred vifte af shear stress. Notatet, vi ikke afsløre eventuelle CTC / EF interaktioner i fravær af IL-1β stimulering ECS ​​(data ikke vist). Hertil kommer, som et bevis på princippet har vi også mærket berigede CTCs isoleret fra CRPC patienter med J591-488 og perfunderet i IL-1β-stimuleret ECS. En tid syet video viser de forskellige typer af interaktioner mellem prostata CTCs og ECS (Video 1). Videoen viser tre typer af interaktioner stabil vedhæftning (CTCs ikke frigøre selv efter 30 sek), tethering (CTCs vedhæfte og vedhæfte), og ingen interaktioner. Microslides kan let immunfarvet og fluorescerende billeder kan tages fordi microslides har lignende optiske egenskaber som et 1,5 mm tykt dækglas ^7. Figur 3 viser den faste adhæsion af J591-488 mærkede MDA celler agtenis perfusion i IL-1β-stimuleret ECS.

Figur 1:. Et monolag af endotelceller dyrket på mikroobjektglas HUVEC'er blev dyrket O / N på en fibronectin (50 pg / ml) overtrukket mikroobjektglas III ^(0,1) under forskydningsspænding (1 dyn / cm ²⁾ A) I 5X mål. (EF Plan Neofluar 5X/0.16) blev fuldstændig flow kanal bredde med kulturperle ECs overholdes. Bredden af kanalen blev målt til 1,545.95 um. B) ved 10X objektiv (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 um af kanalen blev observeret. Dette tyder på, at ECS kan dyrkes O / N på mikroobjektglas og 70% af mikroobjektglas er synlig ved 10X forstørrelse. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 2. Rolling hastighed MDA celler på EC'er dyrkes på mikroobjektglas. En million umærkede og J591-488 mærkede MDA celler blev perfunderet i IL-1β-stimulerede HUVEC'er. Ti videoer på forskellige felter på mikroobjektglas blev registreret på 1,5 og 10 dyn / cm ^2. Forskydningsspænding beregningerne blev leveret af producenten. Offline analyse for det rullende hastighed blev udført. n = antallet af celler tælles for de rullende hastighedsmålinger. Box plot viser fordelingen af ​​de rullende hastigheder og median forskelle mellem J591-488 mærkede og umærkede MDA celler. p <0,05, Wilcoxon rank sum test. Cirklerne repræsenterer outliers. Klik her for at besÃew en større version af dette tal.

Figur 3. Immunfarvning MDA celler interagerer med EC'er på mikroobjektglas. En million MDA celler blev perfunderet i IL-1β-stimulerede HUVEC'er ved 1 dyn / cm ² forskydningsspænding. Efter perfusion blev immunfarvning udført på mikroobjektglas. De gule pilespidser viser MDA celler klæbet fast til ECS. PSMA = Rød, VE-Cadherin = Grøn, DAPI = Blå. Det fusionerede billede viser alle farverne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1. En video, der viser samspillet mellem IL-1β-stimulerede HUVEC'er og anti-PSMA J591-488-mærkede CTCs beriget fra en prostatakræft patient. Et monolag of HUVEC'er blev dyrket på mikroobjektglas III ^(0,1) og anti-PSMA J591-488-mærkede perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) indeholdende CTCs beriget fra en patient blev perfuseret på HUVEC'er ved 1 dyn / cm ^2. Under perfusion blev registreret kort 30 sek videoer på forskellige felter på mikroobjektglas. Købet tid af videoen vises i nederste venstre hjørne. Forskellige korte videoer blev syet sammen til at kompilere denne video. På 2:16:36, en ikke-interagerende CTC ind i øverste venstre synsfelt; på 2:19:16, en anden ikke-interagerende CTC kommer ind i venstre hjørne synsfelt; på 2:23:12, er et stabilt klæbet CTC i den øverste midterste synsfelt set. På 2:38:09 er et stabilt klæbet CTC ses på højre side af synsfeltet ses. Denne video er taget med både lys-felt og fluorescerende kanal for at vise samspillet mellem PBMC'er så godt. På 2:40:18, blev stabilt adhærerede CTCs observeret i den øverste midterste synsfelt. Denne video er taget ved hjælp af lys-feltog fluorescerende kanal for at vise rullende adfærd i PBMC'er. Fra 2:51:39 gennem 2:51:49 blev en CTC udstiller tethering adfærd observeret i bunden synsfelt. Klik her for at se video.

Discussion

På grund af det lave antal CTCs blandt blodlegemer, er det vanskeligt at isolere CTCs som en ren population af celler. For at studere CTC / EF interaktioner, den sjældne og urene befolkning CTCs stiller to store udfordringer: a) identifikation af CTCs blandt blodlegemer; b) Observation af CTC / EF interaktioner.

For at overvinde den første begrænsning identificere prostata CTCs blandt blodlegemer, tog vi fordel af det faktum, at stort set alle prostata tumorceller udtrykker PSMA ^6. Monoklonalt antistof J591-488 er internaliseret efter celle-overflade binding tyder på, at PCa CTCs kan mærkes ex vivo og undersøgt for CTC / EF interaktioner ^13. For optimal internalisering af antistoffet og maksimal immunofluorescens inkuberede vi MDA celler med antistof ved enten 4 ° C eller 37 ° C i enten 30 minutter eller 1 time. Vi observerede, at den maksimale immunofluorescens blev observeret ved37 ° C i 30 minutter (data ikke vist) og immunofluorescens mærkning prostataceller påvirkede ikke rullende adfærd sammenlignet med umærkede prostataceller.

For at overvinde den anden begrænsning, vi testede forskellige flowkammer forsamlinger såsom PPFC, BioFlux MicroFluidics-system, og Microslides ^7.. Den PPFC er blevet en grundpille for at undersøge leukocyt og tumor celle interaktioner med EC'er under fysiologiske flow betingelser ^9. Dette flow-system fungerer godt for at studere interaktioner af stort antal celler, såsom cancer cellelinjer, men ikke ideel til at observere og undersøge samspillet mellem sjældne celler såsom patient-afledte CTCs og ECS. CTCs, at sjældne celler kan interagere med EC'er tilfældigt på ethvert sted i strømningskanalen derfor bliver optagelse af den fulde bredde af strømningskanalen nødvendig for at observere og analysere de sjældne begivenheder interaktioner mellem CTCs / EC'er under afspilning analyse. The bredde silastic pakning anvendes i PPFC (2,5 mm) giver ikke en fuld synsfelt under 10x objektiv. Mens, til en lavere forstørrelse end 10X målsætning, bliver det vanskeligt klart at observere CTC / EF interaktioner. Derudover er afgørende lille skadeligt volumen i de forbindende rør for at undgå indfangning af CTCs i de forbindende rør. Silastic Tilslutningsroerene leveret med standard PPFC har en bred indvendig diameter (0,16 in.) Tværtimod BioFlux microfluidics system giver fuld synsfelt under 20X objektiv og er nyttig i at studere shear-inducerede ændringer i ECS ¹⁴ dog kræftceller begynder at slå sig ned i kammeret brønde fører til uensartet flow. BioFlux mikrofluidik er nyttig i at studere shear-inducerede forandringer i EC'er, men det er teknisk besværligt at bruge. Vores selv-samlet flowkammer hjælp mikroobjektglas har en smal kanal bredde (1 mm) end den standard kanal bredde i PPFC, hvilket giver mere observationnale område. Desuden er ECs dyrket under perfusion i mikroobjektglas simulerer fysiologisk blodgennemstrømning, i modsætning Ganguly et al. ^7, undersøgelser, hvor ECS dyrkes på microslides (med bredere kanal bredde) i statiske forhold. Dødvolumenet inde forbindelsesrørene reduceres ved hjælp af et rør med indvendig diameter på 0,02 i. Kollektivt, immunofluorescent mærkning af prostata tumorceller korrekt strømningskanal bredde og mindre indvendige diameter af de forbindende rør gør det muligt at identificere prostata CTCs og observere deres interaktion med ECS.

Der er kun få kritiske trin i protokollen, men med ordentlig pleje forsøgene kan køre problemfrit. Forebyggelse af bobler er afgørende for enhver flow-baserede eksperimenter. Det er vores erfaring, ved hjælp af varm (37 ° C) vækstmedium, stik, og sprøjte forhindrer dannelsen af ​​bobler ved at reducere temperaturforskellene. I Addition, bør der udvises forsigtighed, mens du tilslutter sprøjten med mikroobjektglas. Både konnektoren fastgjort til sprøjten, og indløbet af mikroobjektglasset skal fyldes til randen dermed forhindre enhver bobledannelse. En af begrænsningerne ved teknikken er, at eftersom mikroobjektglas kanal 45 x 1 mm (længde x bredde), kan det kun holde 4,5 pi vækstmedium. Derfor kan mikroobjektglas ikke anvendes til statisk kultur og kræver løbende perfusion af vækstmedium for at forhindre forsuring og opretholde en ordentlig forsyning af næringsstoffer til HUVEC'er. Imidlertid kan konstant forsyning af medium nemt opnås ved hjælp af en sprøjtepumpe tilsluttet mikroobjektglas i inkubatoren. Mens berige CTCs fra patienter med prostatakræft, der skal sørges for at pre-coat alle rørene, tips, pipetter og sprøjter, der kommer i kontakt med CTCs med R / S buffer for at forhindre ikke-specifik binding. Desuden er alle de skridt efter ficoll-paque densitetscentrifugering except J591-488-antistof inkubation bør gennemføres ved 4 ° C for at forhindre nedbrydningen af ​​CTCs.

Vor teknik er unik i forhold til forskellige metoder forståelse CTC biologi. Nærværende rapport beskriver levedygtig fluorescerende immunolabeling af prostata CTCs som gør det muligt at overholde de funktionelle egenskaber af prostata CTCs, udover blot de fænotypiske egenskaber. Desuden beskrevne fremgangsmåde kræver lav prøve / reagensvolumen end andre metoder gør det til et ideelt system til immunofluorescens studier. Vores metode giver en unik platform til at studere samspillet mellem prostata CTCs afledt fra patienter og ECS ​​dermed hjælpe med at forstå de mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​prostatakræft metastaser. Denne teknik har potentiale for flere applikationer, der involverer shear flow baserede studier, såsom celle-celle interaktioner ^8, celle-protein interaktioner ¹⁵ 16 og shear-inducerede ændringer i EC'er ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02